Дифференцировка в нейральном направлении пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от больных с наследственной формой спинальной мышечной атрофии Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА В НЕйРАЛьНОМ НАПРАВЛЕНИИ

пациент-специфичных индуцированных ПЛЮРИПОТЕНТНых стволовых клеток от больных с наследственной формой спинальной мышечной атрофии

Е.В. Гоигорьева 123, К.Р. Валетдинова123, Е.И. Устьянцева123, А.И. Шевченко123, СП. Медведев 123■4, Н.А. Мазурок123, М.А. Маретина5■6, М.Л. Куранова 7, А.В. Киселев 5, В.С. Баранов 5 6, С.М. Закиян12,3,4

1 ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН», Новосибирск, Россия

2 ФГБНУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН», Новосибирск, Россия

3 ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения РФ, Новосибирск, Россия

4 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия

5 ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия

6 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

7 ФГБНУ «Институт цитологии РАН», Санкт-Петербург, Россия

Neural differentiation of patient-specific induced pluripotent stem cells from patients with a hereditary form of spinal muscular atrophy

E.V. Grigor'eva 123, K.R. Valetdinova123, E.I. Ustyantseva 123, A.I. Shevchenko 123, S.P. Medvedev1234, N.A. Mazurok 123, М.А. Maretina 5 6, М.1.. Kuranova 7, A.V. Kiselev5, V.S. Baranov56, S.М. Zakian 1234

1 Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

3 State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Novosibirsk, Russia

4 National Research University Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia

5 The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott, Saint-Petersburg, Russia

6 Saint-Petersburg State University, Saint-Petersburg, Russia

7 Institute of Cytology of the Russian Academy of Science, Saint-Petersburg, Russia

Благодаря использованию индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток человека (ИПСК) появилась возможность моделирования процессов заболеваний, скрининга лекарственных средств и токсикологического скрининга, развития новых терапевтических подходов. Направленная дифференцировка ИПСК в узкоспециализированные виды клеток представляет уникальный инструмент для изучения и моделирования ряда заболеваний, поражающих специфические типы клеток. Одним из таких заболеваний является спинальная мышечная атрофия, которая вызывается мутациями в гене SMN1 (survival motor neuron gene 1), приводящими к избирательной гибели моторных нейронов. От больного с наследственной формой спинальной мышечной атрофии i типа получены пациент-специфичные ИПСК, экспрессирующие маркёры плюрипотентности (NANOG, TRA-1-60, SSEA4, 0CT4, KLF4, MYC, REX1 и другие). Спонтанная дифференцировка полученных линий вызвала появление производных трёх зародышевых листков: экто-, мезо- и энтодермы. Диф-ференцировка в нейральном направлении показала появление ранних нейральных маркёров (PAX6, S0X2, NESTiN, TuJ1, PSA-NCAM) и более поздних (MAP2, NF200, GFAP) маркёров зрелых нейронов, в том числе маркёров зрелых моторных нейронов (iSL1, CHAT). Нейроны, полученные из пациент-специфичных ИПСК представляют собой перспективную модель для изучения особенностей клеток, измененных при спинальной мышечной атрофии.

Ключевые слова: спинальная мышечная атрофия, пациент-специфичные индуцированные плюрипотент-ные стволовые клетки, дифференцировка в нейральном направлении.

e-mail: zakian@bionet.nsc.ru

induced pluripotent stem cells (iPSCs) give the possibility for disease modeling, drug and toxicology screening and development of the new therapeutic approaches. Directed differentiation of iPSCs into specialized cell types represents a unique tool in order to study and model certain diseases, which affects specific type of cells, in vitro. One of the typical example of such diseases is spinal muscular atrophy, which is caused by mutations in the SMN1 gene (survival motor neuron 1 gene), leading to selective death of motor neurons. Patient-specific iPSCs were derived from the patient with a hereditary form of spinal muscular atrophy i type and expressed the markers of pluripotency (NANOG, TRA-1-60, SSEA4, OCT4, KLF4, MYC, REX1, and others). Spontaneous differentiation of the obtained cells resulted in the appearance of derivatives of the three germ layers: ecto-, meso- and endoderm. Neural differentiation showed the appearance of the early neural markers (PAX6, SOX2, NESTiN, TuJ1, PSA-NCAM), the late mature neural markers (MAP2, NF200, GFAP), and the mature motor neurons' markers (iSL1 and CHAT). Neurons derived from patient-specific iPSCs are perspective model for studying the features of the cells, which are altered in spinal muscular atrophy.

Keywords: spinal muscular atrophy, patient-specific induced pluripotent stem cells, neural differentiation.

Введение

Дифференцировка индуцированных плюрипотент-ных стволовых клеток (ИПСК) человека в различные узкоспециализированные клетки имеет огромное значение для изучения заболеваний, затрагивающих какой-либо определённый вид клеток. К таким заболеваниям относятся, например, наследственные нейродегенеративные заболевания — спинальная мышечная атрофия (СМА) и боковой амиотрофиче-ский склероз, в основе которых лежит гибель моторных нейронов. Данный тип клеток представляет собой высокоспециализированные постмитотиче-ские нейроны, которые находятся в вентральных рогах спинного мозга и при помощи аксонов образуют нервно-мышечные связи с соматической мускулатурой для контроля их движения и поддержания мышечного тонуса. Генетической причиной развития СМА являются мутации в гене SMN1, причем более 90% пациентов имеют гомозиготную делецию седьмого и восьмого экзонов или только седьмого экзона данного гена [1]. Мутации в гене SMN1 приводят к недостатку в организме белка SMN, который критичен для выживания моторных нейронов передних рогов спинного мозга.

В зависимости от тяжести и времени начала проявления симптомов различают 4 типа СМА [2]. Наиболее тяжелой формой, проявляющейся в первые месяцы жизни, является i тип СМА, а менее выраженной по клиническому проявлению формой с дебютом во взрослом возрасте — СМА iV типа.

Дифференцированные производные ИПСК являются удобной модельной системой для изучения наследственных заболеваний человека и поиска средств их терапии [3, 4]. Однако важной проблемой при направленной дифференцировке ИПСК является получение гомогенной популяции, состоящей из большого количества узкоспециализированных клеток, что, зачастую, осложнено в связи с несовершенством лабораторных технологий. Кроме того, известно, что дифференцировка ИПСК человека в нейральном направлении значительно сложнее по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) человека. При одних и тех же условиях эффективность нейральной дифференцировки ИПСК заметно меньше, чем ЭСК, а неоднородность получаемой клеточной популяции больше [5]. Это осложняет процесс дифференцировки и получение популяций клеток определённого вида и приводит исследователей к поиску всё более эффективных и менее трудоёмких протоколов.

Материал и методы

Репрограммирование фибробластов

Линия фибробластов fISMA, полученная от пациента со СМА i типа, была предоставлена ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта». На 6 пассаже клетки данной линии были нуклеофицированы набором из шести эписомных векторов (Addgene iDs #41855-58, #41813-14), обеспечивающих экспрессию факторов репрограммирования [6, 7]. Нуклеофекцию проводили на приборе Nucleofector 2b Device (Lonza, Швейцария) c помощью набора реагентов Amaxa Human Normal Dermal Fibroblast Kit (Lonza, Швейцария) согласно рекомендациям производителя. За основу был взят коммерческий протокол Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit (https://tools.thermofisher.

com/content/sfs/manuals/epi5_episomal_ipsc_ reprogramming_man.pdf), с некоторыми модификациями представленный на рис. 1А.

Определение числа копий эписомных векторов, гена SMN2 и делеции в гене SMN1

Определение числа копий эписомных векторов в полученных линиях ИПСК проводили методом ПЦР в реальном времени [6]. Выявление делеции седьмого и восьмого экзонов гена SMN1 проводили с помощью ПЦР-ПДРФ анализа [8, 9], число копий гена SMN2 определяли с использованием технологии TaqMan [10].

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) человека в различные типы нейральных производных

Для получения нейральных производных использовали ранее опубликованный протокол [11]. Эмбриоидные тела (ЭТ) культивировали с 5 дня дифференцировки (дд) в среде для нейральной диф-ференцировки (НДС) с добавлением 5 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (StemCell, США). Для распластывания ЭТ на 15 дд использовали культуральный пластик покрытый матригелем без факторов роста (Growth Factor Reduced BD Matrigel Matrix; BD Biosciences, США) или Поли^-лизин/ла-минин (ПDЛ/ламинин) [12].

Направленная дифференцировка ПСК человека в мотонейроны

Для дифференцировки ПСК человека в мотонейроны использовали протокол [12] с модификациями. На 15 дд нейральные розетки механически переносили на агаризованные чашки Петри в НДС + 2 мкг/мл гепарина с добавлением 0,1 мкМ ретиноевой кислоты, 1x B27 (Gibco, США), 100 нг/мл SHH (R&D Systems, США). На 24 дд образовавшиеся ЭТ снимали для выделения РНК.

С целью получения более продвинутых стадий дифференцировки первые 29 дд клетки культивировали по протоколу с использованием НДС + bFGF. На 29 дд образовавшиеся нейральные трубки механически переносили на агаризованные чашки в НДС + гепарин, 1x B27, 10 нг/мл BDNF (PeproTech, Израиль), 200 нг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma, США), 0,1 мкМ ретиноевой кислоты. На 38 дд ЭТ повторно распластывали на чашки, покрытые ма-тригелем, на 45 дд проводили фиксацию клеток для дальнейшего ИФА.

Иммунофлуоресцентный анализ, гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы, выделение РНК и ОТ-ПЦР

ИФА, гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы, выделение РНК и ОТ-ПЦР выполняли согласно ранее описанным методикам [13, 14]. Список первичных антител, использованных для ИФА, приведен в табл. 1. Последовательности праймеров, использованные в ОТ-ПЦР, приведены в табл. 2. Визуализацию препаратов после ИФА проводили при помощи микроскопа Nikon eclipse Ti.

А

Б

В

¡5МА37 ¡5МА40 ¡ЭМАбЬ ПЭМА-ёб Клеточные линии

вМШ

200 пн

-*- 'тт

БМШ

122 пн +

78 пн Экзон 8

Рис. 1 СА—Г). Схема эксперимента по репрограммированию и характеристика полученных линий ИПСК: А — схема репрограмирования фибробластов с помощью эписом; Б — морфология и окраска на щелочную фосфатазу iSMA40, 3 пассаж, СМА i типа; В — анализ числа копий эписомных векторов в полученных линиях ИПСК; Г — ПЦР-ПДРФ анализ для подтверждения делеций 7 и 8 экзонов гена SMN1; число копий гена SMN2 в полученных линиях ИПСК

Г

д ж^х

Е

NANOG ОСТЗ/4

SOX2 KLF4 МУС

REX1 TDGF1

UTF1 DNMT3B LEFTB NODAL FGF4 PODXL

GAPDH

GAPDH (RT-)

3

Рис. 1 (Д-З).

Схема эксперимента по репрограммированию и характеристика полученных линий ИПСК: Д — ОТ-ПЦР анализ экспрессии маркёров плюрипотентнных клеток в линиях ИПСК; Е — иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров, участвующих в поддержании плюрипотентности ИПСК; Ж — ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов плюрипотентности OCT3/4, NANOG и маркёров дифференцированных производных в недифференцированных ИПСК iSMA и после их дифференцировки;

З — иммунофлуоресцентное выявление маркёров дифференцированных производных — мезодермы: aSMA (красный), CD31 (зелёный), Collageni (красный)/Т^гопесйп (зеленый); энтодермы: KRT18 (зелёный); эктодермы: NF200 (зелёный), TuJ1 (красный), (RT-) — негативный контроль реакции обратной транскрипции. Ядра докрашены DAPi (синий). Масштабный отрезок В, Е, З — 100 мкм

Таблица 1. Список использованных антител

Антитела Источник Каталожный номер Тип Рабочее разведение

SOX2 Cell Signaling 3579 IgG кролика поликлональные 1:500

D6D9 XP(R)

PAX6 Covance PRB-278P IgG кролика поликлональные 1:200

TuJ1 Abcam ab7751 IgG2a мыши моноклональные 1:100

NESTIN Abcam ab6142 IgG1 мыши моноклональные 1:400

PSA-NCAM Millipore AB5032 кролика поликлональные 1:200

GFAP Santa Cruse sc-9065 ^ кролика поликлональные 1:200

NF200 Sigma N4142 ^ кролика поликлональные 1:1000

MAP2 Abcam ab24640 IgG кролика поликлональные 1:1000

ISL1 Abcam ab20670 ^ кролика поликлональные 1:500

TRA-1-60 Abcam ab16288 IgM мыши моноклональные 1:200

SSEA-4 Abcam ab16287 ^ мыши моноклональные 1:50

NANOG Abcam ab62734 ^ мыши моноклональные 1:300

OCT4 BD Transduction Lab 611202 IgG мыши моноклональные 1:50

Collagen I Abcam ab34710 ^ кролика поликлональные 1:200

Fibronectin Abcam ab23750 IgG кролика поликлональные 1:500

KRT18 Millipore MAB3234 ^ мыши моноклональные 1:200

aSMA DAKO M0851 ^ мыши моноклональные 1:100

CD31 DAKO IR610 IgG мыши моноклональные 1:200

Таблица 2. Праймеры для ПЦР

Гены

Последовательность нуклеотидов, 5'-3'

Праймеры

PAX6

CHAT

GAPDH

ACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAG

ATGGTGAAGCTGGGCATAGGCGGCAG

GGAGGCGTGGAGCTCAGCGACACC

CGGGGAGCTCGCTGACGGAGTCTG

TGTTGCCATCAATGACCCCTT

CTCCACGACGTACTCAGCG

hPAX6-S1206

hPAX6-AS1497

hCHAT-S

hCHAT-AS

hGAPDH-S

hGAPDH-AS

Результаты

Получение и характеристика пациент-специфичных ИПСК

В результате эксперимента по репрограммирова-нию фибробластов ИБМА было получено семь стабильных линий ИПСК, из которых для продолжительного культивирования были отобраны три: ¡БМА37, ¡БМА40 и ¡БМА61_. Клетки данных линий имеют большое ядерно-цитоплазматическое соотношение, интенсивно пролиферируют, растут однослойными плоскими колониями, схожими по морфологии с ПСК человека, и экспрессируют эндогенную щелочную фосфатазу (рис. 1Б). По результатам ПЦР в реальном времени, на поздних пассажах (26—28 пассаж) в

двух линиях iSMA37 и iSMA40 наблюдается практически полная элиминация эписом — количество копий на клетку составляет 0,001 и 0,002, соответственно; в линии iSMA6L обнаружена встройка в геном — 2 копии на клетку (рис. 1В). Все три линии экспрессируют основные маркеры плюрипотентных клеток (рис. 1Д и 1Е). Анализ клеток, получившихся после культивирования эмбриоидных тел, показал наличие маркеров производных всех трех зародышевых листков: эктодермы (NF200, TuJ1, PAX6, MAP2, GFAP), мезодермы (aSMA, CD31, BRACHYURY) и энтодермы (Collageni, Fibronectin, KRT18, S0X17, F0XA2, AFP) (рис. 1Ж и 1З). Исследуемые линии ИПСК демонстрируют генотип пациента со СМА i типа: делеция 7 и 8 экзонов гена SMN1, три копии гена SMN2 (рис. 1Г).

Направленная нейральная дифференцировка

Для дифференцировки в нейральном направлении были выбраны две линии пациент-специфичных ИПСК iSMA (линии iSMA6L и iSMA40) и в качестве контроля ЭСК человека (линия HuES9). Известно, что при культивировании ПСК человека в среде для нейральной дифференцировки с добавлением только bFGF, происходит их дифференцировка в различные нейральные типы клеток, включая зрелые нейроны, астроциты, олигодендроциты [11].

На ранних стадиях нейральной дифференцировки в НДС с добавлением bFGF были обнаружены морфологические различия между ЭТ HuES9 и iSMA. ЭТ HuES9 образовывали сложные структуры, внутри которых мы наблюдали образование складчатых структур (рис. 2А1). Тогда как при культивировании ЭТ iSMA в НДС + bFGF на 7 дд формировались простые ЭТ, которые усложнялись к 11 дд, формируя прозрачные агрегаты причудливой формы (рис. 2А2). Таким образом, в суспензионных ЭТ можно было наблюдать раннюю стадию дифференцировки в ней-ральном направлении — формирование нейральных розеток, для которых способ и скорость формирования зависела от типа используемых клеток.

При распластывании ЭТ на матригель наблюдали значительное увеличение числа нейроэктодермаль-ных клеток, формирующих нейральные розетки (рис. 2Б1). Дальнейшее культивирование нейральных розеток приводило к пролиферации предшественников нейральных клеток в составе нейральных розеток и формированию нейральных трубок (рис. 2Б2 и 2Б3).

Также как и при культивировании в суспензии, была замечена разница в количестве нейральных розеток в зависимости от линии ИПСК, ЭТ iSMA6L образовывали существенно меньше розеток, по сравнению с iSMA40. Таким образом, различные линии ИПСК одного пациента демонстрируют линие-специфичные отличия по эффективности дифференцировки.

Было замечено, что сразу после распластывания ЭТ HuES9 на матригель, уже на 3 день формировались нейральные розетки, а также из ЭТ начинали вырастать длинные, тонкие отростки нейральных клеток (рис. 2В), экспрессирующие маркёры ранних нейронов PSA-NCAM, ТиЛ1 (или р-М!-тубулин), SOX2, что показано с использованием ИФА на 18 дд (рис. 2Г). Дальнейшее культивирование приводило к укрупнению отростков и появлению более зрелых маркёров нейрофиламента 200 (NF200), МАР2, а также маркёра мотонейронов ISL1 (рис. 2Д).

Рис. 2 (А-Г). Внешний вид ЭТ ПСК человека (линии НиЕБ9, iSMA6L, iSMA40) и ИФА НиЕБ9 в НДС + ЬРОР на разных стадиях дифференцировки:

А - ЭТ HuES9 на 13 дд в НДС + ЬРОР (А1), ЭТ iSMA6L на 11 дд в НДС + ЬРОР (А2); Б - распластанные на 15 дд ЭТ iSMA40 в НДС + ЬРОР через 3 дня формируют нейральные розетки (Б1), через 12 — нейральные трубки (Б2, Б3); В — нейральные клетки, вырастающие из ЭТ HuES9 на 3 день после распластывания; Г — ИФА ЭТ HuES9 на 18 дд демонстрирует экспрессию маркёров ранних нейронов PSA-NCAM (красный), ТиЛ1 (красный), SOX2 (зелёный).

Ядра докрашены ВДР! (синий). Масштабный отрезок: А — 500 мкм, Б—Г — 100 мкм

Рис. 2 (Д). Внешний вид ЭТ ПСК человека (линии HuES9, iSMA6L, iSMA40) и ИФА HuES9 в НДС + bFGF на разных стадиях дифференцировки:

Д — ИФА поздних маркёров нейральных клеток при распластывании ЭТ HuES9 на 25 дд в НДС + bFGF (Д1):

ТиЛ (красный), NF200 (зелёный), МАР2 (зелёный); объёмное изображение нейральных волокон,

экспрессирующих МАР2 и ТиЛ, снятое при помощи программы NiS-elements (Д2);

ИФА маркёра моторных нейронов iSL1 (красный; Д3).

Ядра докрашены □APi (синий). Масштабный отрезок — 100 мкм

Дифференцированные производные ИПСК iSMA при культивировании в НДС + bFGF на 18 дд демонстрировали экспрессию ранних нейральных маркёров SOX2, PAX6, PSA-NCAM, TuJ1 (рис. 3А), а на 29 дд были обнаружены продукты генов NF200, MAP2 и GFAP (рис. 3Б). Исследование экспрессии нейральных производных методом ОТ-ПЦР показало на 24 дд наличие продуктов как ранней нейральной дифференцировки — PAX6, так и транскрипта гена CHAT, являющегося маркёром зрелых моторных нейронов (рис. 3Г).

Альтернативным матриксом для культивирования ЭТ в распластанном состоянии является ПШЛ/лами-нин [11, 12]. Обнаружено, что на 42 дд при культивировании ЭТ iSMA на ПШЛ/ламинин образуются нейральные клетки с очень длинными отростками

(рис. 3В), что говорит о более эффективном созревании нейральных клеток, по сравнению с культивированием на матригеле.

Нейральная дифференцировка ИПСК iSMA в мотонейроны показала на 14 дд в культуре распластанных на матригель ЭТ iSMA экспрессию ранних нейральных маркёров SOX2, PAX6, TuJ1 (рис. 3Д). Тогда как ОТ-ПЦР анализ уже на 24 дд при культивировании в присутствии ретиноевой кислоты и SHH демонстрирует экспрессию одного из поздних маркёров зрелых моторных нейронов — гена CHAT (рис. 3Г). Также на поздних стадиях дифференцировки (45 дд) iSMA в моторные нейроны на фоне клеток, экс-прессирующих ранний нейральный маркёр NESTiN, обнаружен пул клеток с маркёрами зрелых нейральных производных GFAP, MAP2, iSL1 (рис. 3Е).

" rtrt V * 4 «ЛИ* 7j:f. 5äö ^в, - - ■

^штЩу Л Ы д., # •Tji^l*-'' - Д' : f.. f, fM* -^v^^^Sliv'i *'2'\f>

PSA-NCAM

ШШ0

' .-•У " • (Л*.

11SI

и." .о

О s

u. £

■2 ==

+ ^

О н

О и.

•Q +

О

ч

rSS^ V

X

S .0

а q

(В 0

с Ь

+ н

О ™

z

s л & ^

(С 0J

5 I

ч: es

is. ш х

(Э

Ё« +

° Я

ц 0Q

Рис. 3. ИФА и ОТ-ПЦР анализ маркёров нейральных производных на разных стадиях дифференцировки при культивировании ИПСК iSMA в присутствии bFGF (А—В), гепарина (Д, Е):

А — ранние нейральные предшественники S0X2 (красный), PSA-NCAM (красный), PAX6 (зелёный) и TuJ1 (красный) на 18 дд; Б — 29 дд — GFAP (зелёный), NF200 (зелёный), MAP2 (зелёный) и TuJ1 (красный); В — ИФА NF200 и MAP2 на 42 дд при культивировании на ПШЛ/ламинин; В2 демонстрирует выделенную область на В1; Г — ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов PAX6 и CHAT на 24 день дифференцировки iSMA в разных культуральных средах; Д — 14 дд — S0X2 (красный), PAX6 (зелёный) и TuJ1 (красный); Е - 45 дд - GFAP (зелёный), NESTiN (красный) MAP2 (красный), iSL1 (зелёный). Ядра докрашены DAPi (синий). Масштабный отрезок: А, Б, В2, B3, Д, Е — 100 мкм; В1 — 500 мкм. РК - ретиноевая кислота, АК - аскорбиновая кислота

Обсуждение

Для создания клеточной модели СМА нами получены ИПСК пациента с наследственной формой СМА i типа с гомозиготной делецией 7 и 8 экзонов гена SMN1. Полученные линии ИПСК демонстрируют морфологию ПСК человека, экспрессируют маркёры плюрипотентности и способны in vitro давать производные трех зародышевых листков. Поскольку при СМА гибнет конкретный тип клеток — моторные нейроны, следующим этапом работы была диффе-ренцировка полученных ИПСК в моторные нейроны. Однако, микроокружение нервных клеток, в частности клетки глии, также вносят вклад в патогенез ряда нейродегенеративных заболеваний. Так, например, показано, что в прогрессии бокового амиотро-фического склероза негативную роль играют астро-циты, вызывающие дегенерацию моторных нейронов [15]. Таким образом, мы провели дифференцировку в нейральном направлении, используя протокол для получения не только мотонейронов, но и других типов нейральных клеток, для контроля эффективности дифференцировки использовали ЭСК человека.

Нейральная дифференцировка показала, что наиболее эффективно данный процесс идёт в ЭСК, на которых отрабатываются большинство протоколов, что согласуется с ранее полученными данными [5]. При распластывании на матриксе матригель ЭТ HuES9 уже в первые дни мы наблюдали рост длинных тонких нитей, укрупняющихся по мере культивирования. Наличие экспрессии TuJ1, PSA-NCAM, MAP2, NF200 свидетельствует о том, что эти волокна относятся к нервным клеткам. Тогда как распластанные ЭТ iSMA на том же матриксе преимущественно образовывали нейральные розетки, крайне редко формируя отростчатые клетки, что говорит о более медленном процессе созревания нейраль-ных предшественников. Несмотря на то, что большую часть матригеля составляет ламинин (56%), дифференцировка ИПСК на ПШЛ/ламинин оказалась более успешна по сравнению с матригелем в отношении зрелых форм нейронов. На ПШЛ/ламинин обнаружены клетки с очень длинными отростками, позитивными при иммунофлуоресцентном окрашивании на NF200, который экспрессируется как в афферентных нейронах [16], так и в a-моторных нейронах [17], иннервирующих мышечные волокна скелетных мышц и напрямую ответственных за их сокращения. Показана солокализация NF200 с нейрон-специфичным белком MAP2, который участвует в регуляции функций нервных клеток, таких как си-наптическая пластичность, рост и гибель нейронов, а также стабилизирует микротрубочки в дендритах и аксонах постмитотических спинальных моторных нейронов [18].

Дифференцировка в нейральном направлении ИПСК iSMA в культуральной среде с добавлением

ЛИТЕРАТУРА:

1. Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. Модельные системы болезней двигательных нейронов — платформа для изучения механизмов патогенеза и поиска терапевтических средств. Acta Naturae 2015; 7(1 ): 92-109.

2. Munsat T.L., Davies K.E. International SMA consortium meeting. (26-28 June 1992, Bonn, Germany). Neuromuscul Disord. 1992; 2(5-6): 423-8.

3. Chen H., Qian K., Du Z. et al. Modeling ALS with iPSCs reveals that mutant SOD1 misregulates neurofilament balance in motor neurons. Cell Stem Cell 2014; 14(6): 796-809.

bFGF вызывает на ранних стадиях появление клеток, экспрессирующих транскрипционные факторы ранней нейроэктодермы: S0X2, играющего важную роль в механизмах самоподдержания нейральных стволовых клеток [19]; PAX6, участвующего в специализации нейроэктодермы [20]; раннего маркёра незрелых нейронов TuJ1 и PSA-NCAM маркёра клеток предшественников, относящихся к нейральным стволовым клеткам. Небольшое количество продукта гена CHAT — маркёра дифференцированных мотонейронов, объясняется неспецифической нейраль-ной дифференцировкой ИПСК при культивировании в НДС+bFGF. Появление на более поздних стадиях продуктов генов MAP2, NF200 и GFAP, являющегося маркёром астроцитов, подтверждает тот факт, что при культивировании ИПСК iSMA в НДС с добавлением bFGF запускается дифференцировка в направлении широкого спектра нейральных производных.

Одним из доказательств направленной диффе-ренцировки ИПСК iSMA в моторные нейроны при культивировании в присутствии ретиноевой кислоты и SHH является экспрессия гена CHAT. Более того, культивирование нейральных розеток в присутствии гепарина, bFGF, BDNF, ретиноевой и аскорбиновой кислоты привело к экспрессии транскрипционного фактора, необходимого для развития моторных нейронов ISL1 и являющегося одним из основных маркёров мотонейронов [21].

Нами была замечена разница в процессе нейраль-ной дифференцировки между линиями ИПСК, полученными от одного пациента, по эффективности образования нейральных розеток. Возможно, что одной из причин такой разницы является наличие встройки эписом в линии ÍSMA6L, в отличие от ÍSMA40, что может влиять на механизм запуска и эффективность нейральной дифференцировки ИПСК ÍSMA6L. Таким образом, мы делаем заключение о необходимости использования как минимум 3—5 линий для обнаружения тенденций в дифференцировке, нивелирования линий-специфичных эффектов и проецирования на клиническую практику результатов экспериментов с воздействием различных препаратов на нейроны in vitro.

Благодарности

Авторы признательны Богачевой М.С. (НИИ АГиР им. Д.О. Отта) за помощь в выделении фибро-бластов, Стрекаловой С.А. (зав. неврологическим отд. ДГБ № 22) за медицинское сопровождение работы.

Работа по получению и характеристике пациент-специфичных ИПСК больных СМА выполнена при поддержке бюджетного проекта Института цитологии и генетики СО РАН №0324-2015-0003, работа по дифференцировке в нейральном направлении ИПСК поддержана программой РАН №0324-2015-0021.

4. Ebert A.D., Yu J., Rose F.F. Jr. et al. induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature 2009; 457(7227): 277-80.

5. Hu B.Y., Weick J.P., Yu J. et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. PNAS USA 2010; 107(9): 4335-40.

6. Okita K., Matsumura Y., Sato Y., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods 2011; 8(5): 409-12.

7. Okita K., Yamakawa T., Matsumura Y. et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem

cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells 2013; 31(3): 458-66.

8. van der Steege G., Grootscholten P.M., van der Vlies P., et al. PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy. Lancet 1995; 345(8955): 985-6.

9. Marini M., Sasongko Т.Н., Watihayati M.S. et al. Allele-specific PCR for a cost-effective & time-efficient diagnostic screening of spinal muscular atrophy. Indian J. Med. Res. 2012; 135: 31-5.

10. Zheleznyakova G.Y., Kiselev A.V., Vakharlovsky V.G. et al. Genetic and expression studies of SMN2 gene in Russian patients with spinal muscular atrophy type II and III. BMC Med. Genet. 2011; 12: 96.

11. Ma W., Tavakoli Т., Derby E. et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 2008; 8: 90.

12. Hu B.Y., Zhang S.C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nat. Protoc. 2009; 4(9): 1295-304.

13. Medvedev S.P., Grigor'eva E.V., Shevchenko A.I. et al. Human induced pluripotent stem cells derived from fetal neural stem cells successfully undergo directed differentiation into cartilage. Stem Cells Dev. 2011; 20(6): 1099-112.

14. Григорьева Е.В., Шевченко А.И., Медведев С.П. и др. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки гибридов полёвок

Microtus levis х Microtus arvalis: условия, необходимые для получения и поддержания. Acta Naturae 2015; 17(4): 64-78.

15. Meyer K., Ferraiuolo L., Miranda C.J. et al. Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS. PNAS USA 2014; 111(2): 829-32.

16. Ruscheweyh R., Forsthuber L., Schoffnegger D. et al. Modification of classical neurochemical markers in identified primary afferent neurons with Abeta-, Adelta-, and C-fibers after chronic constriction injury in mice. J. Comp. Neurol. 2007; 502(2): 325-36.

17. Milligan C.J., Edwards I.J., Deuchars J. HCN1 ion channel immunoreactivity in spinal cord and medulla oblongata. Brain Res. 2006; 1081(1): 79-91.

18. Albala J.S., Kress Y., Liu W.K. et al. Human microtubule-associated protein-2c localizes to dendrites and axons in fetal spinal motor neurons. J. Neurochem. 1995; 64(6): 2480-90.

19. Shimozaki K. Sox2 transcription network acts as a molecular switch to regulate properties of neural stem cells. World J. Stem Cells 2014; 6(4): 485-90.

20. Zhang X., Huang C.T., Chen J. et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell 2010; 7(1): 90-100.

21. Liang X., Song M.R., Xu Z., et al. Isl1 is required for multiple aspects of motor neuron development. Mol. Cell Neurosci. 2011; 47(3): 215-22.

Поступила: 14.04.2016

•Гемабанк

Крупнейший банк стволовых клеток в РФ и СНГ. Более 18 тысяч российских семей доверили специалистам Гемабанка хранение самого ценного - стволовых клеток своих малышей.

БРЯБ терапия

Инновационная программа восстановления кожи при ее естественных и приобретенных изменениях. Это уникальный комплекс, сочетающий диагностические процедуры, создание БРНБ-препарата, проведение клеточной терапии и применение методов косметологии.

¡РБ-клетки

Получение плюрипотентных стволовых клеток методами генной инженерии из обычной клетки взрослого организма. Получение ¡РБ-клеток открывает новую страницу в разработке

комбинированных методов клеточной и генной терапии для лечения наследственных заболеваний.

//

& НЕОВАСКУЛГЕН

Первый в России геннотерапевтический препарат с геном фактора роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor - VEGF) для лечения хронической ишемии нижних конечностей.

• «Первый в классе» препарат для терапевтического ангиоге-неза. Местное введение препарата способствует локальному формированию новой сосудистой сети. • Новые сосуды - новые возможности!

о

о

о

о

о

о

о

о

л

ИНСТИТУТ

стволовых

клеток

И Г Л Г^ О Г I/ л

Институт Стволовых Клеток Человека

г. Москва, ул. Губкина, д. 3, стр. 2 тел.: + 7 (495) 646-80-76

www.hsci.ru