CC BY
10УДК 577.29
СОЗДАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, СТАБИЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ
DOI
Усатова В.С.1, Берестовой М.А.1, Мишина Н.М.3, Иваненко A.B.2, Джэппи Д.1, Розов А. В.1, Белоусов В.В.13
1 Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА, Москва, Россия;
2 Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия;
3 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
e-mail: usatova.v@fccps.ru
Аннотация. Создание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, стабильно экспрессирующих генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры Hyper7, SoNar и SypHer3s. Применение полученных клеточных линий в исследовании окислительно-восстановительных процессов при нейральной дифференцировке и моделировании ишемиче-ской патологии нервной системы.
Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры.
До появления технологии получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), моделирование процессов и заболеваний нервной системы человека было возможно только при использовании лабораторных животных, эффекты и закономерности полученные на которых часто не воспроизводились на человеке. Применение ИПСК человека позволило получать не только видоспецифичный материал, но и сохранять геномные особенности конкретных доноров. Однако для решения ряда фундаментальных и прикладных задач с использованием ИПСК человека, порой недостаточно применения стандартных лабораторных методов, на-
пример, исследования, в которых требуется динамический анализ биологических процессов в живой системе. В частности, к ним относятся окислительно-восстановительные процессы, которые играют ключевую роль в клетках любых организмов. Для возможности детального изучения данных процессов в режиме реального времени в живых клетках в настоящее время стали доступны генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры [1].
В данной работе мы разрабатывали подход для исследования внутриклеточных окислительно-восстановительных процессов в течение нейральной дифференцировки, а также на модели ишеми-ческой патологии нервной системы. Для этого с помощью CRISPR/ Cas9 системы мы создали несколько линий ИПСК человека, стабильно экспрессирующих генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры Hyper7 [2], SoNar [3] и SypHer3s [4], детектирующие ключевые показатели окислительно-восстановительных процессов — соотношение H2O2, NAD+/NADH, и pH соответственно.
В данной работе мы провели полную дифференцировку линии ИПСК-HyPer7 в нейральном направлении до получения функционально зрелых нейронов. В процессе дифференцировки мы проводили прижизненные наблюдения за изменением внутриклеточных окислительно-восстановительных параметров с помощью флуоресцентной микроскопии. Мы обнаружили, что на стадии получения нейральных предшественников происходит значительное повышение уровня продукции Н2О2 в цитоплазме большинства клеток по сравнению с клетками на предшествующих и последующих стадиях дифференцировки.
Далее мы исследовали возможность применения линии ИП-СК-HyPer7 в экспериментах по моделированию ишемической патологии нервной системы, характерной для человека. Для этого были получены нейро-глиальные органоиды человека, стабильно экспрессирующие Hyper7 с локализацией в цитоплазме. Моделью ишемии-реперфузии является изменение уровня кислорода в среде от pO2 150 мм рт.ст. до 5 мм рт.ст., с последующей реоксигенацией. Реализация требуемых условий осуществляли на экспериментальной установке, разработанной Кельмансон И.В. и др. [5], которая позволяет точно и быстро контролировать изменения уровня кислорода в среде в процессе флуоресцентной микроскопии живых органоидов. Мы обнаружили, что падение уровня кислорода в среде сопровождается изменением уровня Н2О2 в цитоплазме клеток в составе органоидов.
Таким образом, мы показали возможность использования линий ИПСК, стабильно экспрессирующих флуоресцентные сенсоры, для исследований внутриклеточных процессов в ходе дифференци-ровки, при моделировании патологий и в будущем создания системы высокопроизводительного скрининга химических веществ в качестве новых лекарственных препаратов.
Список литературы
1. Kostyuk A. I., Demidovich A. D., Kotova D. A. et al. Circularly Permuted Fluorescent Protein-Based Indicators: History, Principles, and Classification // International Journal of Molecular Sciences. 2019. V. 20. 4200.
2. Pak V. V., Ezerina D., Lyublinskaya O. G. et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function // Cell metabolism. 2020. V. 31, № 3. P. 642-653.
3. Zhao Y., Hu Q., Cheng F. et al. SoNar, a highly responsive NAD+/ NADH sensor, allows high-throughput metabolic screening of anti-tumor agents // Cell metabolism. 2015. V. 21, № 5. P. 777-789.
4. Ermakova Y. G., Pak V. V., Bogdanova Y. A. et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range // Chemical Communications. 2018. V. 54, № 23. P. 2898-2901.
5. Kelmanson I. V., Shokhina A. G., Kotova D. A. et al. In vivo dynamics of acidosis and oxidative stress in the acute phase of an ischemic stroke in a rodent model // Redox Biology. 2021. V. 48. 102178.
DEVELOPMENT AND APPLICATION OF HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS STABLY EXPRESSING GENETICALLY ENCODED FLUORESCENT SENSORS
Usatova V. S.1, Berestovoy M. A.1, Mishina N. M.3, Ivanenko A. V.2, Jappy D.1, Rozov A. V.1, Belousov V. V.13
1 Federal Center of Brain Research and Neurotechnologies of the Federal Medical Biological Agency, Moscow, Russia;
2 Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine of the Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia;
3 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, Russia e-mail: usatova.v@fccps.ru
Abstract. Development of human induced pluripotent stem cells stably expressing genetically encoded fluorescent sensors Hyper7, SoNar and SypHer3s. Application of the generated cell lines in the research of redox processes in neural differentiation and modeling of nervous system ischemia pathology.
Key words: human induced pluripotent stem cells, genetically encoded fluorescent biosensors.
