Создание модели спаечного процесса с имитацией иммунного поражения брюшины Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 611.381.001.572(045)

СОЗДАНИЕ МОДЕЛИ СПАЕЧНОГО ПРОЦЕССА С ИМИТАЦИЕЙ ИММУННОГО ПОРАЖЕНИЯ БРЮШИНЫ

© 2007г. П.М. Лаврешин, В.К. Гобеджишвили, А.Б. Хутов, М.П. Лаврешин, М.С. Жуков, А.В. Левченко

В связи с расширением показаний к хирургическому лечению заболеваний органов брюшной полости и отсутствием надежных средств профилактики, число послеоперационных спаечных осложнений остается высоким. По поводу спаечной болезни ежегодно в хирургических отделениях лечится около 1 % прооперированных ранее больных, у 50-75 % этой категории больных развивается кишечная непроходимость с высокой летальностью. Консервативное лечение спаечной болезни малоэффективно, а после оперативных вмешательств рецидивы встречаются у 3271 % пациентов, смертность составляет от 13 до 55 %.

Для доказательства индивидуальной предрасположенности части оперированных к патологическому спайкообразованию, а также разработки прогнозирования его развития мы сконструировали экспериментальную модель спаечного процесса.

Предварительно для извлечения спаечного антигена необходимо получить спайки из брюшной полости животных. Для этого под наркозом 5 животным выполняли лапаротомию с соблюдением правил асептики, десерозировали тонкую и толстую кишки марочным способом по 10-20 участков размерами 0,5x1 см. Операционную рану передней брюшной стенки ушивали 2-рядным шелковым швом. Через 65-70 дней после операции животных выводили из эксперимента, вскрывали брюшную полость и иссекали образовавшиеся спайки.

Спайки ополаскивали в 0,9%-м растворе хлорида натрия, тщательно растирали с кварцевым песком с добавлением 3%-го раствора хлорида натрия и далее извлекали спаечный антиген последовательными манипуляциями, представленными на рис. 1.

Для получения иммунной сыворотки против спаечного аутоантигена 5 животным вводили парэнте-рально увеличивающиеся дозы антигена на фоне им-муномодуляторов (таблица).

Способ гипериммунизации заключается в следующем: 10 морским свинкам (внутримышечно) вводили спаечный аутоантиген, одновременно внутримышечно (в/м) в качестве иммуномодулятора инъецировали тималин, в третью инъекцию дополнительно вводили в/м циклофосфан. Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствует значительному повышению титров сывороточных антител за счет увеличения числа антителобразующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелперных Т-клеток. Циклофосфан, являясь классическим иммуносупрессором, также активирует макрофаги, стимулируя фагоцитарную, цитотоксиче-скую и супрессивную (в отношении, главным образом, Т-лимфоцитов) функции. Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действиии иммуносу-

прессора - с другой, служат оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других. При таком способе продолжительность цикла иммунизации составила 27-30 дней.

Через 7-10 дней после последней инъекции антигена у животных пробно брали кровь, отделяли сыворотку, оценивали антителообразование в реакции им-мунодиффузии в агаровом геле (РИД) по О. Оухтерло-ни. Для этого готовили 1%-й агар «Дифко» на 0,9%-м растворе хлорида натрия (с добавлением азида натрия 1:10000), остуждали его до 50-60 оС и наливали 1520 мл агара в чашки Петри, установленные строго горизонтально. После того, как агар остынет, пробником (диаметром 3-5 мм) или специальным шаблоном в агаре вырезали лунки на расстоянии 3-5 мм друг от друга, удаляли из лунок агаровые «пробки». Антисыворотку раститровывали в физиологическом растворе с шагом 1:2 - 1:64. В центральную лунку вносили до ее краев аутоантиген, а в периферические - разведения антисыворотки. Закрывали чашку крышкой и помещали в термостат при температуре (37±1) оС на 24 ч. После этого учитывали предварительный результат и, оставив чашки при комнатной температуре еще на 24 ч, - окончательный.

Антигены и антитела, диффундируя из лунок, встречаются и образуют столько линий преципитации, сколько соответствующих пар антиген-антитело имеется в исследуемой системе. За титр специфических антител принимали то последнее разведение антисыворотки, где визуально определяется линия преципитации. Титр иммунной сыворотки в РИД, пригодной для использования в экспериментах, должен быть не ниже 1:16.

Для моделирования иммунного поражения брюшины экспериментальным животным через каждые 3 дня пятикратно внутривенно вводили гипериммунную антиспаечную сыворотку (АСС) в дозе 0,5 мл/кг массы (вводить медленно. Обратить внимание на возможность анафилактического шока).

Через 15 дней после последней инъекции АСС животным выполняли лапаротомию и проводили аппликацию фиксированного спаечного антигена. С этой целью антиген иммобилизировали на поверхности сорбента - аэросила А-380 по следующей методике: 100 мг аэросила А-380 суспендировали в 5 мл ФСБ, добавляли 0,1 мл вторичного алкилсульфата натрия («Прогресс»), вносили 10 мл спаечного антигена (с концентрацией белка 4,5±0,5 мг/мл) и 4 ч перемешивали при комнатной температуре. После этого суспензию помещали в холодильную камеру при температуре (5±1) оС на 18-20 ч и дважды отмывали 0,9%-м раствором №С1 центрифугированием при 4000g 20±5 мин.

Растирание спаек кварцевым песком в 3%-м растворе NaCl

Экстракция ткани спаек в 3%-м растворе №С124 ч при температуре (5±1) 0С

Центрифугирование 4000 g (30±5) мин

Рис. 1. Схема получения водорастворимого спаечного аутоантигена Схема иммунизации животных для получения иммунной сыворотки против спаечного аутоантигена

№ Интервалы меж- Концентрация Способ вве- Тималин Циклофосфан

ду инъекциями, антигена, мг/мл дения антиге- Концентрация, Способ Концентрация, Способ

сут на мг/мл введения мг/мл введения

1 - 0,1 в/м 5 в/м - -

2 3-4 0,15 в/м 5 то же - -

3 3-4 0,2 в/м 5 -«- 100 в/м

4 3-4 0,25 в/м 5 -«- - -

5 3-4 0,3 в/м 5 -«- - -

Патологические изменения возникали в брюшной полости у животных после такой операции через 1530 дней.

Через 20 дней после операции у 7 морских свинок на секции обнаруживали серозный экссудат до 7 мл, фибринозный налет и островки организующегося фибрина на петлях кишечника, распространенные сращения в брюшной полости (рис. 2).

Гистологически в большинстве случаев висцеральная брюшина значительно утолщена с разрастанием фибринозных волокон (1) и юной грануляционной ткани (2) (рис. 3).

Рис. 2. Сращения между петлями кишки и брюшиной

у I

Таким образом, разработанная экспериментальная модель спаечного процесса позволяет стабильно, до 70-75 % случаев, получать сращения в брюшной полости.

Последовательность манипуляций при моделировании экспериментального спаечного процесса в брюшной полости можно представить в виде схемы (рис. 4).

Рис. 3. Микрофото. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 16x7x1,1

Рис.4. Схема моделирования экспериментального спаечного процесса с иммунным поражением брюшины Ставропольская государственная медицинская академия_6 декабря 2006 г.