CC BY
142
УДК 579.912:636.52/ 58.084.542
СПЕКТРАЛЬНЫЙ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КСАНТОФИЛЛОВ В РАЗЛИЧНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ДОБАВКАХ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА НАКОПЛЕНИЕ ЛЮТЕИНА И ЗЕАКСАНТИНА В ЖЕЛТКЕ ПЕРЕПЕЛИНЫХ ЯИЦ
В. И. Дейнека, А. А. Шапошников Л. А. Дейнека, С. М. Вострикова Л. Р. Закирова, И. Е. Олейникова
Белгородский государственный университет,
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85
E-mail: Shaposhnikov@bsu.еdu.ru
Приведены результаты спектрального и хроматографического анализа различных растительных ксантофиллов. Обсуждены экспериментальные данные накопления ксантофиллов в желтке перепелиных яиц под влиянием растительных добавок.
Ключевые слова: ксантофиллы, лютеин, зеаксантин, кормовые добавки, желток перепелиных яиц.
Введение
Человек и животные не могут синтезировать каротиноиды, их поступление зависит только от источников питания. Человек усваивает каротиноиды не избирательно, они откладываются в тканях и органах примерно в том же соотношении, в каком содержатся в пище. Необходимая норма ежедневного потребления лютеина составляет 8ОО-1000 мкг, а зеаксантина — около 200 мкг. При этом в лечебных и профилактических целях необходимо чтобы соотношение лютеина и зеаксантина в продуктах питания, было близким к 4:1, поскольку совместное действие этих двух пигментов при таком соотношении наиболее эффективно. Для человека биодоступность лютеина и зеаксантина, содержащихся в желтке яиц, значительно выше их биодоступности из растительных источников, благодаря ассоциации с липидным матриксом желтка. Т.к. ксантофиллы липофильны их биодоступность выше в присутствие жиров (липидов). Отметим, что по последним данным [1] необходимо выделить не два, а три ксантофилла:
1) лютеин, который в природе встречается главным образом в виде изомера: 3^’,3'^’,6'^-^,е-каротин-3,3'-диола;
2) зеаксантин, под которым понимают один из возможных стероизомеров -3£’,3'£’,-вв-каротин-3,3'-диол;
3) еще один, особо выделяемый из изомеров, — мезо-зеаксантин — 3R,3' R,-P,fi-каротин-3,3'-диол.
В последнее время в развитых странах мира ведутся интенсивные исследования по разработке способов получения продуктов питания с заданными свойствами. Это направление получило название «Food Design» («пищевой дизайн») и полученные по нему продукты пользуются повышенным спросом у населения. Ведь необходимые человеку биологически активные вещества — провитамины, витамины, микроэлементы и т.д., находясь в составе мясных и молочных продуктов, а также яиц птицы, имеют неоспоримые преимущества перед препаратами химического и биотехнологического синтеза.
Яйцо является одним из доминантных продуктов в питании населения, поэтому производители уделяют большое внимание качеству данной продукции. Но такой показатель, как окраска желтка яиц, оставляет желать лучшего. Это связано с недостатком в кормовом рационе каротиноидов, обеспечивающих желаемый цвет желтка (лютеина и зеаксантина). Наличие каротиноидов в корме определяет их уровень в яйце.
В странах Западной Европы и США выпускается несколько кормовых добавок, предназначенных для улучшения цвета желтка. Некоторые из них содержат ксанто-
филлы растительного происхождения, так как известно, что эти вещества в организме птицы не синтезируются.
В России собственные кормовые добавки аналогичного типа не производятся, поэтому разработки с целью создания собственных технологий актуальны, особенно в свете современных установок на замену импортных медицинских препаратов и на возрождение отечественной медицинской и фармацевтической промышленности.
Разработанная нами добавка отличается от известных импортных кормовых добавок сбалансированностью по соотношению лютеина и зеаксантина (оно составляет 4:1). Известные импортные добавки, полученные из лепестков цветков бархатцев, содержат зеаксантин в значительно меньшем количестве по сравнению с оптимальным.
По последним литературным данным лютеин является источником зеаксантина и может превращаться в него в организме животных [2]. Это удивительно, поскольку в США для преодоления этого дисбаланса проведены работы по получению мутантов бархатцев с увеличенным содержанием зеаксантина, но дальше патента [3, 4] дело не пошло. Возможно, что причиной этого является появление в печати сведений о том, что зеаксантин в организме животных и человека может быть получен изомеризацией лютеина. Эта информация также ставит под сомнение целесообразность применения нашей добавки в качестве источника лютеина и зеаксантина.
Для проверки этой информации мы провели исследование на перепелках-несушках породы «Фараон». Исследования выполняли в частном фермерском хозяйстве Белгородской области в с. Нижний Ольшанец Шебекинского района.
Добавки ксантофиллов в корм перепелок. Для проверки усвояемости ксантофиллов из растительных материалов нами были подготовлены индивидуализированные биологически активные добавки.
Добавка А (размолотые высушенные лепестки цветков бархатцев), по спектрофотометрическим данным содержавшие 12.5 ± 1.5 мг ксантофиллов на 1 г добавки (в пересчете на неэтерифицированный лютеин).
Для приготовления добавок были использованы цветки бархатцев, выращенные в 2009 году и высушенные при комнатной температуре в течение 7 дней без доступа света. Полученный материал измельчали в кофемолке.
Спектр экстракта представлен на рис.1 и соответствует литературным данным по положению максимумов абсорбции при записи в растворе в ацетоне.
На хроматограмме в условиях обраще-но-фазовой ВЭЖХ, рис.2, обнаруживаются 7 основных пиков, соответствующих диэфирам полностью транс-лютеина: дистеарата
(время удерживания порядка 12.5 мин.), стеарат-пальмитата (10.8 мин.), дипальмита-та (9.2 мин.), пальмитата-миристата (8 мин.), ди-миристата (7 мин.), мири-стата-лаурата (6.2 мин) и дилаурата (5.5 мин.). Кроме того, на хроматограмме видны в небольшом количестве моноэфиры (3.5—4.5 мин.) лютеина, эфиры геометрических изомеров лютеина, не разделяемые с небольшим количеством примесей эфиров зеаксан-тина (в сумме не более 8%).
mV
200
Рис. 2. Разделение ксантофиллов экстракта цветков бархатцев
Колонка: 250? 4 мм Диасфер-110-С18, 5 мкм. Подвижная фаза: 8 % ацетонитрила в ацетоне, 1 мл/мин. Детектор: УФ-вид: 445 нм.
Добавка Б (размолотые высушенные чашечки физалиса декоративного), по спектрофотометрическим данным (спектр представлен на рис. 3) содержавшие 9.0±0.3 мг ксантофиллов на 1 г добавки (в пересчете на неэте-рифицированный зеаксантин).
Спектр экстракта,
представленый на рис. 4, соответствует литературным данным для зеаксан-тина по положению максимумов абсорбции при записи в растворе в ацетоне.
Колонка: 250? 4 мм Диасфер-110-С18, 5 мкм.
Подвижная фаза: 8 % ацетонитрила в ацетоне, 1 мл/мин. Детектор: УФ-вид: 445 нм.
Добавка В (размолотые высушенные лепестки подсолнечника), по спектрофотометрическим и хроматографическим данным содержавшие эпокси ксантофиллы, которые обнаруживаются по посинению желтых пятен на ТСХ-пластине в атмосфере HCl. Спектр экстракта подтверждает наличие эпокси соединений — по смещению максимумов абсорбции на рис. 5 в коротковолновую область вследствие сокращения цепи сопряжения. Содержание ксантофиллов в пересчете на лютеин составили 2.1±0.3 мг ксантофиллов на 1 г добавки.
Добавка Г - препарат ОРО ГЛО (Кемин Европа) [5]. По спектральным данным (рис. 6) и по хроматографическим данным этот препарат содержит в основном неэтерифицированный полностью транс-лютеин.
Рис. 4. Разделение ксантофиллов экстракта чашечек физалиса
Материалы и методы
Перепелки были разделены на 5 групп по 28 особей: по 21 самке и по 7 самцов.
Все пять групп получали один и тот же тот же корм в течение адаптационного периода (10 дней). Затем первую группу оставили в качестве контрольной, вторая получала корм с добавлением добавки А, третья — с добавкой Б, третья с добавкой В, четвертая — с добавкой Г и пятая — с добавкой Д. Добавки вводили в количестве, обеспечивавшем поступление
0.1 мг ксантофиллов в сутки на 1 перепелку.
Каротиноиды желтка яиц определяли спектрофотометрическим методом (спектрофотометр КФК-3-01), и хроматографическим методами. В налале желток отделяли от белка и тщательно гомогенизировали. Брали навеску желтка на аналитических весах (с точностью до 0.0001 г) в диапазоне 0.50-1.00±0.250 г, заливали 10 мл растворителя — ацетона (так как он позволяет быстро и количественно извлекать пигменты из желтка) и выдерживали несколько минут при постоянном перемешивании. Полученную смесь фильтровали через фильтр Шотта.
Спектрофотометрические измерения проводили относительно растворителя в кварцевых кюветах (I = 1 см) при Amax = 440-445 нм. Суммарное содержание кароти-ноидов (в пересчете на лютеин) определяли, используя EfCM = 2550 [6].
Для исследования соотношения лютеина и зеаксантина использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Присутствие высоко липо-фильных соединений контролировали записью хроматограмм образцов, использованных для спектрофотометрического определения в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ: колонка 250? 4 мм Диасфер-110-С18 (или аналогичная фаза), элюент 100% ацетон, детектор 450 нм. Неэтерифицированные ксантофиллы удобно определять в условиях нормально-фазовой ВЭЖХ - колонка 250? 4 мм Силасорб 600, элюент 30 об. % ацетона в н-гексане, детектор 450 нм.
Результаты и обсуждение
В эксперименте в качестве отправной точки для контроля влияния подкормок использовали данные по содержанию ксантофиллов в желтке яиц в течение адапта-
Длина ВОЛНЫ
Рис. 5. Спектр ацетонового экстракта лепестков подсолнечника
Рис. 6. Спектр ацетонового экстракта препарата ОРО ГЛО
ционного периода. Количественное определение ксантофиллов проводили в пересчете на лютеин для оценки суммарного уровня накопления. Спектры, представленные на рис. 7, свидетельствуют о том, что во всех четырех случаях — с добавками А, В и Г (последний не указан на рисунке) основной компонент — лютеин. Небольшое смещение максимума для образцов с подкормкой Б неудивительно — зексантин имеет большую цепь сопряжения с большей длиной волны максимума поглощения. Однако определение соотношения зеаксантин — лютеин в данном случае практически невозможно только по спектрофотометрическим данным.
В целом накопление ксантофиллов, как и при кормлении кур [5, 7, 8], увеличивается при использовании подкормок А, Б и Г и практически не изменяется в случае подкормки В. Следовательно, в организме ферментов, отвечающих за деэпоксидиро-
вание, нет. Поэтому, к сожалению, растения, накапливающие эпокси-
каротиноиды не эффективны в кормлении животных для увеличения накопления ксантофиллов. С другой стороны, добавки и диэфиров и неэтерифици-рованных ксантофиллов примерно одинаково эффективны, т.е. этерифика-ция не сказывается на биодоступности ксантофиллов, что соответствует литературным данным. Некоторый относительно больший рост усвоения ксантофиллов бархатцев может свидетельствовать об особенностях целлюлозной матрицы, в которой оказываются заключенными каротиноиды хромопластов после высушивания материала.
Действительно, при определении ксантофиллов в высушенных исходных материалах для полной экстракции необходимо дополнительное тщательное измельчение уже размолотых лепестков с кварцевым песком до оптической гомогенности порошка. Впрочем, эта прочность связывания и отвечает за Рис. 8. Изменение накопления ксантофиллов в желтке неожиданно высокую сопри использовании индивидуализированных добавок хранность каротиноидов в
использованных материалах при хранении.
Рис. 7. Спектр ацетонового экстракта желтков перепелиных яиц
Дополнительная необходимая информация была получена при хроматографическом исследовании тех же образцов желтка, рис. 9.
Метод нормально-фазовой хроматографии с использованием колонки 250? 4.6 мм Силасорб 600, 5 мкм и подвижной фазы, содержащей 30 об.% ацетона в н-гексане. Анализ хроматограмм показал, что в случаях А, В и Г а также в контрольном опыте хроматограммы различались только интенсивность (площадью) пиков при неизменном соотношении между лютеином и зеаксантином (в диапазоне 1 : (5? 7), но ко второй неделе получено очень большое различие для образцов, полученных с использованием добавки Б: доля зеаксантина в желтке таких яиц даже немногим превышает долю лютеина (46 против 36 %, соответственно).
Полученные нами данные говорят о том, что если превращение лютеина в зеаксантин и происходит, то очень медленно и в незначительных количествах. Т.о. создание сбалансированной по содержанию лютеина и зеаксантина добавки является оправданным направлением пищевого дизайна.
Выводы
1. Накопление ксантофиллов не зависит от формы ксантофилла — эфирной или нативной.
2. Индивидуализированные добавки в корм птицы приводят к увеличению накопления лютеина и зеаксантина, но не эпокси-ксантофиллов.
__________ Рис. 9. Разделение ксанто-
0 ' 5 мин филлов желтка яиц
перепелок
mV
Список литературы
1. Thurnham D.I. Macular zeaxanthins and lutein - a review of dietary sources and bioavailability and some relationships with macular pigment optical density and age-related macular disease // Nutr. Res. Rev. - 2007. - Vol.20. - P. 163-179.
2. Bone R.A., Landrum J.T., Friedes L.M., Gomez C.M., Kilburn M.D., Menedez E., Vidal I., Wang W. Distribution of Lutein and Zeaxanthin Stereoisomers in the Human Retina // Exper. Eye Res. - 1997. - Vol. 64. - P. 211-218.
3. European Patent Application EP1408737 - Tagetes erecta marigold with altered carotenoids compositions and ratios.
4. US Patent 7033622 - Tagetes erecta marigolds with altered carotenoid compositions and ratios.
5. Владимиров В.Л., Шапошников А.А., Дейнека Д.В., Вострикова С.И., Дейнека В.И. Исследование каротиноидного состава желтка куриных яиц. // Доклады РАСХН. - 2005. -№6. - С. 46-48.
6. Rodrigues-Amaya D.B./ A Guide to Carotenoid Analysis in Foods. ILSI Press, Washington, D.C. 63 p.
7. Дейнека Л.А., Шапошников А.А., Шаркунова Н.А., Гусева Т.С., Дейнека В.И., Гай И.Е. Пищевой дизайн: целенаправленное изменение накопления ксантофиллов в желтке куриных яиц. // Белгородский агромир. - 2006. - № 6. - С. 18-19.
8. Дейнека Л.А., Шапошников А.А., Вострикова С.М., Дейнека В.И. Пищевой дизайн: Исследование накопления ксантофиллов в желтке куриных яиц // Научные ведомости БелГУ. Серия Естественные науки. - 2007. - №5 (36), вып.5. - С. 133-138.
SPECTRAL AND CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF XANTHOPHYLLS IN VARIOUS PLANT ADDITIONS AND THEIR INFLUENCE ON LUTEIN AND ZEAXANTHIN ACCUMULATION
IN A QUAILS YOLKS
V. I. Deineka, A. A. Shaposhnikov L. A. Deineka, S. M. Vostrikova L. R. Zakirova , I. Y. Oleynikova
Belgorod State University, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia
E-mail: Shaposhnikov@bsu. edu. ru
E-mail: Pisarev@bsu.edu.ru
The results of spectral and chromatographic analysis of various plant xanthophylls are presented in this article. There have been discussed experimental data of xanthophylls accumula-85, tion in a quail's vitellus under the influence of plant additions.
Key words: xanthophylls, lutein, zeaxanthin, food additions, a quail's eggs.
