CC BY
38
КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИЕ РАСЧЕТЫ
УДК 544.032.76
СПЕКТР ПОГЛОЩЕНИЯ NADH КАК СУПЕРПОЗИЦИЯ СПЕКТРОВ АДЕНИНА И НИКОТИНАМИДА
АНИКЕЕВ Б.В.|, ЗАТРУДИНА Р.Ш., КОНЬКОВА Е.П.
Волгоградский государственный университет, 400062, г. Волгоград, пр. Университетский, 100
АННОТАЦИЯ. Экспериментально и путем строгих квантово-химических расчетов исследованы водные растворы спектрально значимых локальных фрагментов никотинамидадениндинуклеотида, аденина и никотинамида. Показано, что электронный спектр поглощения бихромофора NADH может быть аппроксимирован суперпозицией электронных спектров поглощения аденина (в области 260 нм) и модифицированного никотинамида (в области 340 нм). Электронный спектр изолированного бихромофора NADH рассчитан в неэмпирическом приближении. Электронные спектры сольватированных фрагментов рассчитаны в полуэмпирическом приближении.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: NADH, аденин, никотинамид, фрагмент, растворитель, квантово-химические методы.
ВВЕДЕНИЕ
Реакция, в результате которой NAD переходит в восстановленную форму, является заключительной в цикле Кребса, представляющем собой совокупность последовательных ферментативных реакций, с помощью которых вырабатывается основная часть энергии, необходимой для жизнедеятельности клетки [1]. Максимумы флуоресценции NAD и его восстановленной формы NADH лежат в одной спектральной области, однако квантовый выход флуоресценции NADH существенно выше, поэтому и вклад NADH в спектр автофлуоресценции биотканей существенно больше.
Любые изменения в клеточном метаболизме могут быть выявлены из динамики соотношения спектральных компонент дыхательной цепи NADH и FAD. Так, на основе метода количественной оценки степени дыхательной активности митохондрий, авторами [2] была оценена активность энергетического обмена в тканях слизистой оболочки желудка по мере развития патологии. Было установлено, что развитие процесса дисплазии (предраковый период) сопровождается снижением вклада флуоресценции FAD и увеличением вклада NADH в суммарный спектр. Подобный эффект свидетельствует об угнетении клеточного дыхания и развитии процесса истощения терминального окисления, неизбежно сопровождающего воспалительный процесс.
Витамин В5, чаще называемый витамином РР (от англ. pellagra preventing factor -антипелларгический фактор), химически представляет собой два вещества, обладающих одинаковой витаминной активностью: никотиновую кислоту и никотинамид. Никотиновая кислота и ее амид стали известны еще в прошлом веке в связи с исследованиями никотина. Однако связь тяжелого заболевания - пеллагры с недостатком в диете витамина РР была установлена позднее. Постоянный интерес к спектрам аденина связан со спектральными исследованиями входящих в молекулы ДНК и РНК пуриновых и пиримидиновых оснований.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В состав никотинамидадениндинуклеотида входят аденин, никотинамид, дезоксирибоза и остаток фосфорной кислоты [3]. В качестве спектрально значимых локальных фрагментов в данной работе рассматриваются аденин и никотинамид [4, 5]. Структурная формула модели бихромофора NADH приведена на рис. 1. Выделены спектрально значимые фрагменты, аденин и модифицированный никотинамид.
Рис. 1. Структурная формула модели бихромофора NADH с выделенными спектрально значимыми
фрагментами, аденином (верхний) и модифицированным никотинамидом (нижний)
Приготовление растворов никотиамида и аденина осуществлялось путем последовательного разведения. В результате растворения 10 мг никотинамида в 10 мл дистиллированной воды был получен раствор с концентрацией 0,1 %. К 1 мл раствора с концентрацией 0,1 % было добавлено 10 мл воды и получено 11 мл раствора с концентрацией 0,01 %. Затем к 1 мл раствора с концентрацией 0,01 % было добавлено 2 мл воды и получено 3 мл раствора с концентрацией 0,003 %. Путем растворения 0,5 мг аденина в 10 мл дистиллированной воды был получен раствор с концентрацией 5-10"5 %. К 1 мл раствора с концентрацией 5-10"5 % было добавлено 3, 6 и 10 мл воды, таким образом, было получено 11 мл с концентрацией 5-10"6 %.
Экспериментальные данные по пропусканию растворов никотинамида и аденина были получены с использованием двухканального автоматизированного спектрального комплекса на базе монохроматора МДР-23. Источником излучения являлась дейтериевая лампа, излучавшая в УФ-области. Приемником служил фотоэлектронный умножитель с диапазоном измерений 200 - 800 нм. Перестройка длины волны осуществлялась с шагом 0,1 нм и точностью 0,05 нм. Обратная дисперсия решетки имела значение 1,3 нм/мм. Ширина щели составляла 0,4 мм.
Компьютерное моделирование периодических граничных условий соответствовало непрерывным с постоянной плотностью макроскопическим условиям физического эксперимента. Фрагмент бихромофора N^0^ модифицированный никотинамид, в окружении 23 молекул воды приведен на рис. 2. Поскольку молекулы растворителя содержали небольшое число атомов, для описания взаимодействия растворенного соединения с растворителем был использован дискретный подход, т. е. рассматривались дискретные системы, содержавшие порядка 20 молекул воды [6].
Неэмпирическое (ССП/3-21ГФ)
приближение было использовано при расчете электронного спектра поглощения модели изолированного бихромофора NADH и тестирования по этим данным результатов расчета электронных спектров поглощения его спектрально-значимых локальных фрагментов, аденина и модифицированного никотинамида, полученных в полуэмпирическом (ЧПДП) приближении [7]. После того, как было установлено их приемлемое согласие, полуэмпирическое приближение применялось при расчете электронных спектров поглощения фрагментов в водном окружении. Элементы теории пофрагментного расчета многоатомных молекул изложены в работах [8, 9]. В работе [10] пофрагментный метод улучшен за счет одновременного учета эффектов локализации и делокализации фрагментных электронных состояний. Поскольку, наиболее ценной является информация именно о происхождении спектральных линий, использованное сочетание полуэмпирического и
Рис. 2. Фрагмент бихромофора NADH, модифицированный никотинамид, в окружении 23 молекул воды
неэмпирического приближений при квантово-химическом исследовании крупных молекулярных систем в водном окружении представляется наиболее разумным.
Минимизация энергии молекулярных систем за счет изменения пространственного расположения атомов друг относительно друга осуществлялась методом РМ3. Таким образом, были найдены ближайшие локальные минимумы на ППЭ. Полученным геометриям отвечал набор действительных частот нормальных колебаний. Вероятность нахождения более глубоких энергетических минимумов на ППЭ сольватированных фрагментов бихромофора повышало использование метода молекулярной динамики (минимизация по алгоритму Ро1ак-ШЫеге). Изолированные фрагменты имели оптимальные стартовые геометрии, следовательно, происходящие в ходе оптимизации геометрии сольватированных фрагментов изменения были обусловлены действием растворителя. Использовалось приближение Т1Р3Р модели молекул воды. Ускорение сходимости не применялось. Для расчета электронных спектров сольватированных фрагментов использовался метод ZINDO/S, специально параметризованный для имитации л^л*-переходов [6]. Электронная корреляция была учтена вычислением конфигурационного взаимодействия (С1).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В процессе развития патологии в биоткани меняется относительное содержание эндогенных флуорофоров, что проявляется в качественном и количественном изменениях спектра флуоресценции биоткани. Работа [2] посвящена исследованию флуоресценции слизистой оболочки желудка. Рассматривались ранние стадии заболевания (поверхностный гастрит), предраковый период, именуемый дисплазия (хронический атрофический гастрит и полипоз желудка) и начальные стадии раковых поражений желудка. С целью проведения количественного анализа и выявления динамики соотношения вкладов составных компонент свечения в суммарный спектр по мере развития поражения было осуществлено разложение полученных спектров методом гауссовых-лоренцевых кривых. Анализ результатов показал, что в процессе развития поражения происходят изменения в соотношениях и вкладах в суммарный спектр, по крайней мере, 7 групп флуорофоров. В качестве одного из основных флуорофоров рассматривался NADH.
Необходимо отметить, что процесс формирования интегрального спектра флуоресценции биоткани носит существенно нелинейный характер, особенно в случае наличия в ткани патологического процесса, сопровождаемого патологическими уровнями накопления в тканях каких-либо природных флуорофоров. В связи с этим вычленение из таких интегральных спектров флуоресценции отдельных спектральных составляющих эндогенных флуорофоров, представляет собой весьма нетривиальную задачу, еще более усложняющуюся с учетом отличий реальных спектров отдельных эндогенных флуорофоров от идеализированных гауссовых спектральных кривых, часто используемых авторами. Кроме того, данные по максимумам и формам спектров флуоресценции многих эндогенных флуорофоров весьма противоречивы. Причиной может быть как разная спектральная чувствительность, передаточная функция и разрешающая способность приборов, используемых разными авторами, так и разное в каждом конкретном случае спектральное искажение спектра флуоресценции, вызванное избирательным поглощением излучения основными хромофорами клеток [11].
С учетом вышесказанного, можно сделать вывод, что практический интерес представляет изучение наиболее характерных спектров флуоресценции, устойчиво воспроизводящиеся на разных приборах для разных пациентов и выделение достоверно информативных спектрально-флуоресцентных характеристик [12]. Так, в работе [13] происхождение пика флуоресценции псориатического эпидермиса вблизи 400 нм исследователи связали с флуоресценцией восстановленной формы никотинамиддинуклеотида (№АОН), содержание которой в псориатическом эпидермисе существенно увеличено. Поскольку, все первичные фотопроцессы протекают с участием основного и первого возбужденного электронных состояний, наибольший интерес
представляет первый синглет-синглетный электронный переход, определяющий флуоресцентные свойства молекулы. В случае кофермента NADH этот переход принадлежит длинноволновой полосе поглощения в области 340 нм.
Никотинамидадениндинуклеотид может находиться в окисленной (NAD) и восстановленной (NADH) формах. Окисленная форма имеет спектр поглощения с максимумом на 260 нм. При переходе в восстановленную форму появляется полоса поглощения с максимумом на 340 нм и способность флуоресцировать. Концентрация кофермента дегидрогеназ никотинамидадениндинуклеотида является важным физиологическим показателем. Отмечается наличие прямых корреляций между увеличением числа нежизнеспособных клеток при фотодинамическом воздействии и снижением внутриклеточных концентраций NADH [1]. Определение концентрации этого кофермента проводится методами флуоресцентной спектроскопии [14]. Поскольку, флуорофором является только восстановленная форма кофермента, в работе рассматривается спектр поглощения именно восстановленной формы (NADH).
f (отн. ед.)
1 i
0,5
201 204
214
225
227
256
291
289 1
336
324
JI (нм)
I —I-Г-
200 220 240 260 280 300 320 340 Рис. 3. Рассчитанный ab initio электронный спектр поглощения модели изолированного бихромофора NADH
f (отн. ед.)
1
0,5
0,5
(а)
202
259
223
257
279
271
201
(б)
272
260
226
257 244
т-1-1-» Л (нм)
200 220 240 260 280 300 320 340 Рис. 4. Рассчитанные в полуэмпирическом приближении электронные спектры поглощения молекулы аденина: а) изолированной; б) в окружении 26 молекул воды
Рассчитанный ab initio электронный спектр поглощения модели изолированного бихромофора NADH приведен на рис. 3. Видно, что полосы поглощения в областях 200, 220, 260 и 340 нм порождаются более чем одним переходом. Поглощение в области 200 нм может быть связано с наличием в структуре молекулы аминогруппы. Карбонильные
соединения поглощают в области 210 - 220 нм. Органические молекулы, имеющие несколько сопряженных двойных связей, поглощают в области 260 нм. Так, молекула аденина характеризуется поглощением [15] на длинах волн 260 и 270 нм. Литературные данные о соотношении сил осцилляторов f этих переходов аденина противоречивы. В некоторых работах соотношение достигает 100 раз. Абсолютное значение первого перехода в подавляющем большинстве случаев колеблется в пределах 0,2 - 0,3 относительных единиц.
Рассчитанные в полуэмпирическом приближении электронные спектры поглощения изолированной молекулы аденина и молекулы аденина в окружении 26 молекул воды приведены на рис. 4. Видно, что абсолютное значение силы осциллятора второго перехода изолированной молекулы аденина и молекулы аденина в растворе значительно отличаются.
Г (отн. ед.)
0,5
(а)
221
209
260
292
0,5
(б)
230
245 I
258 1
290
Вода является естественным растворителем в живом организме. Роль воды в клетках определяется ее химическими и структурными свойствами. Эти свойства связаны с малыми размерами молекул, их полярностью и способностью соединяться друг с другом водородными связями. Из-за симметричного распределения зарядов молекула воды действует как диполь. Дипольный момент обусловливает способность воды активно вступать во взаимодействие с различными веществами. Исследование влияния водородных связей
на спектральные характеристики в различных фазовых состояниях (твердая фаза, водный раствор, изолированная молекула) представляют широкий интерес [16, 17]. Изучение спектрально-люминесцентных характеристик соединений в растворах -источник информации о взаимодействии молекул растворителя и растворенного вещества [18]. Таким образом, на сегодняшний день квантово-химическая теория растворов становится неотъемлемой составной частью химической физики.
Рассчитанные в полуэмпирическом приближении электронные спектры поглощения изолированной молекулы никотин-амида и молекулы никотинамида в окружении 23 молекул воды приведены на рис. 5. Видно, что в присутствии воды наблюдается значительный (~ 10 нм) бато-хромный сдвиг в коротковолновой области.
Экспериментальные зависимости пропускания от длины волны для растворов аденина и никотинамида с концентрациями 510-6 % и 0,003 %, соответственно, приведены на рис. 6.
Из сравнения рисунков 4, 5 и 6 видно, что результаты квантово-химических расчетов и эксперимента хорошо согласуются.
Рассчитанные в полуэмпирическом приближении электронные спектры поглощения фрагмента бихромофора КАОН, модифицированного нико-
тинамида, изолированного и в окружении 23 молекул воды приведены на рис. 7.
Л (нм)
1-1—--1-1-1
200 220 240 260 280 300 320 340 Рис. 5. Рассчитанные в полуэмпирическом приближении электронные спектры поглощения молекулы никотинамида: а) изолированной; б) в окружении 23 молекул воды
100
Т (%)
200
220
240
260
280
300
320
340
Рис. 6. Зависимости пропускания от длины волны для растворов аденина (верхняя) и никотинамида (нижняя) с концентрациями 5-10-6 % и 0,003 %, соответственно
В данном случае обнаруживаются полосы поглощения в областях 220 и 340 нм, полоса поглощения в области 260 нм отсутствует.
f (отн. ед.)
(а)
0,5-
313
212
209
220
352
0,5
(б)
328
218
20^ 234 ,
—I—Ц-«-i-1-1-1-1-г-1-1 Л (нм)
200 220 240 260 280 300 320 340 360
345
Рис. 7. Рассчитанные в полуэмпирическом приближении электронные спектры поглощения
фрагмента бихромофора NADH, модифицированного никотинамида: а) изолированного; б) в окружении 23 молекул воды
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Фундаментальная в химии идея о фрагментарности сложных молекул позволяет использовать принципиально важный в молекулярном моделировании способ формирования моделей сложных молекул из локальных фрагментов, сохраняющих в известной степени свойства исходной молекулы [19]. На первый взгляд в качестве одного из таких спектрально-значимых локальных фрагментов NADH может выступать никотинамид. Однако, в данной работе показано, что для компьютерного моделирования поглощения в области 340 нм структуру никотинамида необходимо модифицировать, разорвав сопряженную углеродную связь с атомом азота, и тем самым, исключить поглощение в области 260 нм. Образовавшуюся при этом свободную валентность атома углерода следует формально заполнить атомом водорода, с целью образования замкнутой молекулярной системы и предотвращения появления в рассчитанном электронном спектре лишних энергетических уровней. Таким образом, электронный спектр поглощения восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида может быть аппроксимирован наложением электронных спектров поглощения аденина, моделирующего поглощение в области 260 нм, и модифицированного никотинамида, модулирующего поглощение в области 340 нм.
Статья посвящается светлой памяти д.ф.-м.н., профессора Аникеева Бориса Васильевича.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Плавский В.Ю., Мостовников В.А., Мостовникова Г.Р. и др. Спектрально-люминесцентные свойства комплексов хлорина е6 и малатдегидрогеназы // Журнал прикладной спектроскопии. 2004. Т.71, №6. С.749-758.
2. Гираев К.М., Ашурбеков НА., Меджидов Р.Т. Стационарная спектроскопия биотканей in vivo: флуоресцентные исследования некоторых патологических состояний // Оптика и спектроскопия. 2003. Т.95, №5. С.874.
3. Калоус В., Павличек З. Биофизическая химия. М. : Мир, 1985. 446 с.
4. Затрудина Р.Ш., Конькова Е.П. Изменение дипольного момента молекулы никотинамида в воде по данным полуэмпирических расчетов // Сборник докладов 20 Междунар. конф. «Лазеры. Измерения. Информация». СПб : Изд-во СПбГПУ, 2010. Т.2. С.132-141.
5. Затрудина Р.Ш., Конькова Е.П., Изменения спектра поглощения никотинамида в водном растворе // Вестник ВолГУ. Сер.1. Математика. Физика. 2010. Вып.13. С.98-101.
6. Бурштейн К.Я., Шорыгин П.П. Квантово-химические расчеты в органической химии и молекулярной спектроскопии. М. : Наука, 1989. 98 с.
7. Грибов Л.А., Баранов В.И., Новосадов Б.К. Методы расчёта электронно-колебательных спектров многоатомных молекул. М. : Наука, 1984. 325 с.
8. Никитин О.Ю., Новосадов Б.К. Теория пофрагментного расчета электронной структуры основного состояния многоатомных молекул. I. Метод промежуточного фрагмента // Журнал структурной химии. 1995. Т.36, №3. С.387-394.
9. Немухин А.В., Колесников И.М., Винокуров В.А. Строение комплекса алюмофенилсилоксана и его фрагментов по данным полуэмпирических и неэмпирических расчетов // Журнал структурной химии. 1995. Т.36, №3. С.410-417.
10. Никитин О.Ю., Новосадов Б.К. Теория пофрагментного расчета электронной структуры основного состояния многоатомных молекул. II. Метод делокализованных фрагментных состояний // Журнал структурной химии. 1995. Т.36, №3. С.395-400.
11. Литвинова К.С., Рогаткин Д.А. Каталог спектральных характеристик основных флуорофоров тканей человека и животных // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010». М. : Изд-во МГУ, 2010. С.141-143.
12. Булгакова Н.Н., Верещагин К.А., Соколов В.В. Изучение особенностей спектров лазер-индуцированной аутофлуоресценции нормального и неоплазированного уротелия // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010». М. : Изд-во МГУ, 2010. С.33-34.
13. Утц С.Р., Синичкин Ю.П., Пилипенко Е.А. In vivo лазерная флуоресцентная спектроскопия кожи человека: влияние эритемы // Оптика и спектроскопия. 1994. Т.76, №5. С.864-868.
14. Левшин Л.В., Салецкий А.М. Люминесценция и ее измерения: Молекулярная люминесценция. М. : Изд-во МГУ, 1989. 272 с.
15. Тен Г.Н., Нечаев В.В., Березин В.И. и др. Расчет электронно-колебательных спектров молекулы аденина // Журнал структурной химии. 1997. Т.38, №2. С.334-344.
16. Султанлы Б.Ю., Шнулин А.Н., Алиев Р.Э. и др. Межмолекулярная водородная связь и структура 1,1-дифенилэтанола // Журнал прикладной спектроскопии. 2003. Т.70, №5. С.603-606.
17. Ивашин Н.В., Пархоц О.П., Ларссон С. Квантово-химическое исследование водородных связей в порфине // Журнал прикладной спектроскопии. 2002. Т.69, №5. С.572-578.
18. Буренкова Т.А., Сенюк М.А., Клищенко А.П. Влияние сольватации на поляризационные характеристики флуоресценции производных 1,3,4-оксадиазола в бинарных растворителях // Журнал прикладной спектроскопии. 2008. Т.75, №5. С.677-683.
19. Баранов В.И. Параметрический метод в теории вибронных спектров сложных молекул. Спектры поглощения и флуоресценции и структура стирола в возбужденном состоянии // Оптика и спектроскопия. 2000. Т.88, №2. С.216-223.
NADH ABSORPTION SPECTRUM AS A SUPERPOSITION OF SPECTRA OF ADENINE AND NICOTINAMIDE
Anikeev B.V., Zatrudina R.Sh., Konkova E.P.
Volgograd State University, Volgograd, Russia
SUMMARY. The water solution of the organic molecules are investigated. Results for adenine and nicotinamide are presented. The division of complex organic molecules into fragments is useful from point of view of computation time decrease. It is offered to count spectrum of NADH as the spectra superposition of adenine and the changed nicotinamide. NADH absorption spectrum was calculated by ab initio method. The fragments absorption spectra were calculated by the semiemperical method. Comparison between results from these quantum-chemical computational methods was made. Data of the calculation results and the experimental data are in a good agreement.
KEYWORDS: NADH, adenine, nicotinamide, fragment, absorption spectrum, solvent, quantum-chemical computational methods.
Аникеев Борис Васильевич,| доктор физико-математических наук, профессор, кафедра лазерной физики ВолГУ
Затрудина Римма Шикрулловна, кандидат физико-математических наук, доцент, докторант, кафедра лазерной физики ВолГУ
Конькова Елена Петровна, магистр, аспирант, ассистент кафедры лазерной физики ВолГУ, тел. (8442) 46-08-09, е-mail: konelepet@mail.ru
