CC BY
0И.С. Хамагаева, д-р техн. наук, проф., e-mail: ikhamagaeva@mail.ru А.Г. Хантургаев, канд. техн. наук, доц., e-mail: aavn@mail.ru О.Г. Богданова, канд. техн. наук, доц., e-mail: olga.bogdanova2001@gmail.com Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, г. Улан-Удэ
УДК 57.083.133
СОЗДАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ФОРМЫ СУХОГО СИНБИОТИКА
Предложен принципиально новый метод иммобилизации бифидобактерий при их непосредственном культивировании в питательной среде с адсорбентом - кедровым шротом. Подобраны условия ферментации кедрового шрота закваской бифидобактерий. Установлено, что кедровый шрот обладает пребиотическими свойствами и стимулирует рост бифидобактерий. Установлена высокая выживаемость иммобилизованных на кедровом шроте бифидобактерий при лиофильной сушке ферментированного шрота и в процессе длительного хранения. В результате проведенных исследований сконструированы сухие формы иммобилизованных синбиотиков, содержащих в качестве пробиотика - бифидобактерии, а пребиотика - кедровый шрот, который является уникальным природным источником биологически активных веществ.
Ключевые слова: бифидобактерии, кедровый шрот, биологически активная добавка, иммобилизация, адгезия.
I.S. Khamagaeva, Dr. Sc. Engineering, Prof.
A.G. Khanturgaev, Cand. Sc. Engineering, Assoc. Prof.
O.G. Bogdanova, Cand. Sc. Engineering, Assoc. Prof.
CREATING AN IMMOBILIZED FORM OF DRY SYNBIOTIC
A fundamentally new method is proposed for immobilizing bifidobacteria when they are directly cultivated in a nutrient medium with an adsorbent, cedar meal.The fermentation conditions of cedar meal with the ferment of bifidobacteria were selected. It has been established that cedar meal has prebiotic properties and stimulates the growth of bifidobacteria. The high survival rate of bifidobacteria immobilized on cedar meal during freeze drying offermented meal and during long-term storage has been established. As a result of the research, dry forms of immobilized synbiotics containing bifidobacteria as a probiotic and cedar meal, which is a unique natural source of biologically active substances, as a prebiotic are designed.
Key words: bifidobacteria, cedar meal, dietary supplement, immobilization, adhesion.
Введение
Создание пробиотиков на основе бифидобактерий, которые при попадании в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) быстро адаптируются, возобновляют активный метаболизм, рассматривается как стратегическое направление медицины при профилактике болезней и восстановлении здоровья человека и животных [1]. В настоящее время рынок продуктов, обладающих про- и пребиотическими свойствами, активно расширяется. На основе бифидобактерий получают не только традиционные кисломолочные продукты, но и мороженое и другие пищевые продукты [2].
Одной из важных проблем использования пробиотических препаратов является потеря жизнеспособности бифидобактерий при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды или в агрессивной среде желудка, а также в процессе хранения.
В связи с этим приоритетной технологической задачей, имеющей коммерческую значимость, является повышение устойчивости бифидобактерий в пробиотических препаратах путем иммобилизации клеток. Иммобилизированные клетки приобретают большую устойчивость к стрессовым факторам, дольше сохраняют жизнеспособность и могут использоваться с большей эффективностью в лечебных и пищевых препаратах [3].
Известны многочисленные эффективные лечебные препараты в сухой форме, созданные адсорбцией молочнокислых и бифидобактерий на частицах с высокой сорбционной активностью, таких как уголь, различные биоволокна. В России создан ряд иммобилизованных про-биотиков: «Бифидумбактерин форте», «Флорин форте», «Экофлор» и др. В качестве сорбционной составляющей в основном используются активированные угли и углеродоминеральный сорбент [4].
Завершающей стадией технологий получения таких препаратов является процесс иммобилизации выращенных клеток бифидо- и молочнокислых бактерий на сорбционном носителе, в результате которой часть бактерий гибнет [5].
В отличие от известных способов предлагается принципиально новый метод иммобилизации бифидобактерий при их непосредственном культивировании в среде с твердым субстратом - адсорбентом, кедровым шротом. В данном случае размножение клеток бифидобактерий будет проходить не в суспензии, а на поверхности субстрата, что должно повысить степень стрессоустойчивости при воздействии различных неблагоприятных факторов. Кедровый шрот характеризуется высоким содержанием белков, углеводов, минеральных и других биологически активных веществ, имеет высокий химический потенциал и может рассматриваться в качестве сырьевого источника для производства широкого ассортимента продуктов функционального питания.
Целью данной работы является разработка технологии получения биологически активной добавки (БАД) с синбиотическими свойствами путем гетерофазного культивирования би-фидобактерий в среде с твердой фазой, кедровым шротом.
Материалы и методы
Объектами исследований служил кедровый шрот - белково-углеводный остаток, полученный при извлечении кедрового масла из семян сосны сибирской (кедровых орехов) экстракцией этиловым спиртом в электромагнитном поле сверх высоких частот (ЭМП СВЧ) ТУ 9146-032-02069473-2002, штамм бифидобактерий Bifidobacterium longumB379M, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика, активизированный биотехнологическим методом, разработанным в ВСГУТУ [6].
О жизнеспособности бифидобактерий судили по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве клеточных суспензий из соответствующих разведений на среду ГМК [7].
Численность адгезированных клеток определяли после десорбции частиц шрота как разницу между общим числом клеток и числом клеток в культуральной жидкости. Десорбцию клеток проводили методом трипсинизации, добавляя к гетерофазной культуре трипсин 200 ед./мл культуральной жидкости, с последующей выдержкой в течение 15 мин при температуре 37°С.
Устойчивость бифидобактерий определяли после замораживания и лиофильной сушки и длительного хранения клеточных суспензий с последующим подсчетом числа КОЕ.
Все опыты проводили в 3-кратной повторности. Полученные данные обработаны с использованием пакета статистических программ Excel с использованием критерия Манна -Уитни. Обсуждаются статистически достоверные различия при р< 0,05.
Результаты и обсуждение
При создании БАД в последние годы отдается предпочтение использованию натурального сырья. Одним из интересных материалов для иммобилизации клеток бифидобактерий является кедровый шрот, потенциальные возможности которого раскрыты не полностью и могут быть расширены при создании современных биологически активных добавок.
Ранее при исследовании химического состава кедрового шрота, полученного методом СВЧ-экстракцией этиловым спиртом, установлено, что он характеризуется высокой пищевой и биологической ценностью [8].
Кроме того, биологическая обработка шрота позволит повысить усвояемость белков, подвергнутых воздействию денатурирующих факторов, и минеральных веществ.
Для получения субстрата кедровый шрот увлажняли двумя способами: молоком и водой. Одним из условий развития микроорганизмов является наличие в среде свободной влаги. Поэтому было исследовано влияние степени увлажнения кедрового шрота на динамику кислото-образования и рост бифидобактерий.
Увлажнение кедрового шрота осуществляли двумя способами: обезжиренным молоком и водой. После достижения определенной влажности в шрот вносили 5% закваски бифидобак-терий. Результаты исследований представлены на рисунке 1.
Л
н о о Я н
о «
о 8 И
3
Е ш
£ Я
н
70
60
50
40
30
20
10
4/ ' з / 2 / 1
8 10 Время, ч
0
2
4
6
Рисунок 1 - Влияние степени увлажнения кедрового шрота обезжиренным молоком
на динамику кислотообразования:
1 - увлажнение до 30%; 3 - увлажнение до 50%;
2 - увлажнение до 40%; 4 - увлажнение до 60%
Данные, представленные на рисунке 1, показывают, что с увеличением степени увлажнения повышается кислотообразующая способность. Интересен тот факт, что такая же динамика кислотообразования наблюдается и при увлажнении шрота водой. Это свидетельствует о том, что кедровый шрот является хорошей питательной средой для развития бифидобакте-рий и без молочной основы.
Бифидобактерии начинают развиваться в первые часы культивирования и через 6-8 ч количество клеток составляет 1010 КОЕ в 1 г и различается в образцах, в зависимости от влажности, только титром бифидобактерий (рис. 2). С учетом дальнейшего гранулирования ферментированной БАД оптимальным является увлажнение шрота до массовой доли влаги 40%.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что шрот кедрового ореха обладает би-фидогенными свойствами и стимулирует рост бифидобактерий. В наших исследованиях факт адгезии бифидобактерий на твердых носителях кедрового шрота подтверждается высокой популяцией клеток бифидобактерий - 1010 КОЕ/г в ферментированном продукте (см. рис. 2).
я
8 «
о н
к л
о
12
10
9
Время, ч
Рисунок 2 - Развитие бифидобактерий в процессе ферментации кедрового шрота:
— при увлажнении водой
- при увлажнении молоком
Таким образом, методом увлажнения кедрового шрота водой создана гипоаллергенная питательная среда, не содержащая лактозы и белков молока и обеспечивающая активный рост бифидобактерий.
В настоящее время сублимационная сушка является наиболее прогрессивным методом обезвоживания, который обеспечивает максимальное сохранение и наилучшую восстанавливаемость при гидратации высушенных продуктов. Кроме того, сублимированные продукты в соответствующей упаковке можно сохранить длительное время без существенных изменений их качества.
В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали возможность сохранения качества ферментированного кедрового шрота в процессе длительного хранения.
Температурный режим сушки выбирали с учетом термоустойчивости бифидобактерий. Начальная температура сушки замороженного ферментированного шрота составляла минус 18°С, досушивание проводили при 40-45°С. Продолжительность сушки контролировали по остаточной влажности (не более 5%). Сухой ферментированный шрот оценивали по следующим показателям: остаточная влажность, растворимость, количество жизнеспособных клеток бифидобактерий.
Высушиванию подвергали два варианта ферментированного шрота: с защитной средой и без нее. Установлено, что более высокая выживаемость бифидобактерий (90%) наблюдается при использовании защитной среды. Без защитной среды также сохраняется высокая выживаемость клеток, составляя 86%. Поэтому предложен более экономичный способ подготовки ферментированного шрота без защитной среды.
Как показали исследования, иммобилизация бифидобактерий, высокое содержание углеводов и белков, которые являются естественными криопротекторами, полностью защищают бифидобактерии от необратимых изменений в процессе замораживания и высушивания, и, вероятно, этим можно объяснить высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий в сухом ферментированном шроте.
8
6
4
2
0
2
4
8
Выживаемость бифидобактерий зависит от количества оставшейся внутриклеточной воды и равномерности обезвоживания. А это, в свою очередь, находится в прямой зависимости от продолжительности высушивания. Установлено, что оптимальные значения остаточной влажности 5 % и количество клеток бифидобактерий (8-9)-109 КОЕ в 1 г наблюдались через 56 ч сушки. Качественная характеристика биологически активной добавки представлена в таблице.
Таблица
Качественная характеристика БАД
Показатель БАД при увлажнении шрота молоком БАД при увлажнении шрота водой
Внешний вид сухие пористые гранулы размером 10-20 мм сухие пористые гранулы размером 10-20 мм
Вкус и запах чистый, кисломолочный с выраженным привкусом кедрового ореха чистый, с привкусом кедрового ореха
Цвет кремовый кремовый
Массовая доля влаги, % 4 ± 0,6 4 ± 0,5
Гидрофильность, % 80 ± 1 82 ± 2
Количество клеток бифидобактерий, КОЕ/г, не менее (9-10)-109 (8-9)-109
Бактерии группы кишечных палочек в 2,0 г отсутствуют
E. coli в 5,0 г отсутствуют
S. aureus в 2,0 г отсутствуют
Плесени в 10 г отсутствуют
Дрожжи в 10 г отсутствуют
Как следует из данных таблицы, увлажнение молоком и последующая ферментация повышают органолептические свойства готового продукта. Высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий придает БАД дополнительные свойства - пробиотика, регулирующего состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.
На основании проведенных исследований создана комплексная БАД - «синбиотик», включающая пробиотик - бифидобактерии и пребиотические вещества - пищевые волокна, полисахариды и олигосахариды, а также микронутриенты, содержащиеся в кедровом шроте.
Известно, что действие синбиотиков основано на синергизме комбинаций пробиотиков и пребиотиков, за счет которого наиболее эффективно не только имплантируются вводимые микроорганизмы (пробиотики) в желудочно-кишечный тракт хозяина, но и стимулируется его собственная микрофлора.
Известно, что повреждение клеток и инактивация части микробной популяции происходит не только во время обезвоживания, но и при хранении сухих продуктов.
В связи с этим проведена оценка сухого ферментированного шрота в процессе хранения по таким показателям, как количество жизнеспособных клеток и влажность.
Анализу был подвергнут сухой ферментированный шрот, заложенный на хранение в течение 12 мес при температуре 4-6°С. Одним из важных показателей резистентности клеток при хранении является их количество или выживаемость. Данный показатель зависит от остаточной влажности и условий хранения продукта. Изменение количества клеток бифидобакте-рий в процессе хранения показано на рисунке 3.
л н о о
и й и
к *
т
100
95
90
85
80
75
70
4 ^
л" н о о
К
*
й
3 т
2 12
Время, мес.
Рисунок 3 - Выживаемость бифидобактерий при хранении БАД
Анализ полученных данных показал, что показатель выживаемости коррелирует со значениями массовой доли влаги сухого ферментированного шрота. Коэффициент корреляции составляет 0,95. Функциональная зависимость рассматриваемых величин имеет следующее математическое выражение:
у = (-0,029x2 - 0,1^ + 7,27) * 1010, где у - выживаемость клеток бифидобактерий, %; х - влажность препарата, %.
Полученные данные свидетельствуют о том, что по истечении 6 мес. хранения количество клеток в концентрате уменьшилось на 9,8%. При дальнейшем хранении отмечалось снижение количества клеток и через 12 мес. хранения показатель выживаемости составил 80,4% (рис. 3).
Однако абсолютное значение жизнеспособных клеток бифидобактерий осталось на высоком уровне - 7-109 КОЕ в сухом ферментированном шроте, полученном при увлажнении молоком, и 5-109 КОЕ - при увлажнении водой. Через 12 мес. эти значения снизились до 3-109 и 2-109 КОЕ соответственно (рис. 4).
Высокая выживаемость клеток бифидобактерий в процессе технологической обработки и при хранении обусловлена иммобилизацией бифидобактерий, которые при культивировании в кедровом шроте адгезируются на поверхности пищевых волокон и формируют структурированное микробное сообщество, что снижает их чувствительность к экстремальным условиям роста. Известно, что адгезия на твердых поверхностях является универсальной реакцией, повышающей защищенность микроорганизмов при неблагоприятных условиях, например в желудочно-кишечном тракте, они быстро адаптируются и возобновляют активный метаболизм [9].
Таким образом, продемонстрирована возможность гетерофазного культивирования бифидобактерий на кедровом шроте. Установлено, что иммобилизация бифидобактерий на кедровом шроте способствует повышению стрессоустойчивости бифидобактерий при технологической обработке и сохраняет в жизнеспособном состоянии клетки при длительном хранении.
5
3
6
9
Время, мес.
Рисунок 4 - Изменение количества клеток бифидобактерий в процессе хранения: — сухой ферментированный шрот, полученный увлажнением молоком;
I I — сухой ферментированный шрот, полученный увлажнением водой
Полученные результаты согласуются с известной способностью бифидобактерий закрепляться и образовывать микроколонии на поверхности частиц пищи при их прохождении через желудочно-кишечный тракт, что облегчает бактериям потребление питательных веществ [10].
Связывание бифидобактерий с носителем благодаря специфическим адгезинам было показано на примере адгезии бифидобактерий на гранулированных частицах крахмала [11].
Выводы
В результате проведенных исследований сконструированы сухие формы иммобилизованных синбиотиков, содержащих в качестве пробиотика бифидобактерии, а пребиотика -кедровый шрот, который является уникальным природным источником биологически активных веществ.
Доказана высокая биохимическая активность бифидобактерий при ферментации кедрового шрота, что свидетельствует о его пребиотических свойствах.
Выбраны оптимальные технологические параметры получения БАД, обеспечивающие высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий в готовом продукте.
Установлена высокая выживаемость иммобилизованных на кедровом шроте бифидобак-терий при лиофильной сушке ферментированного шрота и в процессе длительного хранения.
Создание и внедрение в повседневную жизнь разработанных синбиотиков открывают широкие перспективы для обеспечения специального контингента, работающего в экстремальных условиях функциональными продуктами: спортсменов, военнослужащих, а также людей, находящихся в длительных экспедициях на Крайнем Севере.
Библиография
1. Weichselbaum E. Probiotics and health: a review of the evidence // Nutr. Bull. - 2009. -Vol. 34. -P.340—373.
2. Grosso C.R.F., Favaro-Trindade C.S. Stability of free and immobilized Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in acidified milk and of immobilized B. lactis in yoghurt // Braz. J. Microbiol. - 2004. - Vol. 35. - P. 151—156.
3. Aslim B., Alp G. The effect of immobilization on some probiotic properties of Streptococcus thermophilus strains // Ann. Microbiol. - 2009. - Vol. 59, N 1. - P. 127-132.
4. Иванова В.В. Комплексный подход к восстановлению микрофлоры. Современный взгляд на коррекцию дисбиозов / под ред. А.В. Молокеева. - Новосибирск: Изд-во «Вектор-БиАльгам», 2007. -48 с.
5. Guergoletto K.B., MagnaniaM., SanMartinb J. et al. Survival of Lactobacillus casei (LC-1) adhered to prebiotic vegetal fibers // Innov. Food Sci. Emerg. Technol. - 2010. - Vol. 11, N 2. - P. 415-421.
6. Хамагаева И.С. Научные основы биотехнологии кисломолочных продуктов для детского и диетического питания: монография. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005. - 279 с.
7. Khamagaeva I.S., Tsybikova A.H., Zambalova N.A. et al. Producing of bacterial concentrates with high cholesterol lowering activity // Foods and Raw Materials, Kemerovo Institute of Food Science and Technology. - 2016. - Vol. 4, N 1. - Р. 27-35.
8. Khanturgaev A.G., Zambalova N.A., Boiarineva I.V. et al. Creating a biologically active supplement with synbiotic properties // Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. - India. - 2018. - Vol. 10 (7).
- Р.1683-1687.
9. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40, № 4. - С. 387-397.
10. MacFarlane S., MacFarlane G.T. Composition and Metabolic Activities of Bacterial Biofilms Colonizing Food Residues in the Human Gut // J. Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72, N 9. -P. 6204-6211.
11. Crittenden R., Laitila A., Forssell P. et al. Adhesion of Bifidobacteria to Granular Starch and Its Implications in Probiotic Technologies // J. Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, N 8. - P. 3469-3475.
Bibliography
1. Weichselbaum E. Probiotics and health: a review of the evidence // Nutr. Bull. - 2009. -Vol. 34. -P. 340-373.
2. Grosso C.R.F., Favaro-Trindade C.S. Stability of free and immobilized Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in acidified milk and of immobilized B. lactis in yoghurt // Braz. J. Microbiol. - 2004.
- Vol. 35. - P. 151-156.
3. Aslim B., Alp G. The effect of immobilization on some probiotic properties of Streptococcus thermophilus strains // Ann. Microbiol. - 2009. - Vol. 59, N 1. - P. 127-132.
4. Ivanova V.V. An integrated approach to the restoration of microflora. The modern view on the correction of dysbiosis / Ed. A.V. Molokeev. - Novosibirsk: Publishing house «Vector-BiAlgam», 2007. -48 p.
5. Guergoletto K.B., Magnania M., San Martinb J. et al. Survival of Lactobacillus casei (LC-1) adhered to prebiotic vegetal fibers // Innov. Food Sci. Emerg. Technol. - 2010. - Vol. 11, N 2. - P. 415-421.
6. Khamagaeva I.S. Scientific principles of biotechnology of fermented milk products for children and diet: Monograph. -Ulan-Ude: ESSTU, 2005. - 279 p.
7. Khamagaeva I.S., Tsybikova A.H., Zambalova N.A. et al. Producing of bacterial concentrates with high cholesterol lowering activity // Foods and Raw Materials, Kemerovo Institute of Food Science and Technology. - 2016. - Vol. 4, N 1. - Р. 27-35.
8. Khanturgaev A.G., Zambalova N.A., Boiarineva I.V. et al. Creating a biologically active supplement with synbiotic properties // Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. - India, 2018. - Vol. 10 (7). -P.1683-1687.
9. Nikolaev Yu.A. Extracellular factors of adaptation of bacteria to adverse environmental conditions // Applied biochemistry and microbiology. - 2004. - Vol. 40, N 4. - P. 387-397.
10. MacFarlane S., MacFarlane G.T. Composition and Metabolic Activities of Bacterial Biofilms Colonizing Food Residues in the Human Gut // J. Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72, N 9. -P. 6204-6211.
11. Crittenden R., Laitila A., Forssell P. et al. Adhesion of Bifidobacteria to Granular Starch and Its Implications in Probiotic Technologies // J. Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, N 8. - P. 3469-3475.
