CC BY
94
68
Оригинальные исследования
Алгоритм работы Московского банка-регистра стволовых клеток
И.В. Кобзева, Т.А. Астрелина, М.В. Яковлева, Е.Э. Карпова, Я.А. Круглова, ЛЛ. Лебедева,
Т.В. Пухликова, А.А. Чумак, Д.С. Ставцев, А.Е. Гомзяков, Е.В. Боякова
Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы, Москва
Algorithm activity of the Stem Cells Bank-Register in Moscow
I.V. Kobzeva, T.A. Astrelina, M.V. Yakovleva, E.E. Karpova, Y.A. Kruglova, L.L. Lebedeva, T.V. Puhlikova,
A.A. Chumak, D.S. Stavcev, A.E. Gomzyakov, E.V. Boyakova Moscow Stem Cell Bank, Moscow
Прогресс в области трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови неразрывно был связан с развитием банков пуповинной крови, созданных для обеспечения систематического сбора, тестирования, обработки, хранения, организации подбора и выдачи образцов пуповинной крови для трансплантации. Целью исследования была разработка алгоритма работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК пуповинной крови. В статье охарактеризованы биологические характеристики всех образцов пуповинной крови, внесенные в регистр безвозмездных доноров Московского банка стволовых клеток (на 1 криоконсервированный образец пуповинной крови). Показано, что небольшое количество безвозмездных неродственных доноров ГСК пуповинной крови в базе данных регистра позволяет подобрать совместимую (6/6) пару донор-реципиент с частотой вероятности 1:151. Предложенный алгоритм работы Московского банка-регистра рекомендуется использовать при создании, усовершенствовании и работе других банков-регистров безвозмездных неродственных доноров ГСК пуповинной крови.
Ключевые слова: алгоритм, безвозмездные неродственные доноры, пуповинная кровь, банк-регистр стволовых клеток, гемопоэтические стволовые клетки.
На сегодняшний день во многих странах мира пуповинная кровь (ПК) стала одним их наиболее востребованных альтернативных источников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) благодаря ее уникальным свойствам, относительной простоте и безопасности заготовки, развитию глобальной сети банков ПК и улучшению качества подборов неродственных доноров ГСК [1—4]. Ежегодно в мире проводится более 2—3 тыс. трансплантаций аллогенных ГСК ПК пациентам с различными заболеваниями, а в 2009 г. впервые число трансплантаций ПК превысило количество трансплантаций костного мозга [5, 6].
Прогресс в области трансплантации аллогенных ГСК ПК неразрывно связан с развитием банков ПК, созданных для обеспечения систематического сбора, тестирования, обработки, хранения, организации подбора и выдачи образцов ПК для трансплантации. На сегодняшний день все банки ПК разделены на государственные банки-регистры, работающие по принципу безвозмездного донорства и создающие накопительный материал для неродственных трансплантаций ГСК, и коммерческие, осуществляющие именное хранение криоконсервированной ПК для
e-mail: t_astrelina@mail.ru
Progress in transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells (HSC) of umbilical cord blood is associated with development of cord blood banks established to provide for the systematic collection, testing, processing, storage, organization and delivery of samples matching cord blood for transplantation. The aim of the study was to develop the algorithm of the Moscow bank's register of unrelated donor of umbilical cord blood HSC. The article described the biological characteristics of all the samples of umbilical cord blood, entered in the register remunerated donors of HSC of Moscow umbilical cord blood stem cell bank (as of 1cryopreservedcord blood sample). It is shown that a small number of unrelated donor of umbilical cord blood HSC in the register allow to select a compatible (6/6), donor-recipient pair with a frequency of 1:151probability. The proposed algorithm of the Moscow bank-register is recommended to use in creating, upgrading and operation of other bank-registers gratuitous unrelated donor of umbilical cord blood HSC.
Key words: algorithm, gratuitous unrelated donor, umbilical cord blood, stem cell bank-register, hematopoietic stem cells.
внутрисемейного использования. В настоящее время в мире насчитывается от 100 до 130 банков-регистров неродственных доноров ГСК [7—11], где на криохранение заложено более 600 тыс. полностью тестированных образцов ПК [12, 13]. 46 банков из 30 различных стран мира, в которых криоконсерви-ровано более 500 тыс. единиц ПК, объединены всемирной организацией доноров костного мозга (Bone Marrow Donors Worldwide — BMDW [11]). Также в Европе существует 18 банков, которые получили аккредитацию в NETCORD-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации [14, 15].
Современная система банков-регистров неродственных доноров ГСК ПК способна в короткие сроки накопить большое количество полностью тестированных и HLA-типированных образцов, что позволяет в короткие сроки создать регистр с набором уникальных гаплотипов [16—18, 10] и подобрать подходящего неродственного донора практически для всех пациентов, нуждающихся в трансплантации аллогенных ГСК.
Цель исследования — разработать алгоритм работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Оригинальные исследования
69
Материал и методы
В исследование были включены 4683 криоконсервированных образцов ПК, заложенных на криохранение в автоматизированной системе «BioArchive®» (ThermoGenesis, США), прошедших HLA-типирование, тестирование на вирусную и микробную контаминацию и внесенных в регистр неродственных доноров г. Москвы за период с 2004 по 2011 гг.. Получение ПК осуществляли у доношенных новорожденных 37—41 нед. гестации при самопроизвольных или оперативных родах при условии подписания матерями в дородовом периоде информированного согласия и отсутствии стандартных общемировых абсолютных противопоказаний. Сбор ПК осуществляли по принятой в роддоме методике в готовую закрытую систему для сбора крови (GreenCross, Южная Корея) объемом 250 мл со стандартным количеством гемоконсерванта CPDA (цитрат + фосфат натрия + декстроза + аденин). Поступившие образцы ПК проходили обязательную регистрацию. Обработка ПК проводилась в асептических условиях с целью уменьшения объема и удаления эритроцитов двумя методами: двойного центрифугирования (МДЦ) с использованием центрифуги «Cryofuge 5500i» и плазмоэкстрактора «AutoVolumeExpressor» и автоматического выделения клеток (МАВК) с помощью клеточного сепаратора «Sepax S1000» (Biosafe, Switzerland). После выделения ядросодержащих клеток непосредственно перед процессом криоконсервации в каждый образец ПК вводили криоконсервирующий раствор ДМСО в сочетании с декстраном-40 в стандартном количестве 5 мл до конечной концентрации 10%. Все обработанные образцы ПК подвергали немедленной криоконсервации в автомотизированном криокомплексе «BioArchive®».
Проводили тестирование ПК:
1. Оценивали биологические характеристики ПК до криохранения:
а) клеточный состав ПК: количество ядросодержащих (гранулоциты, нормобласты, лимфоциты, моноциты (TNC)) и мононуклеарных клеток (лимфоциты, моноциты (MNC)) определяли при помощи:
— автоматического гематологического анализатора ABX Pentra 60 C Plus (HORIBA ABX DiagnosticsInc., FRANCE) в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров.
— морфологической оценки мазков, окрашенных по методу Паппенгейма — Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая — Грюн-вальда и краской Романовского).
б) количество ГСК ПК оценивали по экспрессии мембранных маркеров в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами к CD34 и CD45 при помощи проточной цитометрии в аппарате FACS Calibur («BectonDickinson», США). Количество CD34+-клеток в криоконсервированной ПК оценивалось как 2 параметра: процент от общего количества лейкоцитов и абсолютное количество CD34+-клеток в 1 мл ПК и одном образце.
в) жизнеспособность полученных ядросодержащих клеток ПК оценивали с помощью проникающего в клетку красителя 7-ADD, связывающегося с ДНК, с определением количества CD45 + 7-ADD-негативных клеток на проточном цитофлуометре FACS Calibur.
г) колониеобразующую активность клеток ПК определяли при культивировании клеточной суспен-
зии ПК в метилцеллюлозе в течение 14 сут. при температуре 37°С в СО2-инкубаторе. Производили подсчет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1х105 эксплантированных клеток: КОЕ-mix — смешанные КОЕ, КОЕ-ГМ — гранулоцитарные и макрофагальные КОЕ, КОЕ-Г — гранулоцитарные КОЕ, КОЕ-М — макрофагальные КОЕ, КОЕ-Эр — эритроцитарные КОЕ. Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК полученные величины КОЕ умножали на число моно-нуклеарных клеток в 1 мл крови.
2. Определяли HLA-генотип образцов ПК. Выделяли ДНК из клеток ПК с использованием автоматизированной системы KingFisher. Проводили молекулярные методы типирования с применением ПЦР обратным дот-блоттингом методом SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) и методом с помощью аллель-специфических праймеров (SSP — Sequence Specific Primer).
3. В процессе обработки ПК определяли групповую принадлежность и проводили инфекционный контроль.
Статистическая обработка результатов проводилась для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена — Кейл-са; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критериев Крускалла-Уоллеса и Манна — Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики в программах Microsoft Excel, Microsoft Access, Statisticav 6.0, Biostat с двупольной таблицы при помощи программы «OpenEpi» 2.3 (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health). Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Ключевым моментом проведения трансплантации аллогенных ГСК ПК является наличие гистосовместимого донора ГСК и скорости его подбора в регистрах неродственных доноров.
За период с 2004 г. по 2011 гг. в Московский банк стволовых клеток поступило 8999 образцов ПК. В процессе тестирования 2182 (24,5%) образца ПК были отбракованы по различным причинам, из них 384 образца оказались инфицированы (101 образец (4,6%) — наличие маркеров вирусов гепатита В и С; 35 образцов (1,6%) — сифилиса; 248 образцов (11,36%) — бактериальная контаминация). 5251 образец ПК (58,4%) был заложен на криохранение. В регистр неродственных доноров ГСК было внесено 4683 образца ПК (52%), прошедших полный инфекционный контроль и типированных по пяти HLA-локусам: HLA-A, -B, -Cw, -DRB, -DQB1, что позволяет оперативно и эффективно осуществлять поиск необходимых образцов ПК.
На каждый образец криоконсервированной ПК был заведен паспорт образца для неперсонифицированного хранения, в котором были показаны биологические характеристики криоконсервированной ПК.
Средний объем образца криоконсервированной ПК составил 20,2±1,2 мл. Клеточный состав, жизнеспособность ядросодержащих клеток, количество
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
70
Оригинальные исследования
Сй34+-кпеток и колониеобразующая активность ГСК в криоконсервированных образцах ПК, внесенных в регистр неродственных доноров ГСК, представлены в таблице 1.
При анализе количественного распределения ядросодержащих клеток в криоконсервированных образцах ПК, внесенных в регистр неродственных доноров ГСК, были получены следующие данные: 702 (15%) образца ПК содержали от 36,3 до 99,9х107 ядросодержащих клеток, что позволяет их использовать для трансплантации у пациентов с весом до 30 кг; 2810 (60%) образцов ПК содержало от 100,0
до 199,9х107 ядросодержащих клеток, что дает возможность их трансплантации пациентам весом от 30 до 60 кг; 1171 (25%) образец содержал от 200,0 до 462,8х107 ядросодержащих клеток, что позволяет их использовать для пациентов с весом более 60 кг (рис. 1).
Технология поиска неродственных доноров ПК в Московском банке стволовых клеток основана на подборе пар донор-реципиент, совместимых по 3 генам HLA-системы, и состоит из ряда последовательных этапов, необходимых для получения положительного результата.
Таблица 1. Биологические характеристики криоконсервированных образцов ГСК ПК, внесенных в регистр безвозмездных неродственных доноров ГСК на 1 образец ПК (n = 4683)
Показатель О J х 2 Д О й z ю 1- о & О J 1- а» X « О ге z а Щ ю 2 О %CD45+7AAD-/ образец со''' о X ? + 8 3 ге 2 о-о \о о о 11 I! si <т 2 * X О Z ^ 2 ё° * X О м ё"° * X £ Z <? 2 ё"° * X
Среднее значение 1666,6 500,14 98,03 7,24 31,20 27,52 22,61 16,91 31,73
Стандартное отклонение 738,9 221,7 5,51 8,86 27,52 20,43 19,12 13,65 26,14
Стандартная ошибка среднего 13,13 3,94 0,1 0,16 0,49 0,36 0,34 0,24 0,46
Медиана 1509,9 452,98 97,0 4,5 23,33 23,33 16,66 13,33 26,66
25-й процентиль 1172,9 351,88 95,0 2,43 10,00 13,33 8,33 6,66 11,66
75-й процентиль 2000,2 600,07 99,0 8,6 45,00 36,66 31,66 23,33 46,66
Рис. 1. Количественное распределение ядросодержащих клеток в криоконсервированных образцах ПК, внесенных в регистр безвозмездных неродственных доноров ГСК
Этапы подбора доноров ГСК ПК:
1. «Первичный запрос на поиск ПК» из клинического центра.
2. Подбор всех предварительно совместимых и частично совместимых образцов ПК по 3 генам HLA-системы: A, B и DRB1.
3. Выдача результатов поиска ПК с информацией о биологических характеристиках в клинические центры или другие запрашивающие организации.
4. Запрос из клинического центра, другой запрашивающей организации с просьбой выполнить в подобранных образцах ПК HLA-типирование по локусу HLA-DRB1 по высокому разрешению.
5. Заявка из клинического центра, запрашивающей организации на резервирование или изъятие данных образцов ПК для последующего клинического применение.
6. Повторное подтверждающее HLA-типирование резервированных образцов ПК согласно международным стандартам.
За период с 2006 по 2011 гг. в Московский банк стволовых клеток поступило 454 первичных запроса на поиск ПК из разных клинических поисковых центров. В 403 случаях (88,8%) по первичным запросам были выявлены предварительно совместимые и частично совместимые по 3 генам HLA-системы (A, B и DRB1) образцы ПК. Из них в 241 случае по первичному запросу в базе данных регистра неродственных доноров для реципиентов ГСК были выявлены частично совместимые образцы ПК с двумя
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Оригинальные исследования
71
мисматчами по генам HLA-А или В (4/6), в 122 случаях — с 1 или 2 мисматчами (5/6 и 4/6), в 19 случаях были обнаружены частично совместимые образцы ПК с 1 мисматчем по HLA-A или В (5/6). В 51 случае (11,2%) не удалось обнаружить подходящие образцы ПК (рис. 2).
11,2% 0
88,8%
И Выявлены предварительно совместимые образцы ПК Я Не выявлены первично совместимые образцы
Рис. 2. Структура первичных запросов в Московском банке стволовых клеток (n = 454)
Предварительно совместимые образцы ПК по трем HLA-генам (6/6) были выявлены в 21 случае, из них в 4 случаях дополнительно были обнаружены образцы ПК с 2 мисматчами по генам HLA-A или В (4/6), в 8 — с 1 и 2 мисматчами (4/6 и 5/6), в 7 — с 1 мисматчем по генам HLA-A или В (5/6). Таким образом, в 21 случае (4,6%) с частотой вероятности 1:151удалось подобрать предварительно совместимые образцы ПК, в 156 случаях (34,4%) были обнаружены образцы ПК со степенью совместимости 5/6, в 375 случаях (82,6%) — со степенью совместимости 4/6 (табл. 2). Более частое совпадение результатов HLA типирования неродственного донора ПК и пациента в Московском банке стволовых клеток можно объяснить тем, что криоконсервированная ПК здорового населения Московского региона объединяет единую популяцию жителей Центрального региона РФ (восточнославянских европеоидов) и она востребована в трансплантационных центрах г. Москвы и г. Санкт-Петербурга.
По запросу трансплантационных центров у предварительно совместимых образцов ПК с реципиентом ГСК было выполнено подтверждающее HLA-типирование по высокому разрешению по локусу
HLA-DRB1 (highresolution). По международным данным вероятность подбора совместимых доноров ГСК после типирования с высоким разрешением составляет 1:5000 [6, 19, 20], в РФ по данным Карельского регистра — 1:700 [21]. При анализе HLA-подборов ГСК ПК с учетом гаплотипов в 4 национальных банках ПК — Японии, Швеции, Бельгии и Финляндии — показано, что пациенты из этих стран могут подобрать в своем национальном банке ПК 80% HLA-совместимого донора со степенью совместимости 5/6, а при перекрестном подборе — 26% [22]. Частота и распределение HLA-гаплотипов в каждом национальном банке ПК значительно различались, что говорило об их уникальном наборе га-плотипов в группах расовых и этнических популяций [22].
Срок подбора ГСК ПК с момента обращения в Московский банк-регистр безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК составлял максимум 2 сут., включая типирование с низким и высоким разрешением по локусам HLA-DRB1 у отобранных образцов ПК.
Полученные данные работы Московского банка-регистра неродственных доноров ГСК ПК свидетельствуют об объективной трудности подбора совместимого донора ГСК, обусловленной высоким генетическим разнообразием человеческой популяции, а также рядом других параметров донора, влияющих в конечном итоге на его отбор для реципиента.
Был разработан алгоритм безвозмездного донорства ГСК ПК для работы банков-регистров ПК (рис. 3). После отбора потенциальных доноров ПК и получения информированного согласия в дородовом периоде осуществляли сбор ПК без вмешательства в процесс родов (только после рождения ребенка) и доставляли ее в регистратуру. В регистратуре Московского банка стволовых клеток осуществлялась регистрация поступившей ПК в базе данных. Проводилась первичная отбраковка образцов ПК («чистый» вес меньше 60 грамм, нарушение герметичности мешка, неправильное заполнение документации, наличие тромбов и гемолиза, нарушение температурного режима в процессе хранения и транспортировки являлись критериями первичного исключения). В дальнейшем проводили обработку ПК двумя методами с помощью МДЦ и МАВК. После выделения ядросодержащих клеток все обработанные образцы ПК подвергали немедленной криоконсервации в автоматизированном системе «BioArchive®». Все криоконсервированные образцы ПК подвергались тестированию с определением групповой принадлежности, биологических характеристик, инфекционному контролю, а также проводилось
Таблица 2. Вероятность первичных подборов образцов ПК с различной степенью совместимости
Степень совместимости Количество случаев Вероятность подбора
абс. %
6/6 21 4,60 1:151
5/6 156 34,36 1:20
4/6 375 82,59 1:8
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
72
Оригинальные исследования
HLA-типирование по 5 генам. В последующем осуществлялась вторичная отбраковка образцов ПК по итогам инфекционного контроля. После паспортизации ПК данные о криоконсервированном образце ПК вносились в регистр безвозмездных доноров ГСК ПК. При получении из клинических центров первичного запроса на поиск неродственного донора ГСК ПК в информационной базе Московского банка стволовых клеток осуществлялся подбор всех предварительно совместимых и частично совместимых образцов ПК по трем генам HLA-системы —
A, B и DRB1. В случае совместимости криоконсервированной ПК с реципиентом по 4-6 локусам HLA-генов по запросу лечебных учреждений выполнялось HLA-типирование с высоким разрешением по локусам HLA-DRB1 у отобранных образцов ПК. При полной или частичной совместимости отобранных образцов ПК с реципиентом ГСК осуществлялось их резервирование для запрашиваемого клинического центра, проводилось повторное подтверждающее HLA-типирование резервированных образцов ПК и передача их в клинический центр.
Рис. 3. Алгоритм работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
Таким образом, был разработан алгоритм работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК. Охарактеризованы биологические характеристики всех образцов ПК, внесенных в регистр безвозмездных доноров ГСК ПК Московского банка стволовых клеток (на 1 криоконсервированный образец ПК). Показано, что небольшое количество безвозмездных неродственных
ЛИТЕРАТУРА:
1. Gluckman E., Broxmeyer H.A., Auerbach A.D. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. New Engl. J. Med. 1989; 321(17): 1174-78.
2. Glukman E. Ten years of cord blood transplantation: from bench to bedside. British J. Hematol. 2009; 147: 192-9.
3. Gluckman E. Milestones in umbilical cord blood transplantation. Blood Reviews 2011; 25(6): 255-9.
доноров ГСК ПК в базе данных регистра позволяет подобрать совместимую (6/6) пару донор-реципиент с частотой вероятности 1:151. Предложенный алгоритм работы Московского банка-регистра безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК рекомендуется использовать при создании, усовершенствовании и работе других банков-регистров безвозмездных неродственных доноров ГСК ПК.
4. Rubinstein P. Why cord blood? Hum. Immunol. 2006; 67: 398-404.
5. Rocha V., Broxmeyer H.E. New approaches for improving engraftment after cord blood transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 2010; 16; S126-32.
6. Broxmeyer H.E. Umbilical cord transplantation: epilogue. Semin. Hematol. 2010; 47(1): 97-103.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Оригинальные исследования
73
7. Welte K., Foeken L., Gluckman E. et al. International exchange of cord blood units: the registry aspects. Bone Marrow Transpl. 2010; 45: 825-31.
8. Lauber S., Latta M., Kluter H. et al. The Mannheim cord blood bank: experiences and perspectives for the future. Transfus. Med. Hemother. 2010; 37: 90-7.
9. Rubinstein P. Cord blood banking for clinical transplantation. Bone Marrow Transpl. 2009; 44: 635-42.
10. Navarrete C., Warwick R., Armitage S. et al. The London Cord Blood Bank. Bone Marrow Transpl. 1998; 22(1): 6-7.
11. http://www.bmdw.org
12. Wagner J.E., Gluckman E. Umbilical cord blood transplantation: the first 20 years. Semin. Hematol. 2010; 47(1): 3-12.
13. Gluckman E. Milestones in umbilical cord blood transplantation. Blood Reviews 2011; 25(6): 255-9.
14. http://www.netcord.org
15. Navarrete C., Contreras M. Cord blood banking. A historical perspective. Br. J. Haematol. 2009; 147: 236-45.
16. Armitage S., Warwick R., Fehily D. et al. Cord blood bankingin London: the first 1000 collections. Bone Marrow Transpl. 1999; 24: 139-45.
17. Davey S., Armitage S., Rocha V. et al. The London cord blood bank: analysis of banking and transplantation outcome. British J. Haematol. 2004; 125: 358-65.
18. Brown J., Poles A., Brown C.J. et al. HLA-A, -B and -DR antigen frequencies of the London Cord Blood Bank units differ from those found in established bone marrow donor registries. Bone Marrow Transpl. 2000; 25: 475-81.
19. Bray R.A., Hurley C.K., Kamani N.R. et al. National marrow donor program HLA matching guidelines for unrelated adult donor hematopoietic cell transplants. Biol. Blood Marrow Transpl. 2008; 14: 45-53.
20. Rocha V., Broxmeyer H.E. New approaches for improving engraftment after cord blood transplantation. Biol. Blood Marrow Transpl. 2010; 16: S126-32.
21. Иоффе Ю.Г. Современное состояние донорства гемопоэтических стволовых клеток в России. Клиническая онкогематология 2008; 4(1): 344-6.
22. Haimila K., Penttila A., Arvola A. et al. Analysis of the adequate size of a cord blood bank and comparison of HLA haplotype distributions between four populations. Hum. Immunol. 2013; 74(2): 189-95.
Поступила 14.06.3013
fWlHIMlI Hpiiwmn №ГТ[Д1^ШВ|1ЧЦ1ИН - tiiAH ТТЛ
>цг№’№№имГ} Ф«оttfoft Mtibi ocimuiiiwR mt rewtillkll И
№Ы[к>р1|ВДЯ фй|ЛСИП№ШМс±Тд4ЧЬЧ 1»(Л
лмшдаиЛ<ЗЛ1 4П0<|ы> ц
* ГсЧ>Л I ЯГ m I №1 fr НЧ F ДО С1!-ЙГТО11 фф IAA. ДЕТ П1Г ILAlrfllTCE К МП II |фаи|фсрши1ныт ю£ьй.и.шш11:
? Ы.ЦЯНыТ-ШШ11НП1 vrw^rw
: ^4C<LiW4№rFWUtaMpaiCiLUHLiM№ru»№MUMtf,Tl№
Q теракриш
j жтшпк nmpiw а псмгпшииА jpmirt а ШЛЕ}Л1 Kpsi
ikwiKmitthiiP нпшмт№ шЛТпегдко5
p fmfui ркадюр inTfTMw ЧЬШп---------------
p Iicilucwibic риса рпд>н1ш4 uiOorpoi P lECLIUngMIC JUKKA UJUHUILHI
D -осущктыанк!- иктроп поо^чщиттв ятпппжугшкга D Н1итрпгт¥,вшстш1апктс
П КИГТра.П- nCftOCni WOfU И М7И{НШ£КН1 ГрПН Ш1Н1П}
3 BirFwwwocti-knwHmnH лцш№рл« ироонeg ■ TT4ciBwtipoot®rJhi 3 rtj1* lrro№n^H4ncnl ipnwfrthmrt* fimiponu ёКТоя! WthcY^ril llfiftcrtni ft prfrtirlrAyij-drtl tan-rip;
D jraifienc iKTicub'WHiK.LV niL^H№fn
P tuiiLTjp/tipn жлшрли upafTMiiin uiirfiiinnui и^~'~Г'*-*г wiuium^crb циаибнм itfm Wfiymc
3 []|ЛШ] Кр*ТТИЛ.КТКТТ)Н11Ш11
D [WrtpW И MH№hM IrtfdrtmliK- ичНЬ4Нв№ И]Ч«,Т>|>Н|Ж] Ihrihfo tmtM ЧЛфШЕМил rpot^ij-pj
П Nk.'bn'lMr LWti *3hnUh КЗ |фг11FClClt ЬП HK*pPMIl.i|4 О ЛРМТХ*Э""'1
I [рсн IС ССЗ. I .
яЫаьаГе. 1 1
ГНГШН .VI4 ИН1Ф-1ГЯМ ffMrltaMx («Р+лМлЬ*. |||М^№<|ЧЛр
С-Лчнп ftrtrtfcVfksww.. Фя0никчар£н*гН4л. iirtfetumiiLip
дммиуцц.тгумп г.иупил< кпплн н; ie)ikmihiiedJ1, агрэтфервчестй 1фММ, НВДНЛГР И01Г», ц. ТЫР<VfW9Kтнпь П щишшу Ч*1К ррапхромемщл D Кшии сшп'па- лп бистрм wiwucmctoA uGfnGuixrt л£им1 uir ее Hipncnicirmi-c iutohh ypaMmaiciiwfcnKKoGHomi сютнс ikk.vdjkmk.i^iiu Q 1*С»ГЛН1ЬЧ nf4)l4*flW»(.bM.V^Wlfr<1bftWr4J^*bXtn>fc.
К111К1Л[д|1Н1ПП1ПШ E.KTCK них G>l uuinf
Q UpwiHiira jiffinmiii Squ.^ ниш id сатрацни цтгтшфртфлыппсы.
Жтилтлгишйи pnacTMib- 1алй1Р.,чгпггм iqwil- Л tfwi Kinnli hi itHilm'tnklF il ошпен
□ [Titerfua грсдин лцнелч ли иршми^пut л Miwrguaia.wiiH if tatnrwmn TtfaniiH^^nnKfunumn нг.иишнс). 1лл нта5мк1кч»г1му,н,||рс,Ф11рыы»гнр|ыя nwrvmeirroe kjkmb
D Ehifri^HU PfkMH IcN «№Лич**ЦН*Чкн*е*Ир|1 ■ ttkfHflCfl Afh»f4 MfMfl ntpen у 11 Dti otc 1гчс
□ Kail IHMSmj нроля CUfllKIfTlCI I ■PTlJIlMi.'GJILlf UMill H OTTllU ДН Wi Mi \Ui i и KMtf к Ю*а н ri * \ wf*i илиКя^1! I Urt-«РЧ1* i I wrt tint й hVrj,
‘qviiDLsrujia. ф.)
hCDE^BlI tpftXDUHTCJbOUU ■Иммизиыммц* w шы—дш Wfc
'tom*."ipiMin ii шпаи 1ЙitiE фиг~}IWj7¥T-*I-U
E-imB;
rtrjitip*i £1т1-ц<п[|[Ьл ■ rffc^lpl -HimcibriL tiM-HiHHlNn
The»mo9«'est'
'r;j
Лв1иЫ1ИИ4рвМНЙ1Л fllftTVl l.tl XpitMtHHClIlb'Knibll ■Ж*1кшн ЛИПТ
HkKArriihv It'fhn ■ир.Е»та<д*н C.UJ\|l Cj|^TOt*pbP»--4T»Mi lip H-vrpK
D Нн1ПРст1гчкчл[Н)С|Ш1Л1Л11юм1 nfmurcc»
■ Н|пхнк]мтмж11Д1ион11пн11л<]длн-обр^чи ф?нл ejhiwhhi ^ H Jipav^NIWflt WV(WiUill4
- Пмнт№Л№шттярй«м1ИЫ11 ччмврлблы перынил
О СпмшМяН iitptt t1ioikif>35«htw >ИЙ|Г
■ tie iptfijna {чншики шичесш лнирол дв Д|ИИ1»
[АС*** сил«и J^uAichn-e mew if 7
- 11НМ'ФЙ1СЯВУИ ►.’ГрдаИШИ Ц>РфДЫМ1ШК
О шШП*
•> 1Ьп^~илри~1|ш -срргтФл йцншлет Mlrurtkiinic Л юл нЛ лгЕрвюр!
■ IlcivminSrcnepeftiiiirhn пзттзиш вашиирл рвлнмиь'нлиоя чЛрнец Р (^УНЛС апдхчч г^щч^игм
- ЕЦшлрм 2+х нмпми* нян^м и >прмкян *xthp*j шжгшг щ «0л
МтпггормлГ >if4>filii ulLtJrtti ЛлЧ'й 11фЛ1к J-ПИ ПрГГ/Ш
I □ woiwp джл шитрлтрц хршлщлйсь Л ЙЛК диил
Ц|ГШ[Р41рОЫ1111ЫЙ HipOipiWHIUll HIMpUIUlUb
- MBIlHHipilipjl^lP^UKpiryjlIIIJC mfA.iH44
-OlfyKIPVm >ГМ1 [>>ади-41К^кК01ЛЗ(ЧШ1 М141Р^РЛММИГ>П1'11НЧЧАЧ1ДАЦС1
•■pilHtiml
Кр икпк1к|] и 15ч1
■ ПистаяныП ieinieqv4caqU(uuiqioGfHHii
- ЕкчтгФпииРчый гчвдим1 рри^ртл илилцей^лщил^
- Etol4lWllipnht4»Ci.1TH!Hp0Mlt1Kia ШЛиКИ IM
• CiiiEHleKi KfKBftncifc-OKiriui. сизшопЛ С'ФсмЛечнКлЫн^йлЛс^юи
Cicmai iipiutn D6pmm
- llailllk.UM»tte linpit-ibVli lELH.ILHiei CHIIltdlKH H^lllhyeWJI|aiWHltifl*HLH
- Ol'He itfitfjVll 1 [сторшж cOpanui ][ивап1ргвш11
Грлф« ЛЛ№1^Ч1Ж11ЛЛЛ1Н
hoUTflUt Ч1тгрлялы LI I Lf.OilllHHJHBIHHI nMlHUl KiniW |l ертНВН)!
Какизгсш Сг1№пд<11 i^.nnnipMiiBi tinwr ■ шрипл ешлвмЛД D t'flCn Н^С'длл pr imi—fxiMniiii ii(uiHiii>rii44fEin цасшл,
NK.-Din>A. T-KitotOk.
D CtKn DC Хж ■rjTinriiift'THHii -inL^njTiuu Linn.
IriiLUBapannaur cpr.iu CrUDm
p Ail n-Tvnimiquumii rcuaiamTqcc^in npanunqiwi
ч.чич. KK-Kmw.T-^4ti4 3 IX.1 дл1 лум-ии^чиашл МЦшти Lvmii K^.HijpLibiui hciiki VeeLtfr (cjubiu hi TFP ТеПпл)
['([к;re ||К1фП1и
Д1ч |-i;4i4tf>ni*itnVk,i rtfWtfWrlTThijx UCtuh. NK-hirm.
T'HCIUK H jaLifHIHhfl 1Х1ЛГ
^«.iiiii-'i lo iiiii1! Is.ru
4
: r Я
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
