CC BY
46
УДК 633.11: 581.17
Л.П. Хлебова, И.А. Шлецер
Создание клеточных линий пшеницы, устойчивых к воздействию ионов никеля
Никель, относящийся к группе тяжелых металлов, является потенциальным токсикантом для человека и животных, а также одним из наиболее опасных загрязнителей растений, в том числе злаков [1]. Он способен накапливаться в зерновой биомассе, что сужает возможность получения экологически чистой продукции на территориях, загрязненных этим металлом. Плотные почвы Западной Сибири характеризуются широким диапазоном содержания никеля (12-100 мг/кг). Поступление его в почву с выбросами промышленных предприятий, при сгорании топлива, применении ряда агрохимикатов и т.д. имеет место в Алтайском крае [2].
Создание сортов, устойчивых к воздействию никеля, является слабо разработанным, но экологически и экономически безупречным способом решения данной проблемы. Открытие механизмов металлоус-тойчивости и наличие естественного полиморфизма по данному признаку позволяет надеяться на успех экспериментального конструирования толерантных генотипов, формирующих экологически чистую товарную часть продукции.
Перспективным направлением селекции новых сортов является их введение в культуру с целью индукции сомаклональных вариантов. Сомаклональные вариации возникают вследствие цитогенетической изменчивости клеток, а их частота на три порядка превышает частоту спонтанных мутаций. Регенеранты, полученные из таких сомаклонов, отличаются от исходного растения не только качественными моногенными, но и количественными полигенными признаками, в том числе по устойчивости к абиотическим факторам [3].
Добавление в питательные среды различных селективных агентов, имитирующих воздействие неблагоприятных факторов, создает провокационный фон и позволяет проводить целенаправленный отбор устойчивых клеточных клонов, а впоследствии - рас-тений-регенерантов.
Практический интерес представляет получение и отбор в культуре ткани клеточных вариантов пшеницы, резистентных к воздействию ионов никеля. Целью настоящего исследования явилась отработка элементов технологии создания клеточных линий, резистентных к воздействию ионов никеля. В задачу входило определение дозы селективного агента (уксуснокислый никель), эффективной для отбора устойчивого каллуса в культуре незрелых зародышей пшеницы in vitro.
Донорами незрелых зародышей служили 2 сорта твердой (Алтайская Нива, Алтайка) и 3 сорта мягкой (Алтайская 50, Новосибирская 67, Chinese Spring) яровой пшеницы, характеризующиеся различным индексом устойчивости к изучаемому металлу на уровне взрослых растений. Индекс устойчивости рассчитывался через отношение воздушно-сухой массы растений в опыте (вносится ион металла) к массе растений на контроле (без внесения загрязнителя). Кроме того, изучаемые сорта характеризуются различным накоплением никеля в зерновой части продукции: Алтайская 50 - 3,10 мг/кг; Новосибирская 67 - 2,33 мг/кг; Алтайка - 1,47 мг/кг; Алтайская Нива - 1,45 мг/кг [4].
В качестве селективной системы использовали среду Линсмайер-Скуга, содержащую различные концентрации ионов никеля: 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 10 мг/л в первом эксперименте и 0; 6; 8; 10; 12; 14; 20 мг/л во втором эксперименте. Таким образом, испытывалось 8 вариантов сред в первом опыте, 6 вариантов во втором опыте и контроль, не содержащий селективного агента. Поллютант вносили в инициирующую питательную среду в виде уксуснокислой соли. Объем пассирования эксплантов составил 4269 шт. Эксперимент выполнен в четырех повторностях. В ходе эксперимента определяли показатели: число каллусов на эксплант, вес сырого каллуса. Статистическую обработку данных проводили методом двухфакторного дисперсионного анализа [5].
В таблицах 1 и 2 представлены результаты эксперимента по отбору in vitro клеточных клонов пшеницы, устойчивых к воздействию ионов никеля. В первом эксперименте питательная среда содержала различные концентрации ионов никеля от 0 до 10 мг/л (табл. 1). Следует отметить высокую интенсивность процесса каллусогенеза независимо от генотипических особенностей сортов на всех дозах селективного агента. Наблюдалось лишь незначительное варьирование признака в пределах от 89,1 до 100%. Контрольные значения у всех сортов составили 100%.
Количественной характеристикой клеточных линий в данном эксперименте служил вес сырой массы каллуса. В среднем по сортам на средах, содержащих никель, он изменялся от 136,8 до 248,7 мг в зависимости от концентрации агента. Существенное снижение признака по сравнению с контролем на 75-115 мг наблюдали начиная с дозы 8-10 мг/л.
биологические науки
Таблица 1
Частота каллусогенеза и вес сырого каллуса сортов пшеницы в зависимости от концентрации ионов никеля в питательной среде
Сорт Содержание ионов никеля в среде. мг/л
0 1 2 3 4 3 б В 10
Алтайка іОО.О 27О.З іОО.О 2б3.3 іОО.О 29і.б іОО.О 2Вб.і іОО.О 337.3 100.0 217.0 іОО.О і9З.В 9б.4 іЗі.б 96.4 97.4
Алтайская Нива іОО.О 2бб.3 9б.4 3О2.О іОО.О 2бО,3 100.0 301.1 ВЗ.4 32О.В іОО.О 373.2 іОО.О 2В7.В 100.0 262.0 97.3 233.4
Новосибирская б7 іОО.О 2і4.б ВВ.9 і44.В Вб.7 В9.З 94.4 123.4 100.0 173.1 100.0 166.0 іОО.О іі7,В 93.9 143.9 іОО.О і2б.б
Алтайская ЗО 100.0 133.0 іОО.О 2іЗ.В 7О.4 і74.В бб.7 і44,і 7О.В ібі.З ВО.З і4З.В 97.б іЗі.В іОО.О 4З.і 90.6 67.6
Среднее 100.0 226.1 96.3 233.3 В9.3 2О4.і 9О.3 23В.7 В9.і 24В.7 9З.і 223.3 99.4 іВВ.3 97.9 іЗі.2 9б.і і3б.В
Примечание. Здесь и далее: числитель - частота каллусогенеза, %; знаменатель - вес сырого каллуса, мг.
Таким образом, в данном эксперименте не удалось определить летальную дозу ионов никеля, полностью ингибирующую индукцию каллуса в культуре незрелых зародышей. Для ее уточнения был выполнен эксперимент с более высокими концентрациями пол-лютанта (табл. 2). Количественной характеристикой клеточных линий в данном эксперименте также служил вес сырой массы каллуса. В среднем по сортам на средах, содержащих никель, он изменился от 44,4 до 154,3 мг в зависимости от концентрации агента. Существенное снижение признака по сравнению с контрольным вариантом наблюдали также начиная с дозы 8-10 мг/л. Летальный эффект каллусообразова-ния даже при столь высоких концентрациях поллютан-та (20 мг/л) не был достигнут, однако на дозах выше 10 мг/л каллус представлял собой рыхлую обводненную массу клеток, что говорит о его неморфогенности, то есть неспособности дать растения-регенеранты.
Дисперсионный анализ свидетельствует о незначительной роли генотипа в реализации каллусообразова-
тельных потенций на различных дозах селектирующего фактора - уксуснокислой соли никеля. Фактическое значение F-критерия по фактору «генотип» оказалось статистически незначимым (табл. і) либо значимым при уровне 3% (табл. 2). Данные дисперсионного анализа подтверждают достоверность наблюдаемых различий по признаку «вес сырого каллуса» как по генотипам, так и по концентрациям никеля.
Сравнение сортов, принадлежащих к разным группам устойчивости in vivo, на уровне растений. и in vitro, на уровне клеток, показало взаимосвязь между содержанием никеля в зерне и весом сырого каллуса. Сорта Алтайка и Алтайская Нива на уровне растений обладают низким накоплением никеля (і,47 мг/кг и і,43 мг/кг соответственно) и на уровне клеток также проявляют высокую устойчивость к действию металла. Алтайская ЗО характеризуется высоким накоплением никеля на уровне растений и низкой способностью к пролиферации каллуса in vitro на средах, содержащих высокие дозы данного металла. Это позволяет
Таблица 2
Частота каллусогенеза и вес сырого каллуса сортов пшеницы в зависимости от концентрации ионов никеля в питательной среде
Сорт Содержание ионов никеля в среде. мг/л
0 б В 10 12 і4 20
Алтайка іОО.О іОО.О 9В.3 9В.3 9В.З 9В.3 9б.б
2О9.3 79.3 37.9 39.3 4б.2 33.9 33.і
Алтайская Нива іОО.О іОО.О іОО.О іОО.О іОО.О іОО.О 9В.3
23О.4 2б2.В і93.2 4і.4 4і.3 б3.3 Зб.О
Новосибирская 67 іОО.О іОО.О іОО.О іОО.О іОО.О іОО.О іОО.О
і97.4 ібі.9 ііО.2 і3О.3 іОЗ.9 93.2 73.7
Алтайская 50 іОО.О іОО.О іОО.О іОО.О 9В.2 іОО.О іОО.О
іЗб.9 і2О.О 73.б 47.4 З2.і б3.2 2В.4
Chinese Spring іОО.О іОО.О 9В.3 9В.З 9В.2 іОО.О 9б.7
і24.4 і47.3 і2і.2 7б.В Зі.7 9.В 2б.7
Среднее іОО.О іОО.О 99.3 99.4 99.О 99.7 9В.3
іВ3.7 і34.3 іО7.2 б7.і 39.4 33.і 44.4
прогнозировать реакцию клеточных структур на содержание в питательной среде тяжелых металлов в зависимости от реакции исходного сорта in vivo.
Сравнение результатов воздействия никеля на изучаемые признаки показывает, что генетические факторы, ответственные за индукцию и пролиферацию каллуса, независимы. Определенная концентрация поллютанта может заблокировать работу одной системы, однако оказаться недостаточно жесткой для другой (например, сорта Алтайская Нива и Chinese Spring). В результате, не достигнув летального эф-
фекта каллусообразования, мы имеем возможность определить дозу ионов никеля, существенно ингибирующую пролиферацию клеточных линий.
Таким образом, можно сделать вывод, что доза селективного агента (уксуснокислый никель), эффективная для отбора резистентного каллуса в культуре незрелых зародышей пшеницы, находится в пределах не ниже 8-10 мг/л питательной среды. Рост каллусных клеток пшеницы in vitro, на средах, содержащих ионы никеля, зависит от способности сорта накапливать поллютант на уровне растения in vivo.
Библиографический список
1. Тихомиров, Ф.А. Действие никеля на растения на дерново-подзолистой почве / Ф.А. Тихомиров, Н.Н. Кузнецова, Л.Г. Малинина // Агрохимия. - 1987. - №8.
2. Гамзикова, О.И. Изменение устойчивости пшеницы к тяжелым металлам / О.И. Гамзикова, В.С. Барсукова // Доклады РАСХН. - 1996. - №2.
3. Егорова Т.А., Основы биотехнологии / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. - М., 2003.
4. Барсукова, В.С. Физиолого-генетические аспекты устойчивости растений к тяжелым металлам / В.С. Барсукова. - Новосибирск, 1997.
5. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М., 1990.
