CC BY
92
forms of hepatitis C virus E1 and E2 glycoproteins. Vaccine. 2004; 22 (29-30): 3917-28.
16. Zhu W., Fu J., Lu J., Deng Y., Wang H., Wei Y. et al. Induction of humoral and cellular immune responses against hepatitis c virus by vaccination with replicon particles derived from Sindbis-like virus XJ-160. Arch. Virol. 2013; 158 (5): 1013-9.
17. Huret C., Desjardins D., Miyalou M., Levacher B., Amadoudji Zin M., Bonduelle O. et al. Recombinant retrovirus-derived virus-like particle-based vaccines induce hepatitis C virus-specific cellular and neutralizing immune responses in mice. Vaccine. 2013; 31(11): 1540-7.
18. Masalova O.V., Lesnova E.I., Pichugln A.V., Mel'nikova T.M., Ulanova T.I., Burkov A.N. et al. Investigation into immunogenic-ity of hepatitis C virus nonstructural proteins covalently conjugated with immunomax. Immunologiya. 2008; 29: 338-345. (in Russian)
19. Masalova O.V., Lesnova E.I., Pichugin A.V., Melnikova T.M., Grabovetsky V.V., Petrakova N.V. et al. The successful immune response against hepatitis C nonstructural protein 5A (NS5A) requires heterologous DNA/protein immunization. Vaccine. 2010; 28 (8): 1987-96.
20. Wang Y., Keck Z.Y., Foung S.K. Neutralizing antibody response to hepatitis C virus. Viruses. 2011; 3(11): 2127-45.
21. Gómez C.E., Perdiguero B., Cepeda M.V., Mingorance L., García-Arriaza J., Vandermeeren A. et al. High, broad, poly-functional, and durable T cell immune responses induced in mice by a novel hepatitis C virus (HCv) vaccine candidate (MVA-HCV) based on modified vaccinia virus Ankara expressing the nearly full-length HCV genome. J. Virol. 2013; 87 (13): 7282-300.
Received 05.12.14
ИММУHOПAТOЛOГИЯ И КЛИНИЧЕС^ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
УДК 618.177-089.888.11-036.8-097-078.33
Ванян Р.Э., Менжинская И.В., Ванько Л.В., Долгушина Н.В., Калинина Е.А.
спектр аутоантител к гормонам и фосфолипидам у пациенток с «бедным» овариальным ответом в программе экстракорпорального оплодотворения
ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздрава РФ, 117997, Москва
Бесплодие у женщин, плохой ответ на гормональную стимуляцию овуляции, неудачи в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) часто ассоциируюся с аутоантителами: антиовариальными, антифосфолипидными (АФА), антителами к гонадотропинам и их рецепторам. Цель исследования - изучить спектр аутоантител к гормонам и фосфолипидам в сыворотке крови и фолликулярной жидкости (ФЖ) у пациенток ЭКО с "бедным" ова-риальным ответом (БОО) на стимуляцию суперовуляции. С использованием ИФА было показано, что антитела (IgM, IgG) к фолликулостимулирующему гормону (аФСГ), хорионическому гонадотропину (аХГ) и гонадотропин-рилизинг-гормону (аГнРГ)) выявляются в сыворотке крови пациенток ЭКО (n=150) чаще (у 50%), чем антитела к кардиолипину и Р2-гликопротеину-1 (у 9,3%; p<0,0001), их средний уровень значительно выше, чем у здоровых женщин (n=63) (p<0,01). Антитела к ХГ и ФСГ выявляются чаще (у 34 и 29,3%), чем ГнРГ (у 22%). Уровни IgG и IgA к гормонам в ФЖ в 5-10 раз ниже, чем в сыворотке, между ними отмечается прямая корреляционная связь. При БОО аГнРГ выявляются чаще (у 30,8%), чем при нормальном овариальном ответе (у 15,3%; p=0,0383). Средние уровни антител к гормонам несколько выше, а IgG к ГнРГ значительно выше при БОО (p=0,0468). У пациенток с двумя попытками ЭКО в прошлом средний уровень аФСГ выше, чем у пациенток с одной попыткой и без лечения методом ЭКО (p<0,05). Таким образом, антитела к гормонам выявляются в сыворотке крови и ФЖ у пациенток ЭКО более часто, чем АФА. Антитела к ГнРГ чаще определяются у пациенток с бедным овариальным ответом, а аФСГ - у пациенток с двумя попытками ЭКО в прошлом.
Ключевые слова: аутоантитела к фолликулостимулирующему гормону; аутоантитела к хорионическому гонадотропину; аутоантитела к гонадотропин-рилизинг-гормону; антифосфолипидные антитела; экстракорпоральное оплодотворение; бедный овариальный ответ.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(3): 167-172. Vanyan R. E., Menzhinskaya I.V., Van'ko L.V., Dolgushina N.V., Kalinina E.A.
SPECTRUM OF AUTOANTIBODIES AGAINST HORMONES AND PHOSPHOLIPIDS IN PATIENTS WITH POOR OVARIAN RESPONSE IN THE IN VITRO FERTILIZATION PROGRAM
Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after V.I. Kulakov, Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow
Для корреспонденции: Менжинская Ирина владимировна, i_menzinskaya@oparina4.ru For correspondence: Menzhinskaya Irina Vladimirovna, i_menzinskaya@oparina4.ru
Infertility in women, poor ovarian response (POR) to hormonal stimulation of ovulation, failures in cycles of in vitro fertilization (IVF) are often associated with autoantibodies: anti-ovarian, anti-phospholipid (APA), against gonadotropins and their receptors. Objective: to study the spectrum of autoantibodies against hormones and phospholipids in the serum and follicular fluid (FF) in IVF patients with the POR to stimulation of superovulation. Using ELISA it has been shown that anti-follicle-stimulating (aFSH), anti-human chorionic gonadotropin (aHCG), anti-gonadotropin-releasing hormone (aG-nRH) antibodies (IgM, IgG) are identified in the serum of IVF patients (n=150) more often (50%) than antibodies against cardiolipin and p2-glycoprotein-I (9.3%; p<0.0001), their mean levels are significantly higher than those in healthy women (n=63) (p<0.01). Antibodies against HCG and FSH are detected more frequently (34%; 29.3%) than aGnRH (22%). Levels of IgG and IgA against hormones in the FF are 5-10 times lower than those in the serum, direct correlation is observed between them. In the POR aGnRH are detected more frequently (30.8%) than in the normal ovarian response (15.3%; p=0.0383). The mean levels of antibodies against hormones are slightly higher, and the mean level of aGnRH IgG is significantly higher in the POR (p=0.0468). In patients with two IVF attempts in the past the mean aFSH level is higher than in patients with one attempt and without IVF treatment (p<0.05). Thus, antibodies against hormones are detected in the serum and FF of IVF patients more frequently than APA. Antibodies against GnRH are determined more often in patients with the POR, and aFSH - in patients with two IVF attempts in the past.
Keywords: anti-follicle-stimulating hormone autoantibodies; anti-chorionic gonadotropin autoantibodies; anti-gonad-otropin-releasing hormone autoantibodies; anti-cardiolipin autoantibodies; anti-fi2-glycoprotein-I autoantibodies; in vitro fertilization, poor ovarian response.
Citation: Immunologiya. 2015; 36(3): 167-172. (in Russian)
Бесплодие у женщин часто ассоциируется с повышенной продукцией органоспецифических и неорганоспецифиче-ских аутоантител: антифосфолипидных (АФА), антиовари-альных (АОА), антитиреоидных, антител к гонадотропным гормонам и их рецепторам и др. [1-3]. В настоящее время исследуется возможное влияние аутоантител на эффективность программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в лечении бесплодия и, в частности, на эффективность этапа стимуляции суперовуляции. Получение достаточного количества зрелых жизнеспособных преовуляторных ооцитов для оплодотворения in vitro является одним из наиболее важных этапов программы ЭКО. Ежегодно в мире выполняется более 500 000 циклов ЭКО, однако средняя частота наступления беременностей в программах ЭКО не превышает 35% [4]. При этом доля женщин с «бедным» овариальным ответом (БОО) на стимуляцию суперовуляции среди пациенток ЭКО составляет от 5,6 до 35,1% [5, 6]. БОО может быть проявлением преждевременной недостаточности яичников у женщин моложе 40 лет. Среди предполагаемых патогенетических механизмов развития БОО рассматриваются различные аутоиммунные нарушения [3, 7].
Большинство исследований демонстрируют высокую распространенность АОА при преждевременной недостаточности яичников (в 30-67% случаев) [8]. АОА обнаруживают у 60-70% женщин с плохим ответом на стимуляцию суперовуляции гонадотропинами [9]. АОА направлены к разным компонентам и отделам яичников и ассоциируются с плохими исходами в лечении бесплодия, снижением частоты фертилизации и наступления беременности [10]. Продемонстрировано, что р-субъединица фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) служит аутоантигеном для АОА, полученных у пациенток с преждевременной недостаточностью яичников [11]. Мишенью сывороточных АОА является область аминокислотной последовательности р-субъединицы 78-93, участвующая в связывании с рецептором гормона, что объясняет причину овариальных нарушений у данных пациенток. Антитела к ФСГ обнаруживаются у пациенток ЭКО как в сыворотке крови, так и в фолликулярной жидкости (ФЖ) [1214]. Присутствие антител к ФСГ в высоких титрах негативно влияет на эффективность стимуляции суперовуляции и часто ассоциируется со снижением числа растущих фолликулов и количества полученных зрелых ооцитов [12].
Антитела к гонадотропинам и их рецепторам описаны ранее у женщин с бесплодием, синдромом резистентных яичников и плохими ответами в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [15-17]. Антитела к лю-теинизирующему гормону (ЛГ) выявлены у 30% пациенток в программах ВРТ [13]. Кроме антител к ФСГ и ЛГ, у пациенток ЭКО с высокой частотой (у 53,3%) встречаются антитела к хорионическому гонадотропину (ХГ) [14]. Показано, что
антитела к ХГ, полученные у женщины с неэффективными циклами ЭКО в прошлом, способны нейтрализовать биологическую активность гормона in vitro и могут служить возможной причиной самопроизвольного прерывания беременности после ЭКО [18]. Более того, у женщин с невынашиванием беременности обнаружена повышенная продукция антител к гонадотропин-рилизинг-гормону (ГнРГ) [19].
Некоторые исследователи связывают неудачи в программах ЭКО с наличием АФА [20, 21]. Пациентки с неэффективными циклами ЭКО имеют повышенную встречаемость АФА (10-32%) по сравнению с успешными пациентками ЭКО или нормальной популяцией (0-5%) [20]. АФА из сыворотки крови поступают в ФЖ и могут оказывать прямое воздействие на ооцит, эмбрион и трофобласт. Пациентки с АФА в ФЖ имеют значительно более низкую частоту фертилизации.
Для оценки значения аутоантител как возможного маркера БОО в программах ЭКО необходимы дополнительные исследования спектра аутоантител при данном состоянии. В связи с этим цель настоящего исследования заключалась в изучении спектра аутоантител к гормонам и фосфолипидам в сыворотке крови и ФЖ у пациенток ЭКО с бедным овариаль-ным ответом на стимуляцию суперовуляции.
Материал и методы
Проводилось проспективное когортное исследование, в которое были включены 150 пациенток с бесплодием в возрасте от 20 до 40 лет (средний возраст 33,2±4,2 года) с нормальным кариотипом, без выраженной экстрагениталь-ной патологии, пороков развития гениталий, операций на яичниках, химио- или лучевой терапии в анамнезе, а также противопоказаний к проведению ВРТ. Перед включением в протокол ЭКО все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании. У 80 (53,3%) пациенток в прошлом были попытки ЭКО: у 37 (24,7%) - две, у 43 (28,7%) - одна попытка, у 76 (50,7%) были неудачи в циклах ЭКО, 70 (46,7%) пациенток впервые участвовали в программе ЭКО. В прошлом беременности были у 78 (52%) женщин, роды - у 23 (15,3%), медицинские аборты - у 29 (19,3%), самопроизвольные выкидыши - у 35 (23,3%), внематочные беременности - у 26 (17,3%), гормональные контрацептивы применяли 29 (19,3%) женщин.
Стимуляция суперовуляции проводилась по единому «короткому» протоколу с применением рекомбинантного ФСГ и антагонистов ГнРГ. Для запуска овуляции вводили препарат ХГ (хорагон). В соответствии с критериями ESHRE (2011 г.) сформировали группу пациенток с БОО (n=65) и группу сравнения с нормальным овариальным ответом (n=85) на стимуляцию суперовуляции. При этом БОО был диагностирован в случае созревания менее 3 фолликулов при стимуляции овуляции, наличия БОО в анамнезе или наличия сниженного
овариального резерва (количество антральных фолликулов менее 5-7, уровень антимюллерова гормона менее 0,5 нг/мл). Контрольную группу составили здоровые женщины с 1 или
2 физиологическими беременностями в прошлом (n=63) со средним возрастом 31,8±6,4 лет.
Образцы сыворотки крови и ФЖ у пациенток были взяты в день трансвагинальной пункции яичников и аспирации фолликулов. После центрифугирования образцы хранились до исследования при 70°С. В исследовании использовались образцы ФЖ, не содержащие примеси крови.
Определение антител (IgM, IgG) к кардиолипину (КЛ) и Р2-гликопротеину-1 ф2-ГП-Г) проводили методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) с использованием наборов фирмы Orgentec Diagnostica (Германия). Антитела к гормонам (ХГ, ФСГ, ГнРГ) определяли по методике непрямого твердофазного ИФА с использованием мышиных моноклональных антител к а-субъединице гонадотропинов для иммобилизации их на твердую фазу, высокоочищенных препаратов гормонов (Sigma Aldrich, США), конъюгатов моноклональных антител против IgM, IgG, IgA человека с пероксидазой хрена (Sigma Aldrich; Вектор-Бест Европа, Россия) в рабочих разведениях, положительных и отрицательных контрольных образцов [19, 22]. Сыворотку крови исследовали в разведении 1:100, ФЖ - в разведении 1:10 однократно в дублях, инкубации проводили на встряхивателе при 20±2°С в течение 1 ч. Оптическую плотность (ОП) измеряли на фотометре Multiskan EX (Thermo Electron (Shanghai) Instruments Co., Китай) при длине волны 450 нм. Результат ИФА считали положительным, если средняя ОП исследуемого образца превышала более чем на
3 стандартных отклонения среднюю ОП отрицательных контрольных образцов.
Статистический анализ полученных данных проводился с помощью электронных таблиц Microsoft Excel, пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 10 (StatSoft Inc., США), MedCalc v.12. Нормальность распределения значений в выборках проверяли с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между группами определяли с использованием U-теста Манна-Уитни, теста Стьюдента, %2-теста, теста Крускала-Уоллиса, для выявления взаимосвязи между переменными рассчитывали коэффициенты корреляции Пирсона, Спирмена. Различия считали статистически значимыми при уровне достоверности p <0,05.
Результаты и обсуждение
В настоящее время установлено значение АФА в патофизиологии привычной потери беременности. В научной литературе активно обсуждается роль АФА в нарушении имплантации, но до сих пор нет единого мнения о влиянии АФА на исход в циклах ЭКО [20, 23]. Показано, что распространенность АФА среди пациенток с неудачами в программах ЭКО достигает 10-32%, при этом у пациенток, имеющих более 3 неудачных попыток ЭКО, IgG к КЛ и фосфатидилсерину встречаются более часто, чем у пациенток с ранними привычными потерями беременности [20, 24].
В исследуемой нами группе пациенток ЭКО, включающей 70 (46,7%) женщин с первой попыткой ЭКО, повышенные уровни АФА в сыворотке крови выявлялись у 14 (9,3%) пациенток: антитела к КЛ - у 2 (1,3%) (IgM у 1, IgG у 1); антитела к P2-m-I - у 13 (8,7%) (IgM у 6 (4%), IgG у 8 (5,3%) пациенток). Уровень антител к КЛ соответствовал 14,3 и 19,1 Ед/мл; антител к P2-En-I находился в диапазоне от 5,2 Ед/мл до 22,1 Ед/мл. Обращало на себя внимание, что при отсутствии различий между средними уровнями АФА у пациенток с БОО и нормальным овариальным ответом, повышенные уровни АФА наблюдались чаще при БОО (у 10 (15,4%), чем при нормальном овариальном ответе (у 4 (4,7%) (p=0,0513).
Исследование ФЖ (n=30) показало, что уровень IgG к КЛ в ФЖ был в 3-10 раз ниже, а IgG к P2-m-I в ФЖ - в 10-20 раз ниже, чем в сыворотке крови. Средние уровни IgG к КЛ и Р2-ГП-[ в сыворотке (1:100) составляли 2,59±0,79 и 2,06±1,59 Ед/мл, а в ФЖ (1:10) - 4,35±1,43 и 1,26±0,34 Ед/мл соответственно. Уровень IgG к КЛ в ФЖ был выше уровня IgG к
Р2-ГП-1 (р <0,0001). Выраженной корреляционной связи между уровнями антител в сыворотке крови и ФЖ не наблюдалось.
Как известно, рост фолликулов, выбор доминантного, созревание ооцита в доминантном фолликуле, овуляция и формирование желтого тела регулируются множеством факторов, наиболее важными из которых являются гормоны: ГнРГ, ФСГ, ЛГ, эстрадиол, прогестерон и тестостерон.
В нашем исследовании у пациенток ЭКО повышение уровня антител к гормонам классов IgM и IgG в сыворотке крови наблюдалось значительно чаще - у 75(50%), чем АФА - у 14 (9,3%); р <0,0001). Повышенные уровни антител к ХГ были обнаружены у 51(34%) пациентки ЭКО: ^ - у 19(12,7%), IgG - у 38(25,3%) пациенток. IgG к ХГЧ выявлялись значительно чаще, чем ^М (р=0,0084). С высокой частотой у пациенток ЭКО выявлялись антитела к ФСГ (у 44 (29,3%): IgM - у 28 (18,7%), ДО - у 20(13,3%). Антитела к ГнРГ были обнаружены у 33 (22%) пациенток ЭКО: ^ - у 20 (13,3%), ДО - у 15 (10%) пациенток. Таким образом, антитела к ХГЧ и ФСГ выявлялись чаще, чем антитела к ГнРГ (р=0,0198; р=0,1441). Средние уровни антител к гормонам классов ^М и IgG у пациенток ЭКО были значительно выше, чем у здоровых женщин (р < 0,01). На рис. 1 представлены результаты определения антител к гормонам у пациенток ЭКО и здоровых женщин с указанием медианной величины, 95% доверительного интервала, диапазона значений, 25-го и 75-го процентилей. Между уровнями антител к гормонам классов ^М и IgG выраженной корреляционной связи не наблюдалось.
0,9 0,8 0,7 0,6
0,4 0,3 0,2 0,1
1,2 1,0 0,8
О
0,4 0,2 0,0
д
sjs ^т
аФСГ1 аФСГ2 аГнРП аГнРГ2 аХП аХГ2 б
со
* I
"X
аФСГ1 аФСГ2 аГнРП аГнРГ2 аХГ1 аХпГ
Рис. 1. Уровни антител к гормонам (аФСГ, аГнРГ, аХГ) классов ^М (а) и IgG (б) в сыворотке крови, определенные методом ИФА.
1 - у пациенток ЭКО (п = 150); 2 - у здоровых женщин (п = 63).
средние значения уровня аутоантител к гормонам (аФСТ, аГнрГ, аХГ) в сыворотке крови у пациенток ЭКО с БОО и нОО, определенные методом ИФА (М ± т)
Наиме- Средние значения уровня антител к Значение p
нование гормонам, ед. ОП
антител пациентки с БОО пациентки с НОО
(n = 65) (n = 85)
аФСГ IgM 0,312 ± 0,106 0,283 ± 0,1 0,0885*
аФСГ IgG 0,313 ± 0,127 0,284 ± 0,108 0,1333
аГнРГ IgM 0,238 ± 0,118 0,236 ± 0,092 0,9073
аГнРГ IgG 0,324 ± 0,126 0,290 ± 0,081 0,0468
аХГ IgM 0,291 ± 0,125 0,284 ± 0,129 0,7390
аХГ IgG 0,307 ± 0,158 0,270 ± 0,104 0,0865
Примечание. * - t-тест
1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0,0 -
л
s Ш1
аФСГ1 аФСГ2 аГнРП аГнРГ2 аХГ1 аХГ2
Ранее показано, что среди пациенток с бесплодием частота встречаемости антител к ФСГ и ЛГ выше у женщин, получающих лечение гонадотропинами [15]. У пациенток ЭКО запуску продукции антител к гормонам, по-видимому, способствует применение высоких доз ФСГ, ХГ и антагониста ГнРГ для стимуляции суперовуляции, а также высокие нефизиологические концентрации эстрадиола в лютеиновой фазе индуцированного цикла, превышающие в 5-10 раз его уровень в лютеиновой фазе спонтанного менструального цикла [25]. Превышение физиологических уровней гормонов выше критического порога может привести к индукции соответствующих аутоиммунных реакций [26]. Кроме того, эстрогены, как известно, поддерживают аутоиммунитет, стимулируют созревание B-лимфоцитов, повышение продукции иммуноглобулинов, №2-ответ [25, 27].
Установлено, что аффинно очищенные IgG к ХГ, выделенные из сыворотки крови пациентки ЭКО после многократных стимуляций суперовуляции, нейтрализовали биологическую активность ХГ в биоанализе in vitro при использовании линии трансформированных мышиных клеток Лейдига [18]. Антитела при низкой аффинности имели высокую связывающую способность, достаточную для нейтрализации эндогенного и экзогенного ХГ, введенного для индукции овуляции. Предполагается, что антитела к ФСГ могут образовывать иммунные комплексы и индуцировать их выведение, а также нарушать связывание гормона с рецептором, так как большая часть их направлена к участку полипептидной цепи (78-93) р-субъединицы ФСГ, ответственному за взаимодействие с рецептором [11].
При сравнении медианных уровней антител к гормонам уровни IgM к ФСГ и ХГЧ были значительно выше, чем IgM к ГнРГ (p <0,001); уровень IgG к ГнРГ был значительно выше, чем IgG к ХГЧ (p=0,0069), и несколько выше, чем IgG к ФСГ (p=0,0834).
При сравнении частоты выявления антител к ФСГ и ХГЧ у пациенток с БОО и нормальным ответом яичников на стимуляцию суперовуляции достоверных различий не найдено. Антитела к ГнРГ выявлялись статистически значимо чаще у пациенток с БОО (у 20 (30,8%), чем у пациенток с нормальным овариальным ответом (у 13 (15,3%); p=0,0383). Важно подчеркнуть, что средние уровни антител к гормонам были несколько выше, а средний уровень IgG к ГнРГ был значительно выше у пациенток с БОО, чем у женщин с нормальным овариальным ответом (см. таблицу). БОО наблюдался несколько чаще у пациенток с антителами к ГнРГ (у 20 (60,6%) и к ФСГ (у 23 (52,3%), чем у пациенток без антител к гормонам (у 29 (38,7%); p=0,058; p=0,2104).
В современной литературе антитела к ГнРГ описаны при невынашивании беременности [19]. Возможная взаимосвязь между антителами к ГнРГ и БОО не исследовалась. За последние годы получены новые данные о том, что ГнРГ не только стимулирует высвобождение ЛГ и ФСГ, но и непосредственно участвует в аутокринной и паракринной регуляции в репродуктивных тканях [28, 29]. Его периферические рецепторы экспрессируются у женщин в эндометрии,
Рис. 2. Уровни антител к гормонам (аФСГ, аГнРГ, аХГ) классов IgG (1) и IgA (2) в ФЖ у 30 пациенток ЭКО, определенные методом ИФА.
яичниках, плаценте. Экспрессия мРНК рецепторов ГнРГ обнаружена в овариальных клетках разных типов, включая преовуляторные гранулезные клетки, клетки желтого тела, а также в разных отделах яичников. Показано, что активация рецепторов ГнРГ в культуре гранулезных клеток стимулиру-
0,9 0,8 0,7 0,6
с
О
£ 0,5 О
0
со
С
О
О
е
СП
0,4 0,3 0,2 0,1
-V.
0,0
0,2
0,4 0,6 аФСП (ОП)
0,8
1,0
0,90,80,70,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 -0,0 -
0,0
0,2
0,4 0,6 аФСГ1 (ОП)
0,8
1,0
Рис. 3. Крреляционная связь между уровнями антител к ФСГ в сыворотке крови (1) и ФЖ (2) у 30 пациенток ЭКО. а - ДО (г = 0,509; р = 0,004); б - ДО (г = 0,3836; р = 0,0364).
ет созревание яйцеклетки и овуляцию, но угнетает развитие фолликулов.
Как известно, развитие ооцита осуществляется в ФЖ, которая образована секретом клеток гранулезы и плазматическим транссудатом и содержит высокие концентрации стероидных гормонов, иммуноглобулины и цитокины [30]. Ее состав оказывает выраженное воздействие на созревание ооцита.
В исследованной нами ФЖ (n=30) выявлялись антитела к гормонам классов IgG и IgA в количестве в 5-10 раз ниже, чем их уровень в сыворотке крови; IgM определялись в незначительном количестве, что, по-видимому, объясняется низким общим содержанием IgM в ФЖ и преобладанием в ней IgG и IgA [30] (рис. 2). Между уровнями IgG к ФСГ в сыворотке и ФЖ наблюдалась прямая корреляционная связь средней силы (r=0,509; p=0,004) (рис. 3). Между уровнями IgA к гормонам в сыворотке и ФЖ наблюдалась также прямая корреляционная связь средней силы: для IgA к ФСГ r=0,3836 (p=0,0364); для IgA к ГнРГ r=0,4010 (p=0,0281); для IgA к ХГЧ r=0,4201 (p=0,0208). Значительной корреляционной связи между другими антителами класса IgG не наблюдалось.
Полученные нами результаты совпадали с данными других исследований, в которых также была выявлена положительная корреляционная связь между уровнями IgG и IgA к гормонам в сыворотке крови и ФЖ [12, 14]. Положительная корреляция между уровнями антител в сыворотке и ФЖ свидетельствует о сывороточном происхождении антител и поступлении их в ФЖ с транссудатом. Кроме того, показано, что аФСГ IgG может аккумулироваться в растущем фолликуле, так как концентрация фолликулярного IgG к ФСГ положительно коррелирует с диаметром фолликула, отражающим его созревание [12]. Предполагается, что в течение периода гиперстимуляции IgG диффундирует в ФЖ с гормоном, фолликулярный уровень которого повышается по мере роста фолликула.
У 37 пациенток с двумя попытками ЭКО в прошлом антитела к гормонам выявлялись чаще, а IgG к ФСГ - статистически значимо чаще - у 9 (24,3%), чем у пациенток с одной попыткой и без попыток ЭКО (у 11 (9,7%); p=0,0465). Средний уровень IgG к ФСГ у пациенток с двумя попытками ЭКО в прошлом был выше (0,307 [0,177-0,965]), чем у остальных пациенток (0,259 [0,118-0,626]) (p=0,0415). Следует подчеркнуть, что среди пациенток группы сравнения, не получавших ранее лечение методом ЭКО, 22 (31,4%) применяли гормональные контрацептивы, у 54 (77,1%) были беременности, у 22 (31,4%) - самопроизвольные выкидыши, у 23 (32,9%) - медицинские аборты, у 15(21,4%) - роды, что могло отразиться на результатах исследования.
Ранее было показано, что у пациенток с неэффективными циклами ЭКО в прошлом со средним количеством попыток 1,8±0,8 на одну пациентку антитела к гормонам в ФЖ встречались чаще, чем у женщин, не получавших лечение данным методом [14]. Отрицательный результат в текущем цикле ЭКО наблюдался чаще у пациенток с антителами к гормонам в ФЖ, чем у пациенток без антител.
В настоящем цикле ЭКО биохимическая беременность была определена у 49 (32,7%) женщин. Существенных различий в частоте выявления и среднем уровне антител к гормонам и фосфолипидам между беременными и небеременными женщинами не наблюдалось. Исключением были IgG к ХГ, которые чаще выявлялись у беременных женщин (у 20 (40,8%), чем у небеременных (у 23 (22,8%); p=0,0363).
Таким образом, у пациенток ЭКО в сыворотке крови и фолликулярной жидкости выявляются антитела к гормонам и фосфолипидам. Повышение уровня антител к гормонам у пациенток ЭКО обнаруживается чаще, чем антител к фосфолипидам. Наиболее часто выявляются антитела к ХГ и ФСГ, реже к ГнРГ. Уровни антител к гормонам классов IgG и IgA, определяемые в ФЖ, значительно ниже, чем в сыворотке крови, между уровнями антител в сыворотке крови и ФЖ отмечается прямая корреляционная связь средней силы. Антитела к ГнРГ выявляются значительно чаще у пациенток с БОО, чем у пациенток с нормальным овариальным ответом. При этом средние уровни антител к гормонам несколько выше, а сред-
ний уровень IgG к ГнРГ значительно выше у пациенток с БОО.
Антитела к ФСГ выявляются чаще, и их средний уровень выше
у пациенток с двумя попытками ЭКО в прошлом, чем у пациенток с одной попыткой ЭКО и без лечения методом ЭКО.
литература
3. Ванян Р.Э., Менжинская И.В., Долгушина Н.В. Роль аутоиммунных антител в развитии «бедного» овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2014; 20(3): 53-7.
14. Менжинская И.В., Безнощенко О.С., Сароян Т.Т., Корнеева И.Е., Ванько Л.В., Сухих Г.Т. Антитела к гормонам репродуктивной системы как возможный фактор риска неблагоприятного исхода в циклах экстракорпорального оплодотворения. Акушерство и гинекология. 2012; 2: 41-5.
19. Менжинская И.В., Ванько Л.В., Кирющенков П.А., Тер-Аванесов Г.В., Гаврилов Ю.А., Сухих Г.Т. Ассоциация антител к гонадотропин-рилизинг гормону с нарушениями репродуктивной функции человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013; 155 (6): 675-8.
22. Пономарева И.В., Сухих Г.Т., Никитин Э.Б., Кирющенков П.А., Сидельникова В.М., Ванько Л.В. Аутоантитела к хо-рионическому гонадотропину человека при привычном невынашивании беременности. Бюллетень эксперементальной биологии и медицины 1996; 4: 450-2.
Поступила 02.12.14
references
1. Cervera R., Balasch J. Bidirectional effects on autoimmunity and reproduction. Hum. Reprod. Update. 2008; 14(4): 359-66.
2. Cocco C., Brancia C., D'Amato F., Noli B. Pituitary gonadotropins and autoimmunity. Mol. Cell. Endocrinol. 2014; 385(1-2): 97-104.
3. Vanyan R.E., Menzhinskaya I.V., Dolgushina N.V. The role of autoimmune antibodies in the development of the "poor" ovarian response in programs of assisted reproductive technologies (review). Problemy reproduktsii 2014; 20(3): 53-7. (in Russian)
4. Smith G.D., Swain J.E., Bormann C.L. Microfluidics for gametes, embryos, and embryonic stem cells. Semin. Reprod. Med. 2011; 29(1): 5-14.
5. Veleva Z., Jarvela I.Y., Nuojua-Huttunen S., Martikainen H., Tapanainen J.S. An initial low response predicts poor outcome in in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection despite improved ovarian response in consecutive cycles. Fertil. and Steril. 2005; 83:1384-90.
6. Hendriks D.J., te Velde E.R., Looman C.W., Bancsi L.F., Broekmans F.J. Expected poor ovarian response in predicting cumulative pregnancy rates: a powerful tool. Reprod. Biomed. Online. 2008; 17(5): 727-36.
7. Badawy A., Wageah A., El Gharib M., Osman E.E. Prediction and diagnosis of poor ovarian response: the dilemma. J. Reprod. Infertil. 2011; 12(4): 241-8.
8. Kelkar R.L., Meherji P.K., Kadam S.S., Gupta S.K., Nandedkar T.D. Circulating auto-antibodies against the zona pellucida and thyroid microsomal antigen in women with premature ovarian failure. J. Reprod. Immunol. 2005; 66(1): 53-67.
9. Tuohy V.K., Altuntas C.Z. Autoimmunity and premature ovarian failure. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2007; 19: 366-9.
10. Pires E.S. Multiplicity of molecular and cellular targets in human ovarian autoimmunity: an update. J. Assist. Reprod. Genet. 2010; 27: 519-24.
11. Gobert B., Jolivet-Reynaud C., Dalbon P., Barbarino-Monnier P., Faure G., Jolivet M. et al. An immunoreactive peptide of the FSH involved in autoimmune infertility. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 289: 819-24.
12. Haller K., Salumets A., Uibo R. Anti-FSH antibodies associate with poor outcome of ovarian stimulation in IVF. Reprod. Biomed. Online. 2008; 16(3): 350-5.
13. Haller K., Salumets A., Grigorova M., Talja I., Salur L., Bene M.C. et al. Putative predictors of antibodies against follicle-stimulating hormone in female infertility: a study based on in vitro fertilization patients. Am. J. Reprod. Immunol. 2007; 57(3): 193-200.
14. Menzhinskaya I.V, Beznoshchenko O.S., Saroyan T.T., Korneeva I.E., Van'ko L.V., Sukhikh G.T. Antibodies to reproductive hormones as a possible risk factor for poor outcome of in vitro fertilization cycles. Akusherstvo iginekologiya. 2012; 2: 41-5. (in Russian)
15. Shatavi S.V., Llanes B, Luborsky J.L. Association of Unexplained
иммунология № 3, 2015
infertility with gonadotropin and ovarian antibodies. Am. J. Reprod. Immunol. 2006; 56(5-6): 286-91.
16. Platia M.P., Bloomquist G., Williams R.F., Hodgen G.D. Refractoriness to gonadotropin therapy: how to distinguish ovarian failure versus pseudoovarian resistance caused by neutralizing antibodies. Fertil. andSteril. 1984; 42: 779-84.
17. Meyer W.P., Lavy G., DeCherney A.H., Visintin I., Economy K., Luborsky J.L. Evidence of gonadal and gonadotropin antibodies in women with a suboptimal ovarian response to exogenous gonadotropin. Obstet. and Gynecol. 1990; 75: 795-9.
18. Amato F., Warnes G.M., Kirby C.A., Norman R.J. Infertility caused by hCG autoantibody. J. Clin. Endocrinol. Metabol. 2002; 87(3): 993-7.
19. Menzhinskaya I.V., Van'ko L.V., Kiryushchenkov P.A., Ter-Avanesov G.V., Gavrilov Yu.A., Sukhikh G.T. Correlation between antibodies to gonadotropin-releasing hormone and reproductive disorders in humans. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2013; 155 (6): 675-8. (in Russian)
20. Matsubayashi H., Sugi T., Arai T., Shida M., Kondo A., Suzuki T. et al. IgG-antiphospholipid antibodies in follicular fluid of IVF ET patients are related to low fertilization rate of their oocytes. Am. J. Reprod. Immunol. 2006; 55(5): 341-8.
21. Lee S.-R., Park E.-J., Kim S.-H., Chae H., Kim C.-H., Kang B.-M. Influence of antiphospholipid antibodies on pregnancy outcome in women undergoing In Vitro Fertilization and Embryo Transfer. Am. J. Reprod. Immunol. 2006; 57: 34-9.
22. Ponomareva I.V., Sukhikh G.T., Nikitin E.B., Kiryushchenkov P.A., Sidel'nikova V.M., Van'ko L.V. Autoantibodies against human chorionic gonadotropin in recurrent pregnancy loss. Byul-
leten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 1996; 4: 450-2. (in Russian)
23. Buckingham K.L., Stone P.R., Smith J.F., Chamley L.W. An-tiphospholipid antibodies in serum and follicular fluid: is there a correlation with IVF implantation failure? Hum. Reprod. 2006; 21: 728-34.
24. Matsubayashi H., Sugi T., Arai T., Kondo A., Suzuki T., Izumi S. et al. Different antiphospholipid antibody specificities are found in association with early repeated pregnancy loss versus recurrent IVF-failure patients. Am. J. Reprod. Immunol. 2001; 46(5): 323-9.
25. Haller K., Sarapik A., Talja I., Salumets A, Uibo R. Controlled ovarian hyperstimulation changes the prevalence of serum au-toantibodies in in vitro fertilization patients. Am. J. Reprod. Immunol. 2006; 56(5-6): 364-70.
26. Thomas J.W. Antigen-specific responses in autoimmunity and tolerance. Immunol. Res. 2001; 23: 235-44.
27. Pennell L.M., Galligan C.L., Fish E.N. Sex affects immunity. J. Autoimmunity. 2012; 38 (Issues 2-3): J282-J291.
28. Yu B., Ruman J., Christman G. The role of peripheral gonadotro-pin-releasing hormone receptors in female reproduction. Fertil. Steril. 2011; 95(2): 465-73.
29. Wu H.M., Wang H.S., Huang H.Y., Soong Y.K., MacCalman C.D., Leung P.C. GnRH signaling in intrauterine tissues. Reproduction. 2009; 137(5): 769-77.
30. Hammaden M.E., Ertan A.K., Zeppezauer M., Baltes S., Georg T., Rosenbaum P. et al. Immunoglobulins and cytokines level in fol-licular fluid in relation to etiology of infertility and their relevance to IVF outcome. Am. J. Reprod. Immunol. 2002; 47: 82-90.
Received 02.12.14
МЕТОДЫ
© АХАПКИнА И.Г., ЖЕлтИКОвА т.М., 2015 УдК 616-056.43-085.37-078.33
Ахапкина И.Г., Желтикова Т.М.
изучение иммуногенной активности аллергенных экстрактов пыльцы растений для выявления минорных чужеродных антигенов
ФгБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, 105064, Москва
В настоящее время для проведения аллергенспецифической иммунотерапии используют аллергенные экстракты (Аг), характеризующиеся биологической активностью, при этом обычно не учитывают компонентный состав. Однако минорные примеси могут корригировать общий иммунный ответ пациента с генетической предрасположенностью к гиперчувствительности.
Цель работы заключалась в выявлении в коммерческих Аг пыльцы ветроопыляемых растений минорных примесей антигенов грибов, ассоциированных с пыльцой в природных условиях, путем изучения иммуногенной активности Аг. Методом иммуноферментного анализа изучали степень иммунохимического связывания поликлональных кроличьих антисывороток, полученных против Аг пыльцы ольхи клейкой (Alnus glutinosa), березы повислой (Betula pendula), лещины обыкновенной (Corylus avellana), ежи сборной (Dactylis glomerata), полыни горькой (Artemisia absinthium), тимофеевки (Phleum pretense), с суспензиями мицелиальных и дрожжевых грибов (106 КОЕ/мл) и коммерческими Аг грибов (1 мкг/мл).
Показано, что Аг пыльцы растений индуцировали продукцию IgG, обладавших иммунохимическим сродством в отношении некоторых суспензий и Аг мицелиальных и дрожжевых грибов.
Таким образом, изучение иммуногенной активности позволяет косвенно выявлять в составе аллергенных препаратов минорные примеси чужеродных антигенов. Соответственно данный параметр следует считать еще одним критерием биологической активности Аг.
Ключевые слова: иммуногенность; аллерген; компонентный состав аллергенных экстрактов.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(3): 172-175.
Для корреспонденции: Ахапкина Ирина Гавриловна, isun17@yandex.ru For correspondence: Akhapkina Irina Gavrilovna, isun17@yandex.ru
