CC BY
33
DOI: 10.25702/KSC.2307-5252.2019.10.1.362-367 УДК 666.3-127
А. Ю.Тетерина1, Е. В. Соловьёва2, А. С. Осокина1, 3, В. С. Комлев1
1 Институт металлургии и материаловедения им. А. А. Байкова РАН, г. Москва, Россия
2Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», г. Москва, Россия
3Московский политехнический университет, г. Москва, Россия СОЗДАНИЕ ДВУХСЛОЙНЫХ КОМПОЗИЦИОННЫХ
ПОЛИМЕРНЫХ МАТРИКСОВ С ЗАДАННОЙ СТРУКТУРОЙ ПОВЕРХНОСТИ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Аннотация. Работа направлена на создание биоразлагаемых пористых каркасных материалов, которые сочетают высокую биосовместимость и обладают проангиогенными свойствами, т. е. способностью обеспечить активное прорастание сосудов ткани реципиента и, возможно, образование сосудистого русла de novo. Разработаны подходы создания двухслойной матричной структуры на основе биополимеров — альгината натрия и коллагена. Двухслойная структура будет обеспечивать выполнение функций кожного покрова — защитную (от внешних факторов среды) и регенеративную — восстановление эпителиальных тканей дермы. Результаты исследования имеют социальную значимость и вносят вклад в развитие области создания тканевых биополимерных материалов медицинского назначения.
Ключевые слова: кожный покров, ангиогенез, коллаген, альгинат, матрикс, трофические язвы, раневые покрытия.
A. U. Teterina1, E. V. Solovyova2, A. S. Osokina1' 3, V. S. Komlev1
1Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
2National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia 3Moscow Polytechnic University, Moscow, Russia
CREATION OF TWO-LAYER COMPOSITION POLYMER MATRIXES WITH A GIVEN STRUCTURE OF THE SURFACE FOR FABRIC ENGINEERING
Abstract. The work is aimed at creating biodegradable porous frame materials that combine high biocompatibility and have proangiogenic properties, that is, the ability to provide active germination of vessels of the recipient's tissue and, possibly, the formation of the vascular bed de novo. We developed approaches to create a two-layer matrix structure based on biopolymers — sodium alginate and collagen. The two-layer structure will provide the functions of the skin-protective (against external environmental factors) and regenerative — restoration of the epithelial tissues of the dermis. The research results have a social significance and contribute to the development of the field of creating tissue biopolymer materials for medical purposes. Keywords: skin, angiogenesis, collagen, alginate, matrix, trophic ulcers, scaffold.
Прогрессивное увеличение количества больных сахарным диабетом (СД) неизбежно приводит к значительному росту пациентов с его поздними осложнениями. В связи с этим современное консервативное лечение хронических раневых дефектов нижних конечностей и предотвращение возможной ампутации остается актуальным в современной медицине. Гибель кожных покровов значительной площади и «изъятие» кожи для аутотрансплантации сопровождаются развитием инфекции и суперинфекции, потерей белков, электролитов, воды, плазмы, патологической регенерацией [1]. В силу высокой
стоимости и частого отторжения аллографты не обеспечивают эффективного покрытия. Поскольку лечение обширных кожных дефектов требует использования кожи или ее искусственных эквивалентов, в последние годы были проведены многочисленные исследования их применения и разработки. Однако до сих пор не создан универсальный носитель клеточных структур, который бы обладал биосовместимостью, абсорбционной способностью в отношении раневого экссудата, предотвращал инфицирование, создавал оптимальную микросреду для регенерации раны, был проницаемым для воды и воздуха, но не высушивал дно раны, был эластичным, моделировал поверхность со сложным рельефом [2]. В настоящее время стало очевидным, что наилучшие результаты в оптимизации процессов реорганизации тканевых дефектов позволяет получить использование природных полимеров, способных осуществлять контроль синтеза и ориентации волокнистых структур [3]. Комбинация таких полимеров с факторами роста позволяет контролировать образование грануляций, ускорять эпителизацию кожных дефектов, получать соединительную ткань, мало отличающуюся от окружающей здоровой кожи. Основным материалом для подобных матриксов является коллаген — основной белок внеклеточного дермального слоя [4]. Благодаря своим биологическим свойствам коллаген ускоряет заживление ран и усиливает адгезию тромбоцитов. Однако применение материалов на основе коллагена имеет комплекс побочных эффектов и ограничений, приводящих к ухудшению состояния раны и чаще всего к ампутации конечности. Альтернативой для тканевой инженерии и реконструкции кожных покровов стало применение биополимеров растительного происхождения благодаря их высокой биосовместимости и исключительной безопасности по сравнению с биополимерами животного происхождения [5-7]. Для создания полного биоинженерного эквивалента кожи необходим клеточный носитель, в котором обитают фибробласты, а мультипотентные стромальные клетки служат основой для кератиноцитов, образующих многослойный эпидермис на своей поверхности, при культивировании in vitro [8, 9]. Для подобных целей в качестве основного компонента наиболее интересным кажется альгинат натрия, который обладает уникальными свойствами, позволяющими образовывать прочные трехмерные матриксы различных структур и широко применять его для регенерации других видов ткани.
В качестве матрикса и носителя лекарственного препарата в работе использовали биоразлагаемые полимеры растительного и животного происхождения — альгинат натрия и коллаген. Создание двухслойной структуры скаффолда с разной архитектоникой поверхностей позволяет воссоздать основные функции кожного покрова — верхний, беспористый слой обеспечивает защитную и барьерную функции от факторов внешней среды, поддержание постоянной температуры, испарение воды; пористая структура второго слоя матрикса с сетью взаимосвязанных пор обеспечивает быструю васкуляризацию и образование соединительной ткани дермы. Комбинирование таких материалов может стать платформой для адресной доставки в зону поражения антибактериальных препаратов, обеспечивая пролонгированную локальную терапию, исключая, таким образом, побочные осложнения.
Пористый матрикс со взаимосвязанной сетью пор получали из гидрогелей биополимеров вспениванием в присутсвии поверхностно-активного вещества 2 %-го водного раствора альгината натрия и 10 %-го раствора коллагена
в широком спектре соотношений с последующей сублимационной сушкой. Внешний беспористый слой наносился покапельно до достижения определенного объема и последующей сушкой при физиологических температурах 35-37 0С. Полная двухслойная структура подвергалась двухфазной сшивке водно -спиртовыми растворами двухвалентных металлов и альдегидами.
Полученные материалы подвергали всесторонннему изучению с использованием современных методов исследования. Для исследования микроструктуры полученных на альгинатной основе многокомпонентных клеточных носителей/матриксов в качестве оригинального метода использована сканирующая электронная микроскопия (TeScan Vega II SBU) с локальным энергодисперсионным анализом (INCA). Для оценки механических свойств матриксов испытания прочностных характеристик в биологических жидкостях при 370 оС проведены в камере Instron ElectoPuls E3000. Для определения фазовых и микроструктурных превращений материалов проведен комплекс исследований физико-химических свойств: инфракрасная спектрометрия (ИК), энергодисперсионный анализ (ЭДА), исследование вязкости растворов, влагопроницаемости и водопоглощения, эластичности. Для оценки биосовместимости, адгезионных и ангиогенных свойств альгинатных матриксов использованы современные методы молекулярной биологии и биоинженерии: ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) (HIFla, VEGFa) для оценки экспрессии проангиогенных факторов.
Разработаны двухкомпонентные тканевые эквиваленты на основе альгината натрия и коллагена в широком диапазоне составов с разной архитектоникой поверхностей — беспористая структура и структура с сетью взаимосвязанных пор с достаточными прочностными характеристиками (рис. 1).
Рис.1. Микроструктура двухслойного матрикса на основе альгината натрия и коллагена концентрации (AL/CL 85/15), сшитые катионами бария и глутаровым альдегидом Fig.1. Microstructure of bilayer matrix based on sodium alginate and collagen with concentration (AL / CL 85 / 15), cross-linked with barium cations and glutaraldehyde
Создан ряд базовых губчатых матриксов на основе чистого коллагена (для использования в качестве эталонов сравнения), а также разработаны основы получения композиционных губчатых матриксов на основе альгината натрия. Были определены основные факторы, влияющие на микроструктуру матриксов в зависимости от соотношения компонентов системы: состав и дисперсность компонентов, концентрация альгината, рН суспензии, состав и соотношение сшивающих ионов (Са2+, Mg2+, Zn+2, Ba2+, Sr2+), а также условий проведения процесса, включая степень вспенивания, температуру фиксации (-5, -10, -20, -50,
-180 оС) и наличие поверхностно-активных веществ, наиболее эффективных в данной системе. Установлено, что относительно высокими прочностным характеристикам обладают матриксы композиционного состава: 85 % альгината натрия и 15 % коллагена с общей пористостью 90 %, сшитые ионами Ba2+ (табл.).
Физико-химические свойства двухслойных матриксов на основе альгината натрия и коллагена Physico-chemical properties of two-layer matrices based on sodium alginate and collagen
Двухкомпонентный матрикс ALG/CL, % 100/0 85/15 50/50 0/100
Общая пористость, % 92 ± 1 90 ± 1 96 ± 1 9 ± 1
Размер пор, мкм 66 ± 15 57 ± 15 124 ± 15 270 ± 15
Толщина стенок, мкм 2,3 ± 0,2 1,3 ± 0,2 0,8 ± 0,2 0,5 ± 0,2
Из всех исследованных сшивающих ионов только катионы Ba2+ позволяют получать биосовместимые губчатые носители с необходимыми прочностными характеристиками. Использование катионов Са2+ и Mg2+ приводило к получению губчатых матриксов с высокой скоростью деградации при культивировании на них клеточных составов, а катионы Sr2+, обеспечивая необходимую прочность, обладали низкой биосовместимостью с фибробластами кожи. Таким образом, разработанная процедура позволила получить композиционные альгингат-коллагеновые губчатые и пленочные матриксы с содержанием альгината 100, 85 и 50 % и коллагена 0, 15, 50 и 100 % соответственно (рис. 2).
Рис. 2. Микроструктура поверхности плёночного матрикса на основе альгината натрия и коллагена Fig. 2. Microstructure of the surface of the film matrix based on sodium alginate and collagen
Основу любого биоинженерного тканевого эквивалента составляет клеточный носитель-каркас, к свойствам которого предъявляются особые требования, поскольку именно им в основном определяется функционирование биоимпланта и его интеграция в ткани реципиента, а в дальнейшем и его полное
замещение нативной тканью. Важную роль при этом играет не только биосовместимость матрикса, но и его проангиогенные свойства, т. е. способность обеспечивать активное прорастание сосудов из ткани-реципиента (ангиогенез) и, возможно, формирование сосудов de novo (васкулогенез). Полная биосовместимость полученных двухкомпонентных тканевых эквивалентов на основе альгината натрия и коллагена, а также высокие адгезивные свойства позволяют надеяться на их высокую эффективность при лечении раневых повреждений кожи (рис. 3).
Таким образом, эффективным материалом в качестве двухслойного тканевого эквивалента являются пористые биосовместимые матриксы на основе альгината натрия, рассматриваемые в данной работе в качестве носителей активных лекарственных компонентов и факторов роста. Ожидается, что включение плазмы пациента (или донора) позволит увеличить ангиогенные свойства и ускорить регенерацию кожного покрова. Создание функциональных тканевых эквивалентов, в том числе посредством аддитивных технологий, позволит, наряду с прямым регенерирующим действием, осуществить адресную доставку в зону раны антибактериального препарата и снизить риск возникновения инфекции, чтобы избежать хирургического вмешательства.
Рис. 3. Адгезивные свойства двухслойных матриксов альгинатных матриксов
AG-CL (85 % AG / 15 % CL): 1 — FDA прижизненная окраска 10-дневной культуры sFв (фибробласты кожи человека); 2 — sadMSC (мультипотентные стромальные клетки подкожной жировой клетчатки); 3 — фазово-контрастное изображение 10-дневной
культуры PKC
Fig. 3. The adhesive properties of the two-layer matrices of alginate matrices AG-CL
(85 % AG / 15 % CL): 1 — FDA lifetime color of 10-day culture sFv (human skin fibroblasts); 2 — sadMSC (multipotent stromal cells of the subcutaneous fatty tissue); 3 — phase-contrast image of
10 day culture PKC
Авторы работы выражают благодарность за руководство работой чл.-корр. РАН Комлеву В. С.; за помощь в работе всем сотрудникам лаборатории № 20 ИМЕТ РАН.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант РФФИ 19-33-70042 моламос).
Литература
1. Nanofibrous structured biomimetic strategies for skin tissue regeneration / Jayarama Reddy V. et al. // Wound Repair Regen. 2013. Vol. 21. Р. 1-16.
2. Pectin-chitosan-PVA nanofibrous scaffold made by electrospinning and its potential use as a skin tissue scaffold / H. Y. Lin et al. // J Biomater. Sci. Polym. 2013. Vol. 24. Р. 470-484.
3. Fibrillar structure and mechanical properties of collagen / P. Fratzl et al. // J. Struct. Biol. 1998. Vol. 122. Р. 119-122.
4. Towards ready-to-use 3-D scaffolds for regenerative medicine: adhesion-based cryopreservation of human mesenchymal stem cells attached and spread within alginate-gelatin cryogel scaffolds / A. Katsen-Globa et al. // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2014. Vol. 25. Р. 857-871.
5. Preparation of macroporous alginate-based aerogels for biomedical applications / S. Quraishi et al. // J. Supercrit. Fluids. 2015.
6. Drug loaded bi-layered sponge for wound management in hyperfibrinolytic conditions / A. Mohandas et al. // J. Mater. Chem. B. 2015. Vol. 3. Р. 5795.
7. A denatured collagen microfiber scaffold seeded with human fibroblasts and keratinocytes for skin grafting / M. Kempf et al. // J. Biomaterials. 2011. Vol. 32. (21). Р. 4782-92.
8. Fabrication, properties and bioapplications of cellulose/collagen hydrolysate composite films / Y. Pei et al. // Carbohydr. Polym. 2013. Vol. 92, Is. 2. Р. 1752-60.
9. Shevchenko R., James S. L., James S. E. A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction // J. R. Soc. Interface. 2010. Vol. 67 (43). Р. 229-58.
Сведения об авторах
Тетерина Анастасия Юрьевна
кандидат технических наук, Институт металлургии и материаловедения им. А. А. Байкова РАН, г. Москва, a.y.teterina@gmail.com Осокина Анастасия Сергеевна
студентка, Москвовский политехнический университет, г. Москва; Институт металлургии и материаловедения им. А. А. Байкова РАН, г. Москва Соловьёва Елена Викторовна
кандидат медицинских наук, Национальный исследовательский центр «Курчатовский
институт», г. Москва
Комлев Владимир Сергеевич
член-корреспондент РАН, доктор технических наук, Институт металлургии и материаловедения им. А. А. Байкова РАН, г. Москва
Teterina Anastasia Yuryevna
PhD (Eng.), Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science, Russian Academy of Sciences, Moscow, a.y.teterina@gmail.com Osokina Anastasia Sergeevna
Student, Moscow Polytechnic University, Moscow; Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science, Russian Academy of Sciences, Moscow Solovyova Elena Viktorovna
PhD (Medicine), National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow Komlev Vladimir Sergeevich
Corresponding Member of RAS, Dr. Sci. (Eng.), Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science, Russian Academy of Sciences, Moscow
