CC BY
26© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
О.А.Крыжановская, А.В.Лазарева, И.В.Чеботарь, Ю.А.Бочарова, Н.А.Маянский
СПЕКТР АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ И РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ОХА-КАРБАПЕНЕМАЗ СРЕДИ ШТАММОВ ACINETOBACTER BAUMANNII, ВЫДЕЛЕННЫХ У ПАЦИЕНТОВ ХИРУРГИЧЕСКИХ И РЕАНИМАЦИОННЫХ ОТДЕЛЕНИЙ В МОСКВЕ
Научный центр здоровья детей, Москва
Цель. Охарактеризовать спектр антибиотикорезистентности штаммов Acinetobacter baumannii, изолированных от пациентов 8 хирургических и реанимационных отделений 3 лечебных учреждений в городе Москва, и определить молекулярно-генетические механизмы устойчивости их карбапенем-резистентных форм. Материалы и методы. Исследовано 95 штаммов A. baumannii, изолированных от пациентов реанимационных и хирургических отделений города Москва в 2012 — 2014 годах. Чувствительность штаммов к антибиотикам была тестирована фенотипически согласно рекомендациям EUCAST. Наличие у исследуемых штаммов генов VIM, IMP, OXA-23, OXA-40, OXA-48, OXA-58 и NDM определяли при помощи полимеразной цепной реакции в реальном времени. Результаты. Нечувствительными к карбапенемам оказались 86,3% штаммов, чувствительными — 13,7%. К гентамицину были нечувствительны 80,0% штаммов, к нетилмици-ну — 80,0% штаммов, к ципрофлоксацину — 94,7% штаммов, к колистину — 2,1%. Нечувствительность к представителям двух и более классов антибиотиков проявляли 91,6% изолятов, представителям трех классов — 78,9% штаммов. Два штамма были панрези-стентны, 4,2% (4/95) изолятов были чувствительны ко всем классам антибиотиков. Металло-Р-лактамазы не были обнаружены. Гены карбапенемаз (ОХА-23 и/или ОХА-40) были выявлены у 85,3% (81/95) штаммов, охарактеризизованных фенотипически как нечувствительные к карбапенемам. Заключение. Полученные результаты говорят о росте резистентности к карбапенемам и множественной резистентности у клинически значимых штаммов A. baumannii. Резистентность к карбапенемам ассоциирована с генами ОХА-23 и ОХА-40. Выводы позволяют обосновать перспективность внедрения технологий молекулярно-генетического тестирования антибиотикорезистентности.
Журн.микробиол., 2016, № 1, С. 40—45
Ключевые слова: Acinetobacter baumannii, антибиотики, резистентность, гены карбапе-немаз
O.A.Kryzhanovskaya, A.V.Lazareva, I.V.Chebotar, Yu.A.Bocharova, N.A.Mayansky
SPECTRUM OF ANTIBIOTIC RESISTANCE AND PREVALENCE OF OXA-CAR-BAPENEMASES AMONG ACINETOBACTER BAUMANNII STRAINS, ISOLATED FROM PATIENTS OF SURGICAL AND REANIMATION DEPARTMENTS IN MOSCOW
Scientific Centre of Children's Health, Moscow, Russia
Aim. Characterize spectrum of antibiotics resistance of Acinetobacter baumannii strains, isolated from patients of 8 surgical and reanimation departments of 3 medical institution of Moscow, and determine molecular-genetic mechanisms of stability of their carbapenem-resistant forms. Materials and methods. 95 strains of A. baumannii, isolated from patients of reanimation and surgical departments of Moscow in 2012 — 2014, were studied. Sensitivity of strains to antibiotics was tested phenotypically according to recommendations of EUCAST. The presence ofVIM, IMP, OXA-23, 0XA-40, OXA-48, OXA-58 and NDM genes in the studied strains was determined by polymerase chain reaction in real time. Results. 86.3% of strains turned out to be non-sensitive to carbapenems, sensitive — 13.7%. 80.0% of strains were non-sensitive to gentamicin, 80.0% of strains — to netilmicin, 94.7% of strains — to ciprofloxacin, 2.1% — to colistin. 91.6% of isolates have shown non-sensitivity to members of 2 and more classes of antibiotics, 78.9% of strains — to members of 3 classes. 2 strains were panresistant, 4.2% (4/95) of the isolates were sensitive to all
the classes of antibiotics. Metallo-0-lactamases were not detected. Genes of carbapenemases (OXA-23 and/or OXA-40) were detected in 85.3% (81/95) of strains, characterized phenotypi-cally as non-sensitive to carbapenems. Conclusion. The results obtained shown an increase of resistance to carbapenems and multiple resistance in clinically significant strains of A. baumannii. Resistance to carbapenems is associated with OXA-23 and OXA-40 genes. The conclusions allow to justify perspectives of introduction of technologies of molecular-genetic testing of antibiotics resistance.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 1, P. 40-45
Key words: Acinetobacter baumannii, antibiotics, resistance, carbapenemase genes ВВЕДЕНИЕ
Инфекции, вызванные Acinetobacter baumannii, занимают важнейшее место в структуре инфекционной заболеваемости в госпитальных условиях [4, 5, 8]. Летальность при ацинетобактериальных госпитальных инфекциях может достигать 59% [5]. Крайне негативным клиническим свойством ацинетобактерий является антибиотикорезистентность, которая проявляется в устойчивости многих госпитальных штаммов к антибиотикам различных групп. Большое значение имеет резистентность к в-лактамным антибиотикам, связанная с продукцией ферментов в-лактамаз [2]. Важную роль играют карбапенемазы — в-лактамазы, которые вызывают разрушение карбапенемов, делая штаммы неуязвимыми для имипенема, меропенема, дорипенема. Доказано, что от 4 до 85% штаммов A. baumannii продуцируют карбапенемазы [11, 13]. Особое значение в прогресси-ровании ацинетобактериальных инфекций связано с феноменом множественной антибиотикорезистентности, которая проявляется в потере чувствительности к антибиотикам разных классов [5]. В связи с этим, важно обеспечить не только диагностику ацинетобактериальной инфекции, но и оценить спектр чувствительности выделенного изолята к антибиотикам. Традиционная диагностика резистентности производится при помощи фенотипических методов, основанных на оценке задержки роста бактерий при культивировании в присутствии антибиотиков. Однако эти достаточно надежные способы не позволяют сделать выводы о молекулярных основах резистентности. Использование молекулярно-генетических методов исследования позволяет получить дополнительную информацию о механизмах формирования устойчивых штаммов, что бывает необходимым для оптимизации стратегии антибиотикотерапии и прогнозирования эволюции резистентности.
Цель настоящей работы — при помощи фенотипических методов охарактеризовать спектр антибиотикорезистентности штаммов A. baumannii, изолированных от пациентов хирургических и реанимационных отделений в городе Москва, и определить молекулярно-генетические механизмы устойчивости их карбапенем-резистентных форм.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования были штаммы A. baumannii, изолированные из патологических локусов у детей и взрослых пациентов из 8 реанимационных и хирургических отделений 3 лечебно-профилактических учреждений города Москва в 2012 — 2014 годах. Видовая идентификация штаммов проводилась при помощи рутинных методов, на MALDI-TOF масс-спектрометре Biotyper MicroFlex (Bruker) и на автоматическом анализаторе Vitek 2 Compact (BioMerieux). Фенотипическое исследование антибиотикорезистентности дублировалось двумя способами — на автоматическом анализаторе Vitek 2 Compact (BioMerieux) и диффузионным спо-
собом при помощи Е-тестов (BioMerieux). Оценка результатов фенотипического тестирования проводилась при помощи программного обеспечения для Vitek 2 Compact и на основе критериев Европейского комитета по тестированию чувствительности к антибиотикам (EUCAST) — для Е-тестов. При помощи фенотипиче-ских способов была тестирована резистентность к карбапенемам (имипенем, меропенем), ципрофлоксацину, гентамицину, нетилмицину и колистину, которые входят в список антибиотиков с валидированными оценочными критериями EUCAST для тестирования ацинетобактерий (данные с сайта EUCAST, режим доступа: http://www.eucast.org). Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибиотика для 50% исследованных штаммов приведены в табл. Фенотипическое выявление продукции металло-в-лактамаз (МБЛ) осуществляли по описанной ранее методике [6].
При оценке результатов использовали терминологию EUCAST, описывая штаммы как резистентные, чувствительные или штаммы с промежуточной чувствительностью. Под термином нечувствительные подразумевали объединенные в одну группу резистентные и промежуточные штаммы.
Все штаммы были тестированы молекулярно-генетическим методом для выявления генов карбапенемаз. Исследование было основано на использовании в одной реакции двух пар праймеров к внутренним участкам bla-генов. Метод был реализован при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РТ) на платформе амплификатора BioRad CFX1000 (BioRad). Пробоподготовка включала выделение бактериальной ДНК с помощью наборов «ГК-экспресс» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). В качестве целевых генов были выбраны VIM, IMP, OXA-23, 0XA-40, OXA-48, OXA-58 — гены, вносящие наиболее весомый вклад в формирование резистентности к карбапенемам [13, 17]. Кроме перечисленных генов был проведен поиск NDM — редкого для ацинетобактерий, но интересного с позиции эволюции резистентности гена [13, 17]. Гены определялись с помощью коммерческих наборов «АмплиСенс MDR MBL-FL», «АмплиСенс MDR Ab-OXA-FL», «АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL», включающих соответствующие праймеры и реакционные растворы, согласно рекомендациям фирмы-изготовителя (ЦНИИ эпидемиологии).
Каждый штамм был тестирован не менее трех раз. Статистическая обработка результатов проводилась при помощи стандартных приемов. Для сравнения результатов двух методов оценки чувствительности к антибиотикам (фенотипиче-ского и молекулярно-генетического) применяли стандартный статистический критерий, направленный на определение степени парной согласованности результатов — каппу Коэна. Значения каппы Коэна >0,75 считали подтверждением достаточной степени согласованности результатов [10].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В работе было исследовано 95 штаммов. Фенотипические характеристики их чувствительности к антибиотикам, отражены в табл. Фенотипическая оценка отношения штаммов А. Ъаишаиип к карбапенемам показала абсолютное соответствие между чувствительностью/резистентностью исследуемых изолятов к имипенему и меропенему. Нечувствительными к карбапенемам оказались 86,3% (82/95) штаммов, среди которых было 84,2% (80/95) резистентных штам-
Спектр антибиотикорезистентности исследованных штаммов A. bauiiiaiinii (n=95)
МПК Доля
Антибиотик (мкг/мл) нечувств. шт., МПК50
для нечувств. % (абс.) (мкг/мл)
шт.
Имипенем 2 86,3 (82) >32
Меропенем 2 86,3 (82) >32
Гентамицин 4 80,0 (76) 16
Нетилмицин 4 80,0 (78) >32
Ципрофлоксацин 1 94,7 (90) 4
Колистин 2 2,1 (2) 0,3
мов и 2,1% (2/95) штаммов с промежуточной чувствительностью. Все штаммы, нечувствительные к имипенему, были нечувствительны к меропенему, и наоборот, МБЛ не были обнаружены ни у одного из исследованных штаммов.
К гентамицину были нечувствительны 80,0% (76/95) штаммов, к нетилмици-ну — 80,0% (76/95) штаммов, к ципрофлоксацину — 94,7% (90/95) штаммов. Два штамма (2,1%) были резистентны к колистину с МПК 3 мкг/мл, они составляли группу панрезистентных штаммов. Нечувствительными к представителям двух и более классов антибиотиков были 91,6% (87/95) штаммов. Нечувствительностью к представителям трех классов антибиотиков обладали 78,9% (75/95) штаммов, а 4,2% (4/95) изолятов были чувствительны ко всем классам антибиотиков.
Результаты, отражающие наличие у A. baumannii генов карбапенемаз, показали следующее: гены карбапенемаз были обнаружены у 85,3% (81/95) штаммов A. baumannii, причем все эти штаммы относились к категории нечувствительных к карбапенемам. Кроме того, у одного штамма, который фенотипически характеризовался как нечувствительный к карбапенемам (МПК имипенема — 4 мкг/мл, МПК меропенема — 6 мкг/мл), не было выявлено ни одного из исследованных генов, включая VIM, IMP, 0XA-23/40/48/58 и NDM. У всех карбапенем-чувствительных изолятов гены карбапенемаз отсутствовали. Большинство карбапенем-нечувствительных штаммов (84,1%; 69/82) были носителями генов 0ХА-40, у 18,3% (15/82) карбапенем-нечувствительных штаммов определялся ген ОХА-23. У 3 штаммов (3,7%) было выявлено присутствие одновременно двух генов карбапенемаз — 0ХА-40 и ОХА-23. Степень согласованности результатов, полученных двумя методами определения чувствительности ацинетобактерий к карбапенемам (фенотипическая оценка и выявление генов карбапенемаз), была очень высокой — значение каппы Коэна составило 0,957 (р <0,001).
ОБСУЖДЕНИ Е
Результаты, полученные в ходе настоящего исследования, вызывают тревогу: среди исследованных изолятов из инфекционно-воспалительных локусов лишь около 5% штаммов были чувствительны к антибиотикам из всех групп, тестирование с которыми рекомендуется EUCAST. Более 95% изолятов демонстрировали нечувствительность к представителям одного или более классов антибиотиков. Несмотря на то, что феномен множественной резистентности является весьма распространенным среди госпитальных ацинетобактерий, его выявление должно сопровождаться существенной корректировкой лечебно-профилактических мероприятий. Это обусловлено значительным (до 68%) возрастанием смертности при инфекциях, вызванных мультирезистентными штаммами ацинетобакетрий [9, 14]. Наши результаты показали значительное нарастание резистентности по сравнению с данными межрегиональных исследований, проведенных в России в 2002 — 2004 годах, когда количество выявляемых в отделениях реанимации и интенсивной терапии карбапенем-резистентных ацинетобактерий составляло около 2%, устойчивых к ципрофлоксацину — 73,9% [3]. Более поздние исследования, проведенные Горбичем Ю.Р. и др. в Республике Беларусь в 2010 году [1], говорят о росте уровня карбапенем-резистентности: устойчивость к имипенему составляла 53,5%, к меропенему — 60,6%. В нашей работе изучаемые штаммы были изолированы только от реанимационных и хирургических больных, тогда как Горбич Ю.Р. и др. анализировали все нозокомиальные штаммы. Именно с этим может быть связан полученный нами более высокий уровень карбапенем-резистентности (около 85%).
В целом, рост числа карбапенем- и мультирезистентных штаммов A. baumannii, изолированных от пациентов московских госпиталей, соответствует мировым тенденциям [13].
В ходе исследования не было обнаружено ни одного штамма, продуцирующего МБЛ, что было подтверждено фенотипическими и молекулярно-генетическими методами. Отсутствие МБЛ-штаммов является позитивным признаком, потому что VIM-, IMP- и NDM-карбапенемазы обладают более высокой каталитической активностью, расширенным спектром субстратной специфичности, охватывающей практически все в-лактамы, и индифферентностью к ингибиторам в-лактамаз [7]. Все перечисленные свойства говорят о большей клинической и эпидемиологической опасности МБЛ-продуцирующих бактерий.
Полученные нами данные о контроле устойчивости к имипенему и меропене-му лишь двумя генами (ОХА-23 и 0ХА-40) не противоречат информации о распространенности генов, определяющих карбапенем-резистентность госпитальных штаммов A. baumannii. ОХА-23- и 0ХА-40-подобные гены являются характерными для нозокомиальных изолятов ацинетобактерий во многих регионах мира, включая европейские страны [12].
В трех случаях нами установлены интересные факты наличия у одного штамма одновременно двух генов (blaoxA^ и blaoxA^o). Хотя такие случаи и являются редкими, они были описаны ранее. Исследования, проводившиеся в Мексике, выявили наличие у одного штамма одновременно генов ОХА-58 и ОХА-239 (ОХА-23-подобный ген) [16].
Исследование подтвердило высокую степень соответствия между результатами фенотипического тестирования чувствительности к карбапенемам и ПЦР-определением генов карбапенемаз.
Был зарегистрирован лишь один случай расхождения между результатами молекулярно-генетического и фенотипического исследования, когда у штамма с промежуточной чувствительностью к имипенему и меропенему отсутствовали гены карбапенемаз. Такие случаи нечасты, но возможны. Они могут быть обусловлены двумя причинами. Первая связана с продукцией штаммом карбапенемазы, ген которой не тестировался в настоящем исследовании. Подобные карбапене-мазы встречаются редко, но их перечень включает достаточное количество разновидностей [15]. Во-вторых, отсутствие гена при наличии фенотипической нечувствительности может объясняться нелактамазными механизмами, например, эффлюкс-активностью, которая может осуществляться у ацинетобактерий в отношении представителей любых классов антибиотиков [5]. Таким образом, полученные результаты позволяют обосновать перспективность внедрения технологий молекулярно-генетического тестирования антибиотикорезистентности. Конечно, идентификация генов не может рассматриваться как абсолютная альтернатива общепринятым способам. Однако применение этого метода имеет одно важное достоинство: метод существенно ускоряет процесс тестирования резистентности, что может быть крайне важно для выбора антибиотиков в неотложных клинических случаях.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (соглашение № 14.607.21.0064, уникальный идентификатор прикладных научных исследований RFMEFI60714X0064).
ЛИТЕРАТУРА
1. Горбич Ю.Р., Карпов И.А., Мартинович А.А., Левшина Н.Н. Особенности резистентности Acinetobacter baumannii к карбапенемам в Республике Беларусь. Здравоохранение. 2011, 5: 25-30.
2. Дьячкова В.С., Бажукова Т.А. Механизмы резистентности микроорганизмов к в-лактамным антибиотикам. Журн. микробиол. 2014, 4: 101-109.
3. Решедько Г. К., Рябкова Е. Л., Кречикова О. И., Сухорукова М. В., Шевченко О. В., Эйдельштейн М. В., Козлов Р.С. Резистентность к антибиотикам грамотрицательных
возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2008, 10: 96-112.
4. Руднов В. А., Бельский Д.В., Дехнич А.В. Инфекции в ОРИТ России: результаты национального многоцентрового исследования. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2011, 13: 4: 294-304.
5. Чеботарь И.В., Лазарева А.В., Масалов Я.К., Михайлович В.М., Маянский Н.А. Acinetobacter: микробиологические, патогенетические и резистентные свойства. Вестн. РАМН. 2014, 9-10: 39-50.
6. Шевченко О. В., Эйдельштейн М. В., Степанова М. Н. Металло-Р-лактамазы: значение и методы выявления у грамотрицательных неферментирующих бактерий. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2007, 1: 211-218.
7. Cornaglia G., Giamarellou H., Rossolini G. M. Metallo-P-lactamases: a last frontier for P-lactams? Lancet Infect. Dis. 2011, 11 (5): 381-393.
8. Custovic A., Smajlovic J., Hadzic S. et al. Epidemiological surveillance of bacterial nosocomial infections in the surgical intensive care unit. Materia socio-medica. 2014, 26 (1): 7-11.
9. Falagas M.E., Koletsi P.K., Bliziotis I.A. The diversity of definitions of multidrug-resistant (MDR) and pandrug-resistant (PDR) Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. J. Med. Microbiol. 2006, 55 (12): 1619-1629.
10. Fleiss J.L. Statistical methods for rates and proportions. John Wiley & Sons Inc., New York, 1981.
11. Fritsche T.R., Sader H.S., Toleman M.A. et al. Emerging metallo-P-lactamase-mediated resistances: a summary report from the worldwide SENTRY antimicrobial surveillance program. Clin. Infect. Dis. 2005, 41 (Suppl. 4): S276-S278.
12. Higgins P.G., Dammhayn C., Hackel M., Seifert H. Global spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. J. Antimicrob. Chemother. 2010, 65 (2): 233-238.
13. Kempf M., Rolain J.M. Emergence of resistance to carbapenems in Acinetobacter baumannii in Europe: clinical impact and therapeutic options. Int. J. Antimicrob. Agents. 2012, 39 (2): 105-114.
14. Maragakis L.L, Perl T.M. Acinetobacter baumannii: epidemiology, antimicrobial resistance, and treatment options. Clin. Infect. Dis. 2008, 46 (8): 1254-1263.
15. Perez F., Hujer A. M., Hujer K. M. et al. Global challenge ofmultidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemotherapy. 2007, 51 (10) : 3471-3484
16. Tamayo-Legorreta E.M., Garza-Ramos U., Barrios-Camacho H. et al. Identification of OXA-23 carbapenemases: novel variant OXA-239 in Acinetobacter baumannii ST758 clinical isolates in Mexico. New Microbes New Infect. 2014, 2 (6): 173-174.
17. Zarrilli R., Pournaras S., Giannouli M., Tsakris A. Global evolution of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii clonal lineages. Int. J. Antimicrob. Agents. 2013, 41 (1): 11-19.
Поступила 10.05.15
Контактная информация: Чеботарь Игорь Викторович, д.м.н.,
119991, Москва, Ломоносовский пр., 2, р.т. (495)967-14-20
