CC BY
102
■■■ ■ I I I I I I I 4. n
116 Информация
ИНФОРМАЦИЯ
Современные проблемы криоконсервации биоматериала - стволовых клеток пуповинной крови и клеток репродуктивной системы
А.Б. Смолянинов, ДА. Иволгин
Санкт-Петербургский Государственный университет, Санкт-Петербург
ООО «Покровский банк стволовых клеток», Санкт-Петербург
В мае 2010 г. в Валенсии (Испания) состоялся
1 -й Международный Конгресс по проблемам криоконсервации стволовых клеток, репродуктивных клеток, тканей и органов. Этот форум собрал 418 участников из 53 стран Европы, Азии, Африки и Америки. Как следует из названия Конгресса, основными направлениями работы участников являлись теоретические и практические вопросы замораживания, витрификации и долговременного хранения стволовых клеток, овоцитов, эмбриональных клеток, сперматозоидов, создание и работа криобанков.
В рамках конгресса состоялся семинар на тему «Банкирование пуповинной крови: как организовать общественный банк пуповинной крови (ВПК) и как подготовиться к инспекции по аккредитации FACT/NetCord». Со своими докладами выступали известные специалисты в области долговременного хранения пуповинной крови: президент NetCord профессор Е. Baudoux, руководитель барселонского банка пуповинной крови доктор S. Querol, технический директор миланского Банка пуповинной крови L. Lecchi, вице-президент NetCord и главный гематолог Израиля, профессор A. Nagler, профессор медицинского факультета Мадридского Университета М. Fernandes и др.
В кратком историческом обзоре президент NetCord, профессор Е. Baudoux обозначил основные вехи развития банкирования и использования пуповинной крови для трансплантации. Он отметил, что за 20-летнюю историю использования пуповинной крови итоговая выживаемость после трансплантации выросла более чем в 2 раза — с 20 до 42%. Также были сформулированы основные задачи, стоящие перед банками пуповинной крови (ВПК), это улучшение исходов трансплантации пуповинной крови (ТПЮ, достижение высокого качества трансплантанта. Президент NetCord профессор Е. Baudoux отметил, что в последние годы идет развитие других — негемопоэтических направлений использования пуповинной крови — лечение аутоиммунных заболеваний, соматических и неврологических заболеваний и др.
Профессор Е. Baudoux определил те проблемы, которые необходимо преодолеть в первую очередь при осуществлении программ ТПК: недостаточность трансплантата; популяции мигрантов, то есть недостаточное присутствие минорных национальностей в ВПК и регистрах доноров костного мозга; нежелательные последствия ТПК. Мероприятиями, призванными решить
эти задачи, по определению Е. Baudoux, являются четкие критерии выбора образца: качество важнее объема; оптимальное количество ядросодержащих клеток после размораживания; трансплантация 2-х образцов пуповинной крови; улучшение стратегии рекрутинга; международное сотрудничество; инновации.
Требования к выбору образца пуповинной крови для трансплантации были сформулированы как общее количество ядросодержащих клеток более 2х107/кг массы тела пациента и совместимость по антигенам системы Н1.А 6 из 6 или 5 из 6 антигенов. В заключение Е. Baudoux с удовольствием отметил, что сегодня трансплантация пуповинной крови взрослым пациентам проводится в 2 раза чаще чем детям. По итогам доклада профессора Е. Baudoux можно сделать вывод, что такое направление клеточной медицины как длительное хранение и использование пуповинной крови уверенно развивается и находит все большее применение не только в педиатрической практике, но и у взрослых пациентов.
С большим блоком сообщений выступила технический директор ВПК г. Милан доктор наук I. ЬессЫ. Этот блок состоял из докладов по системе качества ВПК, особенностям упаковки и транспортировки образца пуповинной крови из центра сбора до банка и из банка в центр трансплантации, стоимости банкирования пуповинной крови и различным вариантам процессинга (обработки) пуповинной крови в ВПК.
Сообщение по системе качества ВПК основывалось на недавно вышедшем 4-м издании Международных стандартов РАСТ/№Шо^ по сбору, банкированию и применению пуповинной крови. В докладе г-жа I. ЬессЫ дала определение понятий «качество», «программа управления качеством» применительно к ВПК. По её словам, сегодня программа управления качеством должна состоять их 4-х основных разделов: обеспечение качества, контроль качества, оценка качества и развитие качества. Затем доктор I-. ЬессЫ остановилась на организационных аспектах управления качеством банка пуповинной крови — ответственности должностных лиц, разработке банком «Плана управления качеством» и тех необходимых пунктов, которые должны быть отражены в этом плане: документация, стандартные операционные процедуры, требования к персоналу, материалам, оборудованию и пр. В завершение этого сообщения I. ЬессЫ показала, как такая система работает в Миланском ВПК. Фактически, система управления
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
I I I I I
Ш
качеством банка пуповинной крови является одной из важнейших составных частей его повседневной деятельности и определяющей для удостоверения того, что для трансплантации будет использован образец пуповинной крови надлежащего качества.
Следующий доклад г-жи L. Lecchi был посвящен особенностям упаковки, маркировки и транспортировки образца пуповинной крови. Общепринятая европейская практика транспортировки образца предусматривает его помещение в так называемый «вторичный» контейнер, который затем помещается в транспортный контейнер. Кроме соответствующей маркировки и документирования необходимым требованием для транспортировки образца пуповинной крови является мониторинг температуры внутри транспортного контейнера, осуществляемый с помощью специальных устройств и служащий для подтверждения необходимого качества транспортируемого образца. Живую дискуссию вызвал пункт доклада о том, что взятый из банка пуповинной крови образец для трансплантации в случае его не использования возвращаться обратно в банк не должен. В процессе дискуссии выяснилось, что единого стандарта транспортировки замороженного образца пуповинной крови из банка в центр трансплантации в Европе не существует. Это связано с большим количеством местных законов, непростых взаимоотношений банков пуповинной крови и транспортных компаний и отсутствии четкого разграничения зон ответственности за образец пуповинной крови между банком и трансплантационным центром.
В докладе, посвященном обработке пуповинной крови перед криоконсервированием и закладкой на длительное хранение, д-р L. Lecchi дала определение термина «обработка» (processing) пуповинной крови в соответствии с последней редакцией Стандартов FACT/NetCord, критериев включения, то есть тех условий, при которых образец пуповинной крови принимается для обработки. Например, в Миланском ВПК критериями включения являются: отсутствие критериев исключения (наличие, в анамнезе гемотрансмиссивных инфекций), наличие подписанного информированного согласия, время от сбора, не превышающее 48 ч, объем образца не менее 60 мл и количество ядросодержащих клеток более 1000x10е.
Далее L. Lecchi остановилась на целях сокращения объема образца пуповинной крови — это уменьшение замораживаемого пространства, уменьшение количества эритроцитов и уменьшение вводимого с образцом при трансплантации количества ДМСО и основных применяемых для этого методах. К методам сокращения объема относятся ручной (седиментация с помощью ГЭК, фильтрация), полуавтоматический (Compomat, Optipress) и автоматический (система Sepax S100 и система АХРТМ). Были представлены обзоры результатов обработки пуповинной крови этими способами — итогом обзора было заявление L. Lecchi о том, что с появлением автоматической системы Sepax S100 вопрос о выборе оборудования для ВПК больше не стоит. И в завершение г-жа L. Lecchi остановилась на вопросах необходимого тестирования образцов пуповинной крови до и после обработки и документирования процессов обработки.
Большой интерес вызвало сообщение д-ра L. Lecchi, посвященное финансовым аспектам работы общественных ВПК. Все данные приводились на примере работы Миланского ВПК, так, при существующей структуре и оборудовании банка ежегодное государственное
финансирование составляет 1,1 млн евро. Ежегодно центры трансплантации используют 40^45 образцов пуповинной крови на сумму 800 тыс. евро. По мнению L. Lecchi, финансовая модель деятельности общественного ВПК выглядит так: создание банка за счет инвестиций и возврат этих денег за счет выплат от трансплантационных центров за используемые ими образцы пуповинной крови. Примерный (но неокончательный) срок полного возврата инвестированных средств составляет по оценкам г-жи L. Lecchi около 10 лет с момента трансплантации 1-го образца пуповинной крови из данного ВПК. Затем в докладе были приведены расчеты стоимости образца пуповинной крови для трансплантации в первые 4 года из 10 лет хранения. Рассматривалось 3 модели банков — с 1500, 5000 и 10 ООО единиц хранения пуповинной крови. Расчетная стоимость образца пуповинной крови, используемого для трансплантации, составила 15061 евро, 12666 евро и 11602 евро соответственно. В целом же ситуация по финансированию общественных банков пуповинной крови в Италии (п = 9) выглядит следующим образом: общие расходы плюс расходы на жидкий азот 357300 евро, поступления за трансплантации, за исследовательскую деятельность и добровольные пожертвования — 197893 евро. Из всего вышеизложенного понятно, что полноценное функционирование общественного ВПК невозможно без государственной финансовой поддержки.
Следующий блок сообщений представил директор Барселонского ВПК и лондонского Исследовательского института Ап. 1Мо1ап, профессор Б. Оиего!. Первый его доклад был посвящен проблеме поиска совместимых образцов ПК для национальных меньшинств, традиционно в незначительном количестве представленных в регистрах. Ни для кого не секрет, что разные нации и национальности имеют свои особенности антигенной структуры главного комплекса гистосовместимости, поэтому в связи с усиливающимися миграционными потоками в Европе сейчас все большее значение при создании регистров костного мозга и ВПК приобретает представление в них минорных национальностей. В своем докладе д-р Б.Оиего! привел интересный пример: для того, чтобы с 80% вероятностью найти донора, совместимого по 5 из 6 антигенам системы ^А необходим банк с 50 тыс. образцов. Для того, чтобы с такой же степенью вероятности найти донора с подобной совместимостью для одной минорной национальности количество единиц хранения в банке должно составлять уже 150 тыс. Мероприятиями, призванными повлиять на сложившуюся ситуацию должны стать увеличение использования доноров, совместимых по 4 из 6 антигенов системы ^А, развитие международного сотрудничества с целью обмена образцами пуповинной крови и снижение затрат на увеличение количества хранящихся в банках пуповинной крови образцов. В качестве иллюстрации к последнему пункту, д-р Б. Оиего! рассказал об опыте Барселонского ВПК, где все хранящиеся образцы разделили на 4 группы — А, В1, В2, С. Критериями такого разделения послужило содержание в образце пуповинной крови ядросодержащих клеток и С034+ клеток. Так, при том, что процентное содержание образцов пуповинной крови категории А в банке составляет только 9%, на долю этой группы приходится 50% трансплантаций. И сейчас в Испании существует национальная программа по увеличению количества образцов пуповинной крови, хранящихся в испанских ВПК до 60 тыс. образцов,
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
I I I I I
причем за счет именно образцов категории А. Федеральное финансирование такой программы составляет 14 млн евро.
Темой следующего сообщения проф. S. Querol были аспекты криоконсервации и криохранения пуповинной крови. Основную часть доклада заняло обсуждение организационных аспектов процедур криоконсервации и длительного хранения — требования к помещению для криохранилищ, оборудованию для замораживания и хранения в жидком азоте, квалификации персонала. Очень интересным было сравнение двух основных методов криоконсервации — двухэтапного, т.е. криоконсервация и заморозка и хранение в автоматическом оборудовании (Bioarchive) и трехэтапного — криоконсервация, замораживание и собственно хранение. Исходя из опыта работы европейских криохранилищ, двухэтапный метод имеет большое количество недостатков по сравнению с трехэтапным: закрытость системы, а, значит сложность управления качеством, сложность быстрого получения образца, возможные проблемы при аварийный ситуации, высокая стоимость и зависимость от одной компании. Также д-р S. Querol остановился на вопросах верификации выдаваемого из криохранилища образца которая состоит их трех пунктов: безопасность (серологическое определение гемотрансмиссивных инфекций), идентификация (HLA, группа крови по системе АВО и Rh) и потенциал (K0E/CD34+; количество клеток; объем образца). В заключение проф. S. Querol привел последние данные по сохранению потенциала стволовых клеток пуповинной крови после длительного хранения при низких (-196°С) температурах. Сегодня срок хранения образца пуповинной крови, не влияющий на способность к приживлению, составляет 23 года.
Последний свой доклад д-р S. Querol посвятил собственно процедуре подготовки и прохождения банком пуповинной крови аккредитации FACT/NetCord. На сегодняшний день из 107 ВПК — членов NetCord аккредитацию прошел только 21 банк. Процедура прохождения аккредитации довольно сложна и длительна. В среднем она составляет 1,5 года и включает в себя подготовку документации по всем видам деятельности, осуществляемым банком пуповинной крови от момента сбора пуповинной крови до момента передачи образца для трансплантации, прохождение инспекции комиссией, создаваемой для этого в NetCord, устранение замечаний комиссии и, в завершение, принятие решения научным советом NetCord. Прохождение аккредитации банком свидетельствует о том, что вся его деятельность полностью соответствует Международным стандартам FACT/NetCord и, следовательно, все хранящиеся в данном ВПК образцы пуповинной крови могут быть использованы для трансплантации практически во всем мире.
С докладом, посвященным проблеме выбора образца пуповинной крови для трансплантации, выступил вице-президент NetCord и главный гематолог Израиля профессор A. Nagler. Проблема эта в настоящий момент заключается в определении приоритета при выборе образца: большее содержание ядросодержащих клеток и меньшее количество совпадений по системе антигенов HLA или большее количество совпадений и меньшее содержание клеток. Однозначного ответа проф. A. Nagler не дал, но в современной трансплан-тологической практике приоритетным является содержание ядросодержащих клеток. Затем д-р A. Nagler говорил о рекомендациях международных организаций
по образцам пуповинной крови для трансплантации: рекомендации Eurocord для злокачественных заболеваний: более 3x107 ядросодержащих клеток/кг массы тела пациента, содержание CD34+ клеток более 2x10s /кг массы тела пациента, для незлокачественных — x
плантации двух образцов пуповинной крови совместимость по антигенам системы HLA — не менее 4 из 6 антигенов и содержание ядросодержащих клеток на x
Также при выборе образца необходимо учитывать, что чем больше количество несовпадений по системе HLA, тем больше должно быть количество клеток в образце. В целом же вопрос выбора все еще нуждается в дальнейшем изучении, так, проф. A. Nagler привел как пример изучение роли антигенов главного комплекса гистосовместимости HLA-С и HLA-DQ на исход трансплантации.
С интереснейшим докладом, посвященным новому методу улучшения исходов трансплантации пуповинной крови выступил профессор медицинского факультета Мадридского Университета М. Fernandes. Он отметил, что за счет невысокого содержания стволовых клеток в пуповинной крови по сравнению с другими источниками (костный мозг, периферическая кровь) одной из проблем трансплантации пуповинной крови является замедленное приживление трансплантата и связанные с этим неблагоприятные последствия. Сегодня существует ряд методов, направленных на оптимизацию приживления — это экспансия стволовых клеток ex vivo, внутрикостное введение стволовых клеток, трансплантация двух образцов пуповинной крови и некоторые другие. Суть метода, разработанного коллективом исследователей под руководством М. Fernandes заключается в котрансплантации пуповинной крови и очищенных мобилизованных из периферической крови гемопоэтических стволовых клеток, полученных от второго донора. Данная методика позволила существенно укоротить время посттрансплантаци-онной нейтропении, а значит и снизить трансплантат-ассоциированную смертность за счет снижения риска развития инфекций. По уровням итоговой выживаемости и бессобытийной выживаемости результаты «двойной» трансплантации сравнимы с результатами после трансплантации от HLA-идентичного семейного донора, что в целом ставит этот метод в один ряд с методами, наиболее перспективными для улучшения исходов трансплантации.
От России был представлен доклад А.Б. Смоляни-нова и соавт. в котором целью исследования была разработка стандартизированных процедур по забору, выделению, подсчету и криоконсервированию гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови на базе Покровского банка стволовых клеток. Во время родов пациенток было собрано 1400 образцов пуповинной крови для общественного регистра доноров пуповинной крови. Средний объем собранной пуповинной крови составил 102,6+46,86 мл. Все образцы пуповинной крови обрабатывались на Sepax S100 (Biosafe, Швейцария) автоматизированным методом. Скорость восстановления ядросодержащих и мононуклеарных клеток составила 84,63±19,3% и 77,9+21,7% соот-
x
в образце, жизнеспособность — 96,31+2,45%. После проведения всех необходимых анализов, добавления 10% ДМСО и доведения до температуры +4°С, с помощью аппарата Coolmix (Biosafe, Швейцария),
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
I I I I I
Ш
образцы пуповинной крови отправлялись на программное замораживание (Planer, Великобритания). После года хранения семь образцов были разморожены, скорость восстановления ядросодержащих и CD34+
++
+
Предложенные методы обработки и криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, являются эффективными для работы общественного регистра доноров пуповинной крови.
На 1-м Международном Конгрессе несколько секций было посвящено такому методу криоконсервации клеток и тканей как витрификация. Витрификация представляет собой сверхбыстрое замораживание в специальных средах. Сейчас данная методика получает все большее распространение в криоконсервации сперматозоидов, овоцитов, хотя сказать, что эта методика изучена полностью, в настоящий момент нельзя.
Всего на конференции прозвучало более 50 докладов, посвященных разнообразным проблемам криобиологии и клеточной терапии, особенно хочется отметить доклад С. Simon (Испания) посвященный генерации плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), в т.ч. путем репрограмирования; одна из перспектив использования такой методики — генерация клеточных линий от больных анемией Фанкони, чтобы сравнить эти стволовые клетки с нормальными и попытаться разобраться на каком этапе клеточного развития происходит сбой.
Также обратил на себя внимание доклад профессора A. Nagler о терапевтическом использовании мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины, и негемопоэтическом применении стволовых клеток пуповинной крови — уже существуют методики, позволяющие применять эти клетки в кардиологии (лечение инфаркта миокарда, облитерирующих заболеваний нижних конечностей), неврологии (состояния после острого инсульта, травм нервной системы).
Новые возможности клеточной терапии обрисовала д-р Е. Goldman (Израиль), рассказав о методике получения эпителиальных мезенхимальных стволовых клеток из амниотической жидкости, о методе криоконсервации стволовых клеток пуповинной крови путем лиофилизации и о специально разработанном оборудовании для этого рассказала D. Nathan (Израиль), с очень интересными докладами, суммирующими мировой опыт по технологии замораживания эмбриональных клеток и возможных при этом ошибках и различным технологиям замораживания сперматозоидов выступили J. Hasler (США) и M.Gil-Salom (Испания).
1-й Международный Конгресс по проблемам криоконсервации стволовых клеток, репродуктивных клеток, органов и тканей обозначил современное положение дел в криобиологии клеток, тканей и органов, обозначил основные проблемы, стоящие перед научным сообществом и определил направления развития криобиологии, репродуктивной медицины, генной инженерии и клеточной терапии.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
А
■ INI
5-й Международный Конгресс Всемирной Ассоциации Репродуктивной Медицины — WARM-2010
С 10 по 13 октября впервые в Москве состоится 5-й Международный конгресс Всемирной Ассоциации Репродуктивной Медицины — WARM-2010. В церемонии открытия примет участие лауреат Нобелевской премии профессор Ada Е. Yonath (Израиль).
Организаторы: Всемирная Ассоциация Репродуктивной Медицины (WARM), Клиника Экстракорпорального Оплодотворения (ЭКО) «АльтраВита», г. Москва, Россия.
Место проведения: Центр Международной Торговли, г. Москва, Краснопресненская наб., 12.
История Конгресса WARM
Всемирная Ассоциация Репродуктивной Медицины (WARM) основана в 2001 г. в Риме. Главной целью Ассоциации является развитие научно-исследовательской деятельности в области репродуктивной медицины. Под эгидой Ассоциации объединились ведущие мировые специалисты в области научной и практической медицины, эмбриологии, молекулярной биологии, генетики, психологии, этики. 1-й Международный Конгресс WARM — 19^22 мая 2002, Сабаудиа (Италия), 2-й Международный Конгресс WARM — 6^9 мая 2004, Рим (Италия), 3-й Международный Конгресс WARM — 28 сентября — 1 октября 2006, Рим (Италия), 4-й Международный Конгресс WARM — 23^26 сентября 2008, Гвадалахара (Мексика).
Всемирный форум специалистов репродуктивной медицины WARM-2010 впервые пройдет на территории России. В рамках научной программы пройдет пленарная сессия, где свои доклады представят более 100 ведущ^с-'специалистов из России, США, Италии, Израиля, Великобритании, Канады, Японии, Китая, Бельгии,- Австралии, Аргентины, Казахстана и других стран мира, а также пройдут практические семинары, будет организована постерная сессия и выставка медицинского оборудования ведущих отечественных и зарубежных производителей.
Тематика Конгресса охватывает широкий круг вопросов связанных с применением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) или экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). По статистике в России бесплодие встречается у 15% супружеских пар. На сегодняшний день, согласно рекомендациям ВОЗ, эти методы являются наиболее эффективными при лечении бесплодия. Для улучшения сложной демографической ситуации в стране необходим комплексный подход, в рамках которого особое внимание следует уделить репродуктивному здоровью нации.
Проведение конгресса в Москве позволит российским врачам обменяться опытом с зарубежными коллегами, узнать о новейших репродуктивных технологиях и поделиться своими разработками. В работе WARM-2010 примут участие около 2000 российских и зарубежных специалистов, известные государственные и общественные деятели.
Приглашаем Вас принять участие в работе Конгресса!
Дополнительную информацию о Конгрессе вы можете найти на сайте www.warm2010.ru
Основные темы Конгресса
1. Инновации во Вспомогательных Репродуктивных Технологиях (ВРТ).
2. Мужской фактор бесплодия, отбор сперматозоидов по морфологии для интрацитоплазматической инъекции в яйцеклетку (IMS!).
3. Витрификация яйцеклеток и эмбрионов.
4. Минимальная стимуляция овуляции в программе ВРТ (сессия, организованная Международной Ассоциацией Негосударственных Клиник ВРТ A-PART).
5. Методы предотвращения синдрома гиперстимуляции яичников.
6. Искусственные гаметы.
7. Индукция суперовуляции в программах ВРТ.
8. Особенности стимуляции суперовуляции у пациенток с бедным ответом яичников.
9. Донорство яйцеклеток.
10. Созревание яйцеклетки in vitro.
11. Сохранение фертильности, планирование семьи.
12. Оптимизация условий культивирования эмбрионов.
13. Отбор эмбрионов для переноса в полость матки.
14. Имплантация эмбрионов и её неудачи.
15. Стволовые клетки.
16. Противоречия ВРТ.
17. Иммунология репродукции.
18. Преимплантационная генетическая диагностика.
19. Эндоскопия и репродуктивная хирургия.
20. Здоровье детей, рожденных в результате экстракорпорального оплодотворения.
21. Этические аспекты ВРТ.
22. Исследования в области ВРТ на экспериментальных животных.
23. Онкология и репродукция.
24. Репродуктивная эндокринология.
25. Контрацепция.
Конгресс проводится в сотрудничестве с Обществом Репродуктивной Медицины Республики Казахстан и Международной Ассоциацией Негосударственных Клиник ВРТ (A-PART). В рамках Конгресса пройдёт заседание сессии A-PART.
Ведущие отечественные и зарубежные производители представят свою продукцию на Международной выставке медицинского оборудовния, лекарственных средств и изделий медицинского назначения.
Официальный язы(Жонгресса — английский, с синхронным переводом на русский.
Научный комитет проведет конкурс работ среди устных и постерных докладов, представленных на Конгрессе.
Три наиболее актуальные и инновационные работы будут награждены денежными призами WARM (за 1-е,
2-е и 3-е места).
е места)
J
\
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010
