CC BY
85
УДК 577.15
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2006, вып. 3
А. В. Разыграев, А. В. Арутюнян
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В МИКРОСТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС, ОСНОВАННЫЙ НА РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ КИНУРАМИНА
Моноаминэргическая регуляция функциональной активности мозга является постоянным предметом многочисленных исследований. При этом зачастую в задачи исследования входит оценка интенсивности нейромедиаторного обмена, в связи с чем проводится количественное определение нейромедиаторов, их предшественников и метаболитов. В то же время для изучения интенсивности метаболизма моноаминов в нервной системе очень важной является оценка мо-ноаминоксидазной активности, причем все чаще требуется использование методов, позволяющих работать с отдельными микроанатомическими образованиями.
Моноаминоксидазы (МАО) представляют собой группу широко распространенных ферментов, осуществляющих реакции окислительного дезаминирования соединений аминной структуры:
К-СН2-ЫН2 + 02 + Н20 -»11-СНО + Ш3 + н2о2.
К настоящему времени разработано большое количество методов определения моноами-ноксидазной активности, основанных на оценке изменений в концентрациях как субстратов реакции, так и образующихся продуктов [1]. Однако в большинстве случаев методы либо довольно сложны для воспроизведения, либо не позволяют непрерывно регистрировать скорость реакции, что важно для корректной оценки ферментативной активности. В данной работе представлено описание простого метода определения моноаминоксидазной активности с использованием кинурамина в качестве субстрата. В основе метода лежит измерение скорости образования продукта реакции. Прототипом данного способа является метод с использованием кинурамина, описанный в работе [6], в котором регистрируется убыль в концентрации данного субстрата при 360 нм. В работе [6] также обращается внимание на возможность определения активности МАО по величине прироста содержания продукта. Настоящая работа посвящена развитию этого подхода и его адаптации для определения активности МАО в микроструктурах головного мозга.
Материалы и методы. Разработка метода выполнена на крысах линии Вистар из питомника «Рапполово» РАМН. Животные содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч темноты) и получали стандартный корм и воду.
Выделение и предварительная обработка микроструктур. Микроанатомические структуры выделяли из мозга декапитированных животных, охлажденного в жидком азоте (участки, соответствующие маммилярному телу, медиальной преоптической области, срединному возвышению и паравентрикулярным ядрам гипоталамуса). Ткань гомогенизировали в 0,32 М растворе сахарозы, приготовленном на 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,8. Для проведения ферментативной реакции использовался супернатант, полученный в результате центрифугирования гомоге-натов при 1000 g в течение 10 мин.
Определение моноаминоксидазной активности. Метод основан на измерении прироста концентрации 4-гидроксихинолина, образующегося в результате спонтанной внутримолекулярной циклизации промежуточного продукта окислительного дезаминирования кинурамина [6]. 4-гидроксихинолин имеет два максимума поглощения при длинах волн 315 и 327 нм (рис. 1). В настоящем методе прирост концентрации данного продукта регистрируется при 327 нм.
* О А. В. Разыграев, А. В. Арутюнян, 2006
сю
Рис. 1. Спектры растворов кинурамина и 4-гидроксихинолина (0,05 М фосфатный буфер, pH 7,8).
По оси абсцисс - длина волны (X); по оси ординат - единицы оптической плотности (00) (то же для рис. 4). К - спектр 190 мкМ раствора кинурамина; 4-Н£) - спектр 190 мкМ раствора 4-гидроксихинолина; 4-Н£)+К - спектр эквимолярного раствора 4-гидроксихинолина и кинурамина (190 мкМ).
Реакционная среда представляет собой раствор кинурамина в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,8. Конечная концентрация кинурамина - 0,19 мМ, которая, согласно литературным данным, обеспечивает насыщение субстратом изоформ моноаминоксидазы МАО-А и МАО-В [2-4]. Реакция проводилась в специальных кюветах объемом 1 мл с длиной оптического пути 1 см. К 730-750 мкл раствора кинурамина (0,192-0,198 мМ) добавляли супернатант гомогената ткани до объема 760 мкл (конечная концентрация белка 16-375 мкг / мл) и тщательно перемешивали. В холостую пробу вместо биологического материала вносили раствор сахарозы в фосфатном буфере, использовавшийся для приготовления гомогенатов. Инкубацию проводили при 37 °С, периодически измеряя оптическую плотность при 327 нм, тщательно перемешивая пробы перед измерением. Периодические измерения позволяли судить о постоянстве скорости ферментативной реакции (рис. 2). Кроме того, исследовалась зависимость скорости прироста оптической плотности от содержания биологического материала в реакционной смеси (рис. 3).
Содержание белка определяли в реакционной среде после окончания инкубации по методу, описанному в работе [5], регистрируя оптическую плотность при 500 нм вместо 340 нм во избежание влияния присутствия кинурамина при более коротких длинах волн.
Результаты и обсуждение. В результате периодических измерений прироста оптической плотности (ДОО) при 327 нм была обнаружена линейная зависимость величины АОБ от времени инкубации (см. рис. 2). Линейный характер зависимости сохранялся в течение более чем 1,5 ч инкубации при 37 °С (установлено для ткани маммилярного тела гипоталамуса при концентрации белка 132 мкг / мл реакционной смеси). Также выявлена линейная зависимость ДОЭ в единицу времени от содержания белка в реакционной смеси, сохраняющаяся вплоть до значения .концентрации белка, равного 264 мкг / мл в случае ткани маммилярного тела (см. рис. 3).
ДОО
г,ч
Рис. 2. Зависимость величины прироста оптической плотности при 327 нм от длительности инкубации при окислении кинурамина в присутствии МАО.
По оси абсцисс - время инкубации (О (то же для рис. 4); по оси ординат - прирост оптической плотности (ДОО). (М ± 50; п - 3).
ДОО90'
Рис. 3. Зависимость прироста оптической плотности при 327 нм от содержания белка в реакционной смеси.
По оси абсцисс - содержание белка (С); по оси ординат - прирост оптической плотности за 90 мин инкубации (ДОО90 ). (М± 50; п = 3).
Исходя из полученных данных, длительность инкубации 90 мин при 37 °С следует считать оптимальной. Оптимальное содержание биологического материала для разных анатомических структур может различаться. Линейная зависимость скорости реакции сохраняется при достаточно высоких концентрациях белка, однако высокая плотность среды при этом может сильно затруднять регистрацию хода реакции.
Результаты определения активности МАО при использовании данного подхода с оценкой прироста концентрации продукта можно выражать как убыль субстрата, т. е. кинурамина, за единицу времени, отнесенную к содержанию белка. Для этого следует применять соотношение между приростом оптической плотности при. 327 нм и одновременной убылью при 360 нм (ДОО327/ДОВ360), отражающее отношение между увеличением концентрации продукта и сопряженным с ним снижением концентрации субстрата. Данное соотношение ДОО327/ДОО360 составило 1,88. Также, исходя из обнаруженного соотношения и стехиометрии реакции, следует, что прирост оптической плотности при 327 нм происходит более выраженно, чем ее снижение при 360 нм, что указывает на преимущество использования настоящего подхода (рис. 4).
00
Рис. 4. Динамика изменений оптической плотности реакционной смеси в ходе инкубации в присутствии МАО при 327 и 360 нм.
Отношение скорости прироста ОО при 327 нм к скорости убыли ОБ при 360 нм выражается в виде частного коэффициентов соответствующих линейных функций 0,0064 / 0,0034 = 1,88. 1 - рост оптической плотности при 327 нм; 2 - убыль оптической плотности при 360 нм.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о пригодности предлагаемых значений параметров метода для оценки моноаминоксидазной активности в микрообразцах ткани головного мозга крыс. Для изучения ферментативной активности в других тканях целесообразна предварительная аналогичная проверка пригодности предлагаемых значений параметров.
К преимуществам данного подхода также следует отнести явную простоту воспроизведения, возможность непрерывной регистрации хода реакции, что в каждом случае позволяет убедиться в постоянстве скорости процесса, и пригодность для работы с микроанатомическими структурами. Среди преимуществ следует также отметить возможность определения содержания белка в той же реакционной среде по методу из работы [5] и, соответственно, уменьшения расхода биологического материала для определения удельной ферментативной активности.
Реакция окислительного дезаминирования кинурамина, лежащая в основе настоящего метода, не является специфичной по отношению к отдельным изоферментам моноаминоксида-зы. Активность отдельных изоформ исследуемого фермента, так же как в других методах определения моноаминоксидазной активности с применением кинурамина, следует выявлять с использованием специфических ингибиторов [4].
Summary
Razygraev А. V., Arutjunyan А. V. A spectrophotometric method for the determination of monoamine oxidase activity in the rat brain microstructures based on the kynuramine oxidation
The method is based on the monitoring of 4-hydroxiquinoline formation due to oxidation of kynuramine. The wavelength used in this method is 327 nm. The reaction medium (0.76 ml) consists of 0,05 M phosphate buffer, pH 7,8, 0,19 mM kynuramine and rat brain tissue extract containing mitochondria, possessing monoamine oxidase activity. The reaction is performed at 37 °C with use of spectrophotometric cuvettes with shaking immediately prior to each measurement of optical density The incubation time 1,5 h is found to be optimal. The method allows to continuously observe the reaction rate and is convenient to handle brain microstructures.
Литература
1. Горкин В. 3. Аминоксидазы и их значение в медицине. М., 1981. 2. Grandi Т., Sparatore F. Monoamine oxidase inhibitory properties of some benzazoles: structure-activity relationships // AAPS Pharmsci. 1999. Vol. 1, N. 4. Art. 16. P. 1-4. 3. Lee М. K., Hwang B. Y., Lee S. A., Oh G.J., Choi W. H., HongS. S., Lee K. S., RoJ. S. l-Methyl-2-undecyl-4(lH)-quinolone as an irreversible and selective inhibitor of type В monoamine oxidase // Chem. Pharm. Bull. 2003. Vol. 51, N. 4. P. 409-411. 4. Lee S. S., Lee J.J., Cheong M.J., Kim Y. H., Kim Y., Yun Y. P., Lee С. K,, Lee М. K. Inhibitory effects of ethaverine, a homologue of papaverine, on monoamine oxidase activity in mouse brain // Biol. Pharm Bull. 2001. Vol. 24, N. 7. P. 838-840. 5. Vera J. C. Measurement of microgram quantities of protein by a generally applicable turbidimetric procedure // Analyt. Biochem. 1988. Vol.174. P. 187— 196. 6. Weissbach II., Smith E., Daly J. W., Witkop B., Udenfriend S. A rapid spectrophotometric assay of monoamine oxidase based on the rate of disappearance of kynuramine //J. Biol. Chem. 1960. Vol. 235, N. 4. P. 1160-1163.
Статья поступила в редакцию 15 мая 2006 г.
