CC BY
1
ОБЗОР
УДК 591.112.1
Современные представления о структурной основе и молекулярных механизмах трансмембранного транспорта d-
в кардиомиоцитах
Я.А. Воронина1,2> *©, A.M. Кархов1,2©, B.C. Кузьмин1,2©
Кафедра физиологии человека и животных, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, ул. Ленинские горы, д. 1, стр. 12; Научно-исследовательский институт экспериментальной кардиологии имени академика В.Н. Смирнова, Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии имени академика Е.И. Чазова Минздрава России,
Россия, 121552, г. Москва, ул. Академика Чазова, д. 15а 'e-mail: [email protected]
Внутриклеточная концентрация анионов хлора ([Cl-]^, равновесный потенциал для анионов хлора (ECl), а также трансмембранные хлорные токи (ICl) являются факторами, которые оказывают значительное влияние на электрофизиологические свойства возбудимой ткани, в том числе, миокарда. К настоящему моменту в сердце выявлено несколько типов хлорной (анионной) проводимости. В последние годы идентифицирован целый ряд трансмембранных белков, демонстрирующих хлорную проводимость (CFTR, ClC, TMEM16, LRRC8), а также подтверждена экспрессия этих макромолекул в ткани сердца. Накопленные данные позволяют установить молекулярный субстрат для некоторых хлорных анионных токов (ICl,PKA, ICl,ir, ICl,vol, ICl,sweu, ICl,Ca, Ito2), обнаруживаемых в сердце. Кроме того, установлены молекулярные механизмы регуляции [Cl"]j и ECl посредством хлорных котранспортеров (КСС, NKCC1) и хлор-бикарбонатных обменников. Множественность структур, определяющих хлорную трансмембранную проводимость, и сложность молекулярных механизмов регуляции хлорного гомеостаза лежат в основе комплексных и зачастую разнонаправленных эффектов активации хлорных переносчиков в ритмоводителе, проводящей системе и рабочем миокарде сердца. В данном обзоре рассмотрены структурные и биофизические свойства, а также молекулярная регуляция белковых комплексов — переносчиков хлора, идентифицированных в миокарде.
Ключевые слова: хлорные каналы, катион-хлорные котранспортеры, хлор-бикарбонатный обменник, хлорный транспорт, хлорные токи, электрофизиология сердца
DOI: 10.55959/MSU0137-0952-16-79-2S-4
Сокращения:
[Ca2+]j — внутриклеточная концентрация кальция;
[Cl-]I— внутриклеточная концентрация анионов хлора;
[Cl-]o — внеклеточная концентрация анионов хлора;
МП — мембранный потенциал;
CaCC — кальций-зависимые хлорные каналы;
CCC — котранспортеры катионов и хлора (Cation Chloride Cotransporter);
CFTR — трансмембранный регулятор муковис-цидоза (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator);
ClC — потенциал-управляемые хлорные каналы (Chloride Channels);
© Воронина Я.А., Кархов А.М., Кузьмин В.С., 2024
ECl — равновесный потенциал для анионов хлора;
GPCR — рецепторы, сопряженные с G-белком;
ICl — трансмембранный хлорный ток;
ICl,Ca - кальций-чувствительный хлорный ионный ток;
ICl,ir — активируемый гиперполяризацией хлорный ток с входящим выпрямлением;
ICl,PKA — РКА-зависимый хлорный ток;
KCC — котранспортер калия и хлора;
LRRC — белки, содержащие повторы, обогащенные лейцином (Leucine Rich Repeats Containing);
NKCC — котранспортер калия, натрия и хлора;
PKA — протеинкиназа А;
PKC — протеинкиназа С;
VRAC — анионные каналы, регулируемые объемом (Volume-Regulated Anion Channels).
1. Введение
Хлор является преобладающим неорганическим анионом в биологических системах. С середины XX в. известно, что хлор является одним из ионов, формирующих потенциал покоя и определяющих электрофизиологические свойства возбудимых клеток и тканей. Более полувека назад выяснено, что хлор является анионом, за счет которого происходит регуляция объема и осмо-лярности клеток.
На данный момент очевидно, что внутриклеточная концентрация анионов хлора ([С1-];), равновесный потенциал для анионов хлора (ЕС1), а также трансмембранные хлорные токи (1С1) являются факторами, которые значительно влияют на функционирование нейрональной ткани, мышечных клеток скелетной мускулатуры и гладко-мышечных клеток стенки сосудов. К примеру, хлорный гомеостаз определяет возбудимость, величину потенциала покоя, тонус, сократимость, синаптическую передачу и способность к реакции на нейротрансмиттеры в различных типах ткани.
Тем не менее, молекулярные структуры, опосредующие трансмембранную анионную хлорную проводимость в клетках различного типа и в кар-диомиоцитах, в частности, долгое время оставались неустановленными и, в ряде случаев, не определены до сегодняшнего момента. Этот факт лежит в основе некоторого игнорирования роли хлорного гомеостаза в физиологии определенных клеток и тканей, например, миокарда. Однако, начиная с 1980-х гг., происходит интенсивное исследование роли хлора в формировании электрической активности кардиомиоцитов. Показано, что анионы хлора и трансмембранные хлорные токи определяют конфигурацию потенциалов действия (ПД) в различных участках здорового сердца, а нарушение гомеостаза и трансмембранного переноса хлора вызывает изменение нормальной электрической активности, что приводит к сердечным патологиям и нарушениям ритма сердца.
В последние годы идентифицирован целый ряд мембранных белков, демонстрирующих хлорную проводимость. Также идентифицирован целый ряд молекул-кандидатов, которые потенциально могут осуществлять трансмембранный перенос анионов хлора. Перемещение анионов хлора через плазматическую мембрану реализуется белками трех функциональных типов: ионными каналами, обменниками и котранспортерами. В данном обзоре рассмотрены хлорные переносчики с четко установленными электрофизиологическими свойствами и молекулярной природой.
2. Трансмембранные хлорные каналы и переносчики
На данный момент свойства хлорных ионных каналов подтверждены для пяти семейств (групп) трансмембранных макромолекул. Первое семейство включает пентамерные лиганд-управляемые
анионные каналы (например, рецепторы глицина или рецепторы гамма-аминомасляной кислоты А-типа), относящиеся к классу Cys-петлевых рецепторов. К настоящему времени нет доказательств экспрессии лиганд-управляемых хлорных каналов в миокарде и/или мембране кардиомиоцитов. Единственным представителем второй группы является трансмембранный регулятор му-ковисцидоза (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator - CFTR) - трансмембранный переносчик ABC-типа, который обладает хлорной проводимостью. Следующее (третье) семейство включает гомодимерные «двухпоровые» потенциал-управляемые хлорные каналы, обозначаемые ClC (Chloride Channels). Однако из 9 типов хлорных каналов семейства ClC, найденных у млекопитающих, только четыре являются «настоящими» каналами (ClC-1, -2, -Ka и -Kb), а остальные — 0-/Н+-обменники (ClC-3, -4, -5, -6, -7). Четвертое семейство включает потенциал-и Ca2+-зависимые хлорные каналы, обозначаемые CaCC [1]. В настоящее время показано, что свойствами Ca2+-зависимого хлорного канала обладают гомодимерные «двухпоровые» белки TMEM16A и TMEM16B. Наконец, к пятому семейству относятся гексамерные «паннексин-по-добные» анионные каналы, регулируемые объемом (Volume-Regulated Anion Channels, VRAC), которые образованы белками группы LRRC8 (белки, содержащие повторы, обогащенные лейцином — Leucine Rich Repeats Containing (LRRC) protein). В настоящее время имеется крайне мало информации касательно функционирования, распределения и регуляции VRAC-каналов, состоящих из мономеров LRRC8 в сердце.
Помимо вышеперечисленных пяти семейств, имеется целый спектр белков или макромолеку-лярных белковых комплексов, которые имеют признаки хлорной проводимости. Среди таких структур-кандидатов следует упомянуть бестро-фины (BEST1-4), TMEM206, белки семейства TWEETY (TTYH1-3), а также белки семейства SLCO2 (SLCO2A1 — трансмембранный переносчик простагландинов). Бестрофины являются пентамерными Ca2+-управляемыми хлорными каналами [2] с узким диапазоном чувствительности к внутриклеточному Са2+. Преимущественно бестрофины экспрессируемыми в сетчатке. Ди-мерные белки TWEETY также могут быть Ca2+-управляемыми хлорными каналами [3]. Предполагается, что TMEM206 является основной, порообразующей субъединицей канала, проводящего рН-чувствительный, активируемый «за-кислением» (ASOR или PACC) хлорный ток; в свою, очередь, SLCO2A1 возможно является молекулярной основой хлорного тока и каналов сверхвысокой проводимости, обозначаемых «Maxi-Cl» [4]. Имеющиеся к настоящему моменту данные о свойствах вышеперечисленных четырех
типов молекул достаточно противоречивы, а их экспрессия в миокарде надежно не установлена. В связи с этим, здесь будут рассмотрены лишь те макромолекулы, для которых подтверждена хлорная проводимость и экспрессия в сердце, а также имеются сведения, указывающие на функциональную роль этих каналов в миокарде (табл. 1). Перечень таких каналов включает CFTR, ClC-2, CaCC (TMEM16) и VRAC (LRRC8x).
2.1. Трансмембранный регулятор муковисцидоза — CFTR
Каналы CFTR относятся к большому суперсемейству АТФ-связывающих кассетных транспортеров, широко представленных во всех живых организмах [5]. АВС-транспортеры обеспечивают выведение малых органических молекул во внеклеточную среду из мембраны и цитоплазмы за счет гидролиза АТФ. Белки этого семейства имеют довольно консервативную структуру. Молекула канонического ABC-транспортера состоит из четырех доменов, два из которых являются транс -мембранными, а остальные два цитозольными или нуклеотид-связывающими. Каждый из двух трансмембранных доменов содержит 6 a-спиралей. Как правило, у эукариот все четыре домена ABC-транспортера являются частью одной полипептидной цепи. CFTR относится к классу С белков ABC, для которых характерна связь четырех доменов в одну полипептидную цепь. Гомологичные части CFTR связаны друг с другом цитозольной регуля-торной цепью — R-доменом [5] (рис. 1А).
Каналы CFTR в большом количестве обнаруживаются в кардиомиоцитах (рис. 1А Приложение). Для каналов CFTR характерно так называемое Гольдмановское выпрямление. Это означает, что зависимость величины тока, текущего через CFTR, от мембранного потенциала (вольт-амперная характеристика) близка к Гольдманов-ской (рис. 2А). Такой вид вольт-амперной характеристики указывает на отсутствие каких-либо воротных механизмов в канале CFTR. При записи электрической активности одиночных активиро-
ванных каналов CFTR наблюдаются типичные дискретные ступенчатые скачки проводимости и дискретные переходы между закрытыми и открытыми состояниями. Достаточно длительные периоды пребывания CFTR в открытом состоянии (0,1—0,2 мс) сменяются периодами закрытого состояния (1—2 мс) [6, 7].
Для того чтобы канал CFTR приобрел способность перейти в открытое состояние, необходимо, во-первых, фосфорилирование регулятор-ной R-цепи цАМФ-зависимой протеинкиназой (РКА) [8], а во-вторых — связывание АТФ с ну-клеотид-связывающими доменами [9]. Несмотря на то, что АТФ необходим для открытия канала CFTR, внутриклеточная концентрация АТФ не является регулятором активности каналов, поскольку физиологическая регуляция проводимости каналов осуществляется за счет фосфорили-рования / дефосфорилирования белка CFTR. Показано, что фосфорилирование CFTR протеинкиназой С (PKC) приводит к открытию канала CFTR [8]. По некоторым данным, полная активация CFTR возможна только при фосфорилирова-нии PKC в дополнение к РКА [10]. На активность CFTR также могут влиять АМФ-зависимая про-теинкиназа (АМРК) [11], тирозинкиназы [12] и Ca2+/кальмодулин-зависимые протеин-киназы ^аМК) [6]. В свою очередь, «классические» фос-фатазы белков, например, фосфатаза 2А (РР2А), дефосфорилируя CFTR, снижают его проводимость и уменьшают время пребывания канала в открытом состоянии [13]. Таким образом, CFTR является типичным каналом, проводимость и величина тока которого зависят от уровня фосфо-рилирования. Считается, что большая часть так называемого РКА-зависимого хлорного тока (1а,РКА) формируется каналами CFTR.
Поскольку CFTR является АВ ^транспортером, целый ряд органических анионов с молекулярной массой 200—1000 Да могут блокировать CFTR. Как правило, степень блокирования зависит от величины мембранного потенциала (МП) и оказывается более выраженной при более отри-
Таблица 1
Основные характеристики хлорных ионных каналов миокарда
Каналы CFTR ClC2 CaCC (TMEM16A) VRAC (LRRC8)
лиганд-управляемость нет нет нет нет
электронейтральность нет нет нет нет
избирательность ионы галогенов ионы галогенов ионы галогенов ионы галогенов, органические осмолиты
потенциал-управляемость (гейтинг) - + при ^а2+]; <1 мкМ -
выпрямление Гольд-мановское входящее при ^а2+]; <1 мкМ выходящее Гольд-мановское
кальций-чувствительность - - +++ +
механочувствительность - + + +++
регуляция протеинкиназой А +++ + - -
регуляция протеинкиназой C + - - -
цательных значениях МП. Потенциал-зависимость блокирующего действия наблюдается для таких соединений как флюфенаминовая кислота, глибенкламид, 5 -нитро-2- (3 -фенилпропиламино) бензойная кислота (NPPB) [14], 3-^-морфолино) пропансульфоновой кислота (MOPS) и антрацен-9-карбоновая кислота [6].
2.2. Семейство хлорньх каналов С1С Трансмембранные белки семейства С1С широко представлены у всех типов животных. У млекопитающих С1С экспрессируются в большинстве типов клеток и участвуют в поддержании анионного гомеостаза, потенциала покоя, а также в регуляции клеточного объема. Среди представителей
Рис. 1. Структура основных белковых комплексов, обладающих свойствами хлорных анионных каналов в миокарде. На верхних панелях показан вид канала с внеклеточной стороны в плоскости плазматической мембраны. Зеленым цветом в структуре белка показаны а-спирали, желтым цветом — р-складки, фиолетовым цветом — 310-спираль. А. Структура канала CFTR и его расположение в плазматической мембране с указанием локализации АТФ-связывающих доменов и регуляторного домена (К). Б. Структура канала С1С-2 и его расположение в плазматической мембране с указанием ионных пор, формируемых каждой из субъединиц канала (Р1 и Р2). В. Структура канала ТМЕМ16А и его расположение в плазматической мембране с указанием ионных пор, формируемых каждой из субъединиц канала (Р1 и Р2), кальций-связывающего «кармана» канала (Са2+) и потенциал-чувствительного участка канала (Уш). Г. Структура канала LRRC8A и его расположение в плазматической мембране с указанием домена, содержащего повторы, обогащенные лейцином ^ККС). Молекулярные структуры сконструированы с помощью https://www.rcsb.org/
этого семейства можно выделить две структурно похожие, но функционально различные группы. К первой группе относятся потенциал-зависимые хлорные каналы (ClC-1, -2, -Ka и -Kb, K — kidney — «почечные»). ClC-1 (C1CN1) является самым изученным хлорным каналом. Экспрессия C1C-1, как и C1C-Ka/b, в сердце не показана. Ко второй группе (C1C-3, -4, -5, -6, -7) относятся трансмембранные белки, которые проницаемы не только для ионов хлора, но и для протонов, и, фактически, являются 0-/Н+-обменниками (антипортерами), которые в основном локализуются в мембране внутриклеточных органелл (эндосом, лизосом, везикул).
Все белки семейства С1С состоят из двух идентичных субъединиц, хотя могут образовывать и гетеродимеры [15]. Каждая из субъединиц содержит 18 а-спиралей, 17 из которых являются трансмембранными. Некоторые а-спирали являются короткими и не полностью пересекают мембрану, что приводит к появлению небольших петель внутри мембраны, которые формируют внутриканальные «пути» для анионов и протонов. С-концевой фрагмент каждой субъединицы ОС-белков содержит два эволюционно консервативных регуляторных СВВ-домена, которые связывают цитоплазматический АТФ, АМФ и другие пуриновые нуклеотиды.
Рис. 2. Вольт-амперные характеристики основных хлорных (анионных) токов клеток миокарда при различных концентрациях внутриклеточного С1- ([С1-];) и внутриклеточного Са2+ ([Са2+];). На вставках представлен увеличенный участок вольт-амперных характеристик с точками пересечения кривых с осью Х, что соответствует равновесному хлорному потенциалу. А. РКА-зависимый хлорный ток, формируемый каналом CFTR. Б. Хлорный ток аномального выпрямления, формируемый каналом С1С-2. В. Са2+-зависимый хлорный ток, формируемый каналом ТМЕМ16А. Г. Объем-регулируемый хлорный ток, формируемый каналом LRRC8. Внеклеточная концентрация С1- ([С1-]0) составляет 110 ммоль/л. Модельные кривые построены с использованием уравнения Гольдмана-Ходжкина-Каца (ГХК) для трансмембранного ионного тока. Модельные кривые для ионных токов демонстрирующих потенциал-зависимость и/или кальций-зависимость получены перемножением ГХК на равновесную вероятность пребывания канала в открытом состоянии или коэффициент, пропорциональный [Са2+];. Диапазон, ограниченный кривыми для 10 и 40 ммоль/л [С1-];, соответствует возможным величинам ионного тока, потенциально достигаемым в кардиомиоцитах различных отделов сердца.
Важно, что трансмембранный перенос ионов хлора каждой субъединицей каналов ClC-семей-ства является кинетически независимым, так как каждая субъединица димерного канального комплекса формирует собственный структурно полноценный ионный путь (рис. 1Б). Следует отметить, что ионы хлора могут перемещаться внутри канала по двум траекториям вблизи цитоплазма-тической границы мембраны, поэтому ионный путь ClC не является «порой» в строгом смысле этого термина. Каналы ClC обладают несколькими типами воротного механизма, которые определяют их потенциал-зависимость. Предполагается, что имеются быстрый воротный механизм («быстрые активационные ворота»), определяющий индивидуальное состояние каждой «монопоры», а также медленный воротный механизм, влияющий на доступность пути обоих мономеров одновременно [16]. Высказано предположение о том, что быстрая потенциал-зависимая активация (быстрый воротный механизм) не связана с наличием потенциал-чувствительных сегментов в канальном комплексе [17]. Действительно, субъединицы и канальные комплексы ClC лишены сенсора потенциала с канонической структурой. Вероятно, механизмы потенциал-зависимой активации и деактивации значительно различаются для налов разного типа (0^1, -2, -Ка и -КЬ). Эта особенность выражается в том, что вольт-амперные характеристики 0^1, -2, -Ка и -КЬ имеют различный вид.
2.2.1. С1С-2
0^2 являются потенциал-зависимыми хлорными каналами плазматической мембраны, которые обнаруживаются в большинстве тканей млекопитающих [15]. Среди всех ClC в сердце и непосредственно в кардиомиоцитах обнаруживается высокий уровень экспрессии именно 0^2 (рис. 1Б Приложение).
Как и другие каналы этого семейства, 0^2 — димеры с двумя порами [18]. Для 0^2 характерны медленные и быстрые воротные механизмы, обуславливающие потенциал-зависимость канала. Предполагается, что быстрая потенциал-зависимая активация СЮ-2 обусловлена электростери-ческим механизмом: в тех условиях, когда ^ < Еа (например, при гиперполяризации) происходит поступление внутриклеточных ионов хлора во внутренние «воротные» порообразующие области молекулы. Электростатическое отталкивание ионов хлора и поляризованного отрицательно заряженного остатка глутамата приводит к изменению положения последнего в результате разрушения одних и формирования других водородных связей («глутаматные ворота»), что делает пору доступной для перемещения анионов [16]. В тех условиях, когда Ут > Ее; электрическое поле препятствует поступлению внутриклеточного О- в канал и пре-
одолению электростерических глутаматных ворот. Таким образом, гиперполяризация (Vm < ECl) приводит к активации, а деполяризация (Vm > ECl) к деактивации канала. Электростерический воротный механизм приводит к тому, что вольт-амперная характеристика для ClC отклоняется от «классической» кривой с Гольдмановским выпрямлением (рис. 2А) и приобретает вид кривой с направленным внутрь (или «аномальным», или «входящим») выпрямлением ("inward rectifying", «ir»; рис. 2Б).
В связи с особенностями воротного механизма, в нативных условиях анионный ток через каналы ClC-2 является активируемым гиперполяризацией с входящим выпрямлением (IClir). Амплитуда и потенциал реверсии (ECl) тока IClir зависят от концентрации ионов хлора по обе стороны мембраны. Повышение [Cl-]i приводит к смещению ECl к менее отрицательным значениям и соответственному смещению значения МП, при котором этот канал может быть активирован и проводить деполяризующий ток — входящий по направлению движения положительных зарядов, но выходящий по направлению перемещения анионов Cl- (рис. 2Б). При низкой [Cl-]i ток через каналы ClC-2 приобретает сильную зависимость от внеклеточной концентрации хлора ([Cl-]o).
Состояние канала ClC-2 сильно зависит от внутриклеточного pH: небольшое снижение pH (закисление цитоплазмы, повышение [H+]i) приводит к облегчению активации канала, однако при дальнейшем снижении pH канал закрывается [19]. Механизм увеличения проводимости при снижении рН заключается в том, что протоны нейтрализуют отрицательный заряд глутамата «глутаматных ворот», облегчая поступление внутриклеточного хлора в «вестибюль» канала. Кроме того, каналы ClC-2 также могут быть активированы внутриклеточной гиперволюмией [19]. Каналы ClC-2 могут быть прямой или косвенной мишенью протеинки-наз различного типа [20, 21]. Проблемой в исследовании свойств и роли ClC-2 является отсутствие их низкомолекулярных лигандов с высоким сродством и избирательностью [15].
2.3. Са2+-чувствительныехлорные каналы — СаСС
Как указано выше, структуры, обладающие хлорной проводимостью, потенциал-зависимостью и чувствительностью к Ca2+, обозначают как СаСС. Хлорный ионный ток, демонстрирующий потенциал- и Ca2+-чувствительность, формируемый СаСС, принято обозначать как IClCa. Ранее считалось, что молекулярной основой CaCC являются гомо-димерные канальные белки, где каждый мономер состоит из 8 трансмембранных сегментов (а-спиралей) [1]. Такие белки были названы анок-таминами (Ano) [22—23]. Однако в недавних исследованиях [24—26] установлено, что каждый мономер порообразующей субъединицы CaCC включает
10 трансмембранных а-спиралей. Белки такого типа ранее получили обозначение TMEM16, как одно из семейств слабо похожих трансмембранных белков с неизвестной функцией, объединяемых в группу TMEM (TransMEmbrane Members). На данный момент нет никаких сомнений, что гомо-димеры TMEM16A (Anol) или TMEM16B (Ano2) являются молекулярными субстратами для CaCC и порообразующими субъединицами для тока IClCa [27]. Каждый из мономеров гомодимерного канала TMEM16 имеет пору, проницаемую для ионов хлора. Таким образом, СаСС являются «двухпоровыми» каналами (рис. 1В). Каналы TMEM16A/B широко экспрессируются в кардио-миоцитах мышей, собак, [28], кроликов [29] и свиней [30]. Уровень экспрессии TMEM16 в миокарде человека, в отличие от других млекопитающих, невысок (рис. 1В Приложение) [31].
Проводимость каналов TMEM16A, экспрес-сируемых в гетерологических системах, увеличивается при деполяризации, но снижается при гиперполяризации, поэтому ток ICl,Ca демонстрирует свойства тока выходящего выпрямления (рис. 2В) [32]. Однако основной особенностью CaCC / TMEM16A является регуляция его проводимости цитозольным Ca2+ [33].
Каждый из димеров канала CaCC/TMEM16A может связывать два иона Ca2+. Связывание, по-видимому, происходит кооперативно [34—35]. Однако в структуре TMEM16A не обнаружено канонических Са2+-связывающих мотивов. Предполагается, что последовательность аминокислот в первой внутриклеточной петле образует «кальциевый карман» (рис. 1В), характерный, например, для Ca2+-активируемых калиевых каналов большой проводимости (BK, Big Potassium) [1]. Отрицательно заряженные остатки аминокислот «кальциевого кармана» TMEM16A обращены в «просвет» проводящей поры [36].
Считается, что потенциал-чувствительность CaCC / TMEM16A обусловлена прямым потенциал-зависимым связыванием Ca2+ отрицательно заряженными аминокислотными остатками «кальциевого кармана» [24—25]: чем более поло-жительнее потенциал, тем более эффективно ионы Ca2+ проникают из цитоплазмы в Ca^-свя-зывающий карман, нейтрализуя негативный электростатический заряд в поре и делая ее доступной для ионов хлора. Кроме того, чем выше [Ca2+]i, тем больше каналов TMEM16A будет активировано. Таким образом, потенциал-чувствительность и зависимость от [Ca2+]i для CaCC / TMEM16A являются связанными характеристиками. Повышение [Ca2+]i приводит к увеличению как входящей, так выходящей компоненты тока через CaCC / TMEM16A (рис. 2В).
Тем не менее, IClCa при низкой (базальной, < 0,1 мкМ) [Ca2+]i, соответствующей состоянию покоя клетки, также может быть потенциал-зави-
симо активирован [37]. Считается, что потенциал-зависимость CaCC / TMEM16A при нулевой или очень низкой [Ca2+]i обусловлена либо наличием у канала отдельного «неканонического» Ca^-не-зависимого сенсора потенциала (рис. 1В), либо — потенциал-зависимым протонированием аминокислотных остатков Ca2+-связывающего кармана и других цитоплазматических участков молекулы [38]. Закисление цитоплазмы приводит к увеличению вероятности пребывания TMEM16A в открытом состоянии и увеличению IC1Ca при всех значениях МП [39]. Помимо прочего, проводимость TMEM16A и величина Iq Ca зависит от [C1-]o. В итоге, механизм активации каналов TMEM16A крайне сложен, поскольку определяется [Ca2+]i, мембранным потенциалом, внутриклеточным рН и [C1-]o; канал CaCC / TMEM16A нельзя, в строгом смысле, определить как потенциал-управляе-мый. В свою очередь, наличие потенциал-чувствительности при нулевой [Ca2+]i не позволяет рассматривать канал и как лиганд-управляемый.
Установлено, что активация CaCC / TMEM16A происходит за счет Ca2+, поступающего через потенциал-зависимые кальциевые каналы, неселективные катионные каналы, а также при высвобождении Ca2+ из саркоплазматического ретику-лума [40]. TMEM16B менее чувствителен к Ca2+, чем TMEM16A, а кинетика Ca2+-зависимой активации и деактивации TMEM16B намного быстрее, чем у TMEM16A [22, 41]. Следует отметить, что после активации кальцием для TMEM16A /В не наблюдается инактивации канала со временем.
CaCC / TMEM16A является мишенью целого ряда внутриклеточных сигнальных молекул и ки-наз [37]. Комплекс Са2+/кальмодулин активирует TMEM16A [42—43]. Как и в случае со многими другими каналами, фосфолипиды (фосфатиди-линозитол-4,5-бисфосфат) и производные холестерина [44] оказывают существенное влияние на способность CaCC / TMEM16A к активации [45]. В некоторых работах выявлена чувствительность TMEM16A к механическим стимулам [46]. Для CaCC / TMEM16A показана активация, опосредованная G-белок сопряженными рецепторами (GPCR) [33, 35].
Показано, что классические блокаторы анионной проводимости — DIDS (4,4'-diisothiocy-anatosti1bene-2,2'-disu1fonic acid), NPPB (5-nitro-2-(3-pheny1propy1amino) benzoic acid) и 9-AC (9-anthracene carboxy1ic acid) [1] обладают блокирующим действием относительно СаСС / TMEM16. В ряде исследований показано, что такие соединения как T16inh-A0, CaCCinh-A01, бензбромарон, дихлорфен и гексахлорфен могут быть блокаторами TMEM16A [47, 49]. Предполагается, что высокоселективным ингибитором TMEM16A является ^((4-метокси)-2-нафтил)-5-нитроантраниловая кислота (MONNA) [50].
2.4. Хлорные каналы, регулируемые
внутриклеточным объемом (VRAC), — LRRC8x
Молекулярный субстрат для трансмембранной анионной проводимости, регулируемой объемом, долгое время не был установлен. В литературе имеется множество вариантов обозначения предполагаемых «объем-чувствительных» каналов, например, VSOR (чувствительные к объему каналы выходящего выпрямления), VSOAC (чувствительные к объему каналы анионов / органических осмолитов) или VRAC (регулируемые объемом анионные каналы), которые представляют собой гомо- или гетерогексамеры, сформированные трансмембранными белками семейства LRRC8.
Гетерогексамеры LRRC8 могут включать мономеры пяти разных типов: LRRC8A...E [51]. Все LRRC8 имеют трансмембранный порообразую-щий домен, который состоит минимум из четырех трансмембранных а-спиралей и в высокой степени гомологичен трансмембранному домену кон-нексинов и иннексинов. Предполагается, что филогения LRRC8 связана с паннексинами и другими белками щелевых контактов [52]. Помимо трансмембранного домена, каждая молекула белка LRRC8 имеет внеклеточный домен и внутриклеточный, C-концевой домен, богатый лей-циновыми повторами (LRR) с характерной третичной структурой (рис. 1Г) [53]. Биофизические свойства каналов-гексамеров зависят от их субъединичного состава [54—55].
Белок LRRC8A, также известный как Swell 1, является обязательной субъединицей гексамерно-го канала VRAC / LRRC8 [56-57]. Функциональный канал представляет собой гетеромер, включающий LRRC8A и любые другие мономеры (LRRC8B, C, D или E) [15]. Подавление экспрессии LRRC8A приводит к уменьшению активируемого гиперволюмией хлорного тока (ICl,vol), однако элиминация любой другой из субъединиц не влияет на этот ток [57-58].
Установлено, что VRAC / LRRC8 экспресси-руются во всех типах клеток позвоночных животных, в том числе и в кардиомиоцитах (рис. 1Г Приложение). Показано, что в сердце в наибольшей степени экспрессируется LRRC8C [59]. Кар-диомиоциты человека экспрессируют LRRC8A, LRRC8B, LRRC8C и LRRC8E.
Считается, что эти каналы играют ключевую роль в поддержании клеточного объема [51]. Проводимость вышеуказанных каналов увеличивается в ответ на гиперволюмию и (гипо)осмотический стресс, что способствует возвращению клеток к исходному объему и исходной осмолярности за счет регулируемого выхода из цитоплазмы ионов галогенов и отрицательно заряженных органических осмолитов. Считается, что восстановление клеточного объема реализуется за счет пассивного трансмембранного, направленного наружу пере-
мещения молекул воды, происходящего вслед за активацией VRAC/LRRC8 [52].
Хлорный анионный ток через каналы VRAC / LRRC8, обозначаемый как IClvol или ICl,swell, имеет входящую и выходящую компоненту и демонстрирует свойства выходящего выпрямления, близкого к Гольдмановскому (рис. 2Г). Для ICl,vol характерна инактивация со временем, наблюдаемая при положительных значениях МП. Выраженность этой инактивации зависит от типа белков LRRC, формирующих ионный канал [51]. Анионная избирательность VRAC / LRRC8 обусловлена высоким положительным электростатическим зарядом проводящего пути канала.
Проводимость VRAC / LRRC8 зависит от концентрации внутриклеточного АТФ, рН цитоплазмы, а также от [Ca2+] [61—62]. Повышение [Ca2+] способствует увеличению проводимости VRAC при всех значениях МП (рис. 2Г). При снижении pH от 7,4 до 6 проводимость увеличивается, однако дальнейшее снижение pH подавляет VRAC / LRRC8.
VRAC / LRRC8 являются мишенью киназ, сопряженных с GPCR [63]. Фосфорилирование ки-назами PKCa и PKCP усиливает активацию VRAC / LRRC8 каналов внутриклеточным АТФ [64]. Проводимость VRAC / LRRC8 модулируется пури-новыми рецепторами Р^2-типа [65]. Также известно, что ингибирование киназы легких цепей миозина подавляет проводимость, а ингибирова-ние фосфатазы легких цепей миозина увеличивает проводимость VRAC / LRRC8 [51]. Кроме того, ингибирование Rho / Rho-киназного пути приводит к нарушению активации VRAC / LRRC8 вплоть до их полного подавления проводимости [66].
3. Транспортеры и обменники хлора
Наряду с хлорными каналами в сердце широко представлены хлорные трансмембранные АТФ-не-зависимые переносчики и обменники, которые определяют [Cl"]j и, соответственно, ECl, оказывая влияние на электрофизиологические характеристики миокарда (табл. 2). В настоящее время известно множество хлор-катионных и хлор-анионных трансмембранных переносчиков, которые могут быть как электронейтральными, так и электрогенными. Ключевую роль среди хлор-катионных ко-транспортеров (или симпортеров) в сердце играют NKCC и KCC, относящиеся к крупной группе трансмембранных молекул SLC12 (SoLute Carrier) [67]. Среди хлор-анионных транспортеров в сердце важны хлор-бикарбонатные антипортеры или иначе ClyHCO^-обменники [68], являющиеся членами семейств SLC4 или SLC26 [15].
3.1. Котранспортеры катионов и хлора
Котранспортеры катионов и хлора (CCC -Cation Chloride Cotransporter) обеспечивают трансмембранный электронейтральный симпорт Cl- и K+ или Na+. Семейство SLC12 включает
единственный котранспортер SLC12A3, переносящий один №+ и один С1- (КСС), два котранспор-тера ^С12А2 - ККСС1 и SLC12A1 - ККСС2), которые осуществляют одновременный (однонаправленный) перенос Ка+, К+ и двух С1- (ККСС), а также четыре котранспортера, осуществляющие однонаправленный перенос К+ и С1- (КСС, SLC12A4 - КСС1, SLC12A5 - КСС2, SLC12A6 -КСС3, SLC12A7 - КСС4) [69]. Структура всех ССС (SLC12) сходна - мономер котраспортера включает 12 трансмембранных а-спиралей и крупные внутриклеточные К- и С-концевые до-
Основные
мены [70] (рис. 3). Все котранспортеры этого семейства, за исключением КСС4, являются диме-рами [67, 71].
Активность ССС находится под тесным контролем со стороны множества регуляторных факторов, например, агонистов GPCR. Более того, полученные к настоящему времени данные указывают на тканеспецифичный характер регуляции ССС со стороны рецепторов и их внутриклеточных сигнальных каскадов [72, 73]. Например, в изолированных гладкомышечных клетках аорты крысы увеличение концентрации цАМФ при стимуляции
Таблица 2
еров и обменников хлора в миокарде
Котраспортеры Обменники
Транспортеры HCOз-/Cl--обменник
SLC12A2 SLC12A4 SLC4A SLC26A
Стехиометрия Ша+:1К+:2С1- (все ионы внутрь) 1К+:1С1- (все ионы наружу) 1НС03-(наружу): 1С1-(внутрь) пНС03-(наружу):1С1-(внутрь) или 1НС03-(наружу):2С1-(внутрь) или 1НС03-(наружу):1С1-(внутрь)
Электронейтральность + + + +/-
Потенциал-зависимость + + - -
Механочувствительность активация при уменьшении объема клетки активация при увеличении объема клетки - -
Зависимость от [cl-] повышение [С1-]; подавляет ККСС повышение [С1-]; подавляет КСС - -
Рис. 3. Структура хлорных трансмембранных котранспортеров (симпортеров). На верхних панелях показан вид транспортеров с внеклеточной стороны в плоскости плазматической мембраны. Зеленым цветом в структуре белка показаны а-спирали, желтым цветом - |3-складки, фиолетовым цветом - 310-спираль. А. Структура котранспортера катионов калия и анионов хлора (КСС) семейства ВЬС12А с указанием пор или анионных проводящих путей, формируемых каждой субъединицей димера (Р1 и Р2). Б. Структура котранспортера катионов калия, натрия и анионов хлора (ККСС1) семейства ВЬС12А с указанием пор или анионных проводящих путей, формируемых каждой субъединицей димера (Р1 и Р2). В. Взаиморасположение субъединиц инактиви-рованного транспортера ККСС1. Молекулярные структуры сконструированы с помощью https://www.rcsb.org/
в-адренорецепторов и аденилатциклазы (АЦ) вызывает подавление активности NKCC1, тогда как повышение [Ca2+]i увеличивает его активность [74—75]. В то же время, повышение внутриклеточной концентрации цГМФ в гладкомышечных клетках не оказывает влияния на NKCC1, но повышает активность КСС [76].
Котранспортеры семейства ССС имеют сайты фосфорилирования для протеинкиназ различного типа. [77] Действительно, фосфорилирование се-рин-треониновыми киназами семейства WNK влияет на активность ССС [67]. Фосфорилирование NKCC1-2 и NCC киназами семейства WNK приводит к увеличению активности этих переносчиков. В свою очередь, фосфорилирование KCC 1—4 этими киназами приводит к подавлению активности транспортеров [78]. Таким образом, регуляция активности NKCC и KCC является реци-прокной. Парадоксально, но в целом ряде работ установлено, что «классические» серин-треонино-вые киназы — РКА и РКС не оказывают влияния на NKCC и KCC [77].
Изменение клеточного объема влияет на активность ССС. Уменьшение объема клетки («сжатие»), снижение натяжения клеточной мембраны, например, при увеличении осмолярности внешней среды, приводит к активации NKCC, но подавляет KCC. Увеличение проводимости NKCC в таких условиях приводит к поступлению Na+, K+ и Cl- в цитоплазму, увеличению концентрации внутриклеточных осмолитов и восстановлению объема клетки при действии гиперосмотического шока.
Наоборот, увеличение объема клетки, например, в результате уменьшения осмолярности внеклеточной среды, набухание клетки и растяжение мембраны приводит к увеличению проводимости КСС, в результате чего [К+] и [Cl-]i снижается, а действие гипоосмотического шока на клетку ослабляется и происходит восстановление объема клетки [78, 79].
Таким образом, как и каналы VRAC / LRRC8, котранспортеры КСС, NKCC принимают участие в регуляции объема, поддержании ионного и осмотического гомеостаза клеток. Котранспортеры NKCC и KCC, таким образом, являются важным элементом системы регуляции клеточного объема. КСС и NKCC работают реципрокно — действие NКСС обратно эффектам КСС. За счет регуляции объема KCC и NKCC участвуют в регуляции клеточной пролиферации [78]. Следует отметить, что активность ССС зависит от [Cl-]i. Например, повышение [Cl-]i подавляет NKCC, но стимулирует KCC [80].
Фармакология ССС хорошо развита, поскольку эти котранспортеры являются мишенями «петлевых диуретиков» — соединений, применяемых в терапии артериальной гипертензии. Наиболее известным петлевым диуретиком является фуро-
семид, который, наряду с другими мишенями, блокирует работу НКСС2 в проксимальных извитых канальцах, подавляя реабсорбцию натрия и стимулируя выведение воды [81—82].
3.1.1. Котранспортеры К+ и С1- — КСС
Котранспортеры КСС опосредуют электронейтральный №+-независимый перенос ионов К+ и С1- через плазматическую мембрану. КСС обнаружен практически во всех тканях — эпителии, нейронах и других клетках мозга, почках, скелетных мышцах и сердце (рис. 2А Приложение) [83].
Транскрипты всех четырех типов переносчиков КСС обнаруживаются в сердце, однако только КСС1, КСС3 и КСС4 экспрессируются на уровне белка [79, 84]. Транскриптомный анализ одиночных клеток, выделенных из различных отделов сердца человека (левое и правое предсердие, левый и правый желудочек, верхушка желудочка, межжелудочковая перегородка), позволяет заключить [67], что повсеместно экспрессируемым транспортером почти во всех типах клеток сердечной ткани является КСС1, в то время как КСС3 и КСС4 обнаруживаются только в желудочковых кардиомиоци-тах. Таким образом, удаление С1- из кардиомиоци-тов преимущественно реализуется изоформой КСС1, как и в большинстве клеток и тканей организма млекопитающих животных. Тем не менее, профиль экспрессии КСС является видоспецифич-ным. Уровень транскриптов КСС2 в сердце человека крайне низок [85-86]. Однако КСС2 обнаруживается в желудочковых кардиомиоцитах сердца курицы, где, вероятно, способствует снижению [С1-] при стимуляции в-адренорецепторов [87].
3.1.2. Котранспортеры К+, Иа+ и С1~ — ИКСС
Котранспортеры НКСС опосредуют электронейтральный перенос ионов №+, К+ и двух С1- через плазматическую мембрану. Котранспортеры НКСС экспрессируются повсеместно [67].
В норме НКСС1 обнаруживается во всех областях сердца как на уровне мРНК, так и на уровне белка [84, 86]. К настоящему времени подтверждения экспрессии «почечной» изоформы НКСС2 (8ЬС12А1) в сердце отсутствуют [70]. Как и в случае с КСС, перенос С1- в кардиомиоциты осуществляется повсеместно экспрессируемой изоформой ЖСС, то есть ЖСС1 (рис. 2Б Приложение).
Транспортеры КСС и НКСС связаны не только функционально, но и на уровне регуляции экспрессии их генов: у мышей, нокаутных по КСС3, наблюдается снижение экспрессии НКСС1. Реци-прокное ослабление экспрессии НКСС у КСС-нокаутов, видимо, способствует компенсаторному снижению [С1-]^. Однако компенсация, видимо, происходит не полностью, так как у КСС-но-каутов наблюдаются ряд патологических изменений в сердечно-сосудистой системе, включая гипертрофические изменения миокарда [88].
3.2. С1'/ИС03'-обменники
Хлор-бикарбонатные обменники сердца относятся к двум различным семействам: SLC4A и SLC26A. Семейство SLC4A включает в себя №+-зависимые ОуНОДз^обменники (NDCBE и NCBE) и №+-независимые C1-/HCOз--обмен-ники (AE1 (SLC4A1), AE2 (SLC4A2) и AE3 (SLC4A3)). Семейство SLC26A включает в себя пять различных ОуНОДз^обменников (SLC26A3, пендрин, SLC26A6, SLC26A7 и SLC26A9). На данный момент в сердце показана экспрессия электронейтральных обменников AE1-3, а также обменни-ков SLC26A3 и SLC26A6 [68, 89]. Однако сведения о том, какой обменник является в сердце основным, противоречивы. Вероятно, профиль экспрессии вышеперечисленных обменников видоспеци-фичен, различается в определенных отделах сердца и меняется в ходе онтогенеза. Например, экспрессия AE1 в сердце мышей сильно снижается в ходе пренатального онтогенеза [89].
Обменники AE1-3 (SLC4A1-3) являются гомо-димерами, мономер которых состоит из трех доменов: цитоплазматического N-концевого домена, трансмембранного домена и цитоплазматического C-концевого домена (рис. 4А). Наиболее известным и изученным C1-/HCOз--обменником является SLC4A1 (AE1, Band 3) - хлор-бикарбонатный обменник плазматической мембраны эритроцитов. В зрелом миокарде АЕ3 практически не обнаруживается.
Обменник АЕ2 экспрессируется в большинстве тканей. Экспрессия АЕ2 в сердце довольно низкая, а его наличие в кардиомиоцитах на данный момент остается неподтвержденным [68]. АЕ3 считается С1-/НСОз--обменником возбудимых тканей, поскольку он экспрессируется только в сердце, мозге и сетчатке (рис. 2А Приложение) [90]. В нескольких работах показано, что уровень мРНК АЕ3 (SLC4A3) в сердце достаточно высок [91]. Таким образом, АЕ3 является основным электронейтральным хлор-бикарбонатным обмен-ником в сердце и локализуется в основном в плазматической мембране, формирующей Т-трубочки. Интересно, что в кардиомиоцитах, помимо присутствия АЕ3 в плазматической мембране, показано наличие данного обменника в мембране цистерн саркоплазматического ретикулума [92].
Хлор-бикарбонатные обменники SLC26A также являются димерами, каждый мономер которого включает 10-14 трансмембранных сегментов [93] (рис. 4Б). По разным литературным данным, обменники SLC26A кардиомиоцитов (рис. 2Г Приложение) могут быть либо электрогенными (со стехиометрией 2НС03-:1С1-), либо электронейтральными [94]. Так же как и АЕ3, SLC26A [89] обнаруживается в мембране Т-трубочек и саркоплазматическом ретикулуме кардиомиоцитов [92]. За счет способности перемещать анионы либо в клетку, либо из клетки основной функцией С1-/НС03--обменников является регуляция цитоплазматического рН [95].
Рис. 4. Структура хлор-бикарбонатных трансмембранных обменников (антипортеров). На верхних панелях показан вид обменников с внеклеточной стороны в плоскости плазматической мембраны. Зеленым цветом в структуре белка показаны а-спирали, желтым цветом — в-складки, фиолетовым цветом — 310-спираль. А. Структура натрий-независимого хлор-бикарбонатного обменника АЕ1 ^ЬС4А1) и его расположение в плазматической мембране. Б. Структура хлор-бикарбонатного обменника SLC26A6 и его расположение в плазматической мембране. Молекулярные структуры сконструированы с помощью https://www.rcsb.org/
4. Заключение
Хлорные каналы семейств С1С, ТМЕМ16, СК^, LRRC8 являются молекулярным субстратом хлорных ионных токов, обнаруженных в сердце. Вследствие множественности и сложности регуляции хлорная проводимость оказывает комплексное влияние на электрическую активность сердца, зачастую разнонаправленное для разных его отделов. Тем не менее, хлорные каналы и хлорные переносчики принципиально важны для нормального функционирования пейсмекера, проводящей системы и сократительного миокарда сердца. Несмотря на целый спектр установленных эффектов, в значительной степени роль баланса хлора и хлорной проводимости в электрофизиологии сердца
остается неисследованной. В частности, необходимо прояснение вопроса об уровне цитоплазматиче-ского С1- в кардиомиоцитах проводящей системы сердца. Критически важным является идентификация профиля экспрессии хлорных ионных каналов при сердечных патологиях различного типа, поскольку это позволит установить новые аспекты электрического ремоделирования миокарда и определить новые мишени для фармакологической терапии нарушений ритма сердца.
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект №22-15-00189). Работа проведена без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
CTHCOK ^HTEPATyPH
1. Duran C., Thompson C.H., Xiao Q., Hartzell H.C. Chloride channels: often enigmatic, rarely predictable. Annu. Rev. Physiol. 2009;72:95-121.
2. Miller A.N., Vaisey G., Long S.B. Molecular mechanisms of gating in the calcium-activated chloride channel bestrophin. Elife. 2019;8: e43231.
3. Li B., Hoel C.M., Brohawn S.G. Structures of tweety homolog proteins TTYH2 and TTYH3 reveal a Ca2+-dependent switch from intra- to intermembrane dimerization. Nat. Commun. 2021;12(1):6913.
4. Okada Y., Sabirov R.Z., Merzlyak P.G., Numata T., Sato-Numata K. Properties, structures, and physiological roles of three types of anion channels molecularly identified in the 2010's. Front. Physiol. 2021;12: 805148.
5. Locher K.P. Mechanistic diversity in ATP-binding cassette (ABC) transporters. Nat. Struct. Mol. Biol. 2016;23(6):487-493.
6. CsaMdy L., Vergani P., Gadsby D.C. Structure, gating, and regulation of the CFTR anion channel. Physiol. Rev. 2019;99(1):707-738.
7. Tabcharani J.A., Rommens J.M., Hou Y.X., Chang X.B., Tsui L.C., Riordan J.R., Hanrahan J.W. Multi-ion pore behaviour in the CFTR chloride channel. Nature. 1993;366(6450):79-82.
8. Berger H.A., Anderson M.P., Gregory R.J., Thompson S., Howard P.W., Maurer R.A., Mulligan R., Smith A.E., Welsh M.J. Identification and regulation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-generated chloride channel. J. Clin. Invest. 1991;88(4):1422-1431.
9. Anderson M.P., Berger H.A., Rich D.P., Gregory R.J., Smith A.E., Welsh M.J. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 1991;67(4):775-784.
10. Jia Y., Mathews C.J., Hanrahan J.W. Phosphoryla-tion by protein kinase C is required for acute activation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by protein kinase A. J. Biol. Chem. 1997;272(8):4978-4984.
11. Hallows K.R., Raghuram V., Kemp B.E., Witters L.A., Foskett J.K. Inhibition of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by novel interaction with the metabolic sensor AMP-activated protein kinase. J. Clin. Invest. 2000;105(12):1711-1721.
12. Billet A., Jia Y., Jensen T., Riordan J.R., Hanra-han J.W. Regulation of the cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator anion channel by tyrosine phosphorylation. FASEB J. 2015;29(9):3945-3956.
13. Luo J., Pato M.D., Riordan J.R., Hanrahan J.W. Differential regulation of single CFTR channels by PP2C, PP2A, and other phosphatases. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1998;274(5):C1397—C1410.
14. Uramoto H., Takahashi N., Dutta A.K., Sabirov R.Z., Ando-Akatsuka Y., Morishima S., Okada Y. Ischemia-induced enhancement of CFTR expression on the plasma membrane in neonatal rat ventricular myocytes. Jpn. J. Physiol. 2003;53(5):357-365.
15. Jentsch T.J., Pusch M. CLC chloride channels and transporters: Structure, function, physiology, and disease. Physiol. Rev. 2018;98(3):1493-1590.
16. Okamoto Y., Nagasawa Y., Obara Y., Ishii K., Taka-gi D., Ono K. Molecular identification of HSPA8 as an accessory protein of a hyperpolarization-activated chloride channel from rat pulmonary vein cardiomyocytes. J. Biol. Chem. 2019;294(44):16049-16061.
17. De Jesús-Pérez J.J., Castro-Chong A., Shieh R.C., Hernández-Carballo C.Y. Gating the glutamate gate of CLC-2 chloride channel by pore occupancy. J. Gen. Physiol. 2016;147:576-613.
18. Weinreich F., Jentsch T.J. Pores formed by single subunits in mixed dimers of different CLC chloride channels. J. Biol. Chem. 2001;276(4):2347-2353.
19. Arreola J., Begenisich T., Melvin J.E. Conformation-dependent regulation of inward rectifier chloride channel gating by extracellular protons. J. Physiol. 2002;541(1):103-112.
20. Palmada M., Dieter M., Boehmer C., Waldegger S., Lang F. Serum and glucocorticoid inducible kinases functionally regulate ClC-2 channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004;321(4):1001-1006.
21. Park K., Begenisich T., Melvin J.E. Protein kinase A activation phosphorylates the rat ClC-2 Cl- channel but does not change activity. J. Membr. Biol. 2001;182(1):31-37.
22. Caputo A., Caci E., Ferrera L., Pedemonte N., Barsanti C., Sondo E., Pfeffer U., Ravazzolo R., Zegarra-Moran O., Galietta L.J.V. TMEM16A, a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity. Science. 2008;322(5901):590-594.
23. Yannoukakos D., Stuart-Tilley A., Fernandez H.A., Fey P., Duyk G., Alper S.L. Molecular cloning, expression,
and chromosomal localization of two isoforms of the AE3 anion exchanger from human heart. Circ. Res. 1994;75(4):603—614.
24. Dang S., Feng S., Tien J., et al. Cryo-EM structures of the TMEM16A calciumactivated chloride channel. Nature. 2017;552(7685):426-429.
25. Paulino C., Kalienkova V., Lam A.K.M., Neldner Y., Dutzler R. Activation mechanism of the calcium-activated chloride channel TMEM16A revealed by cryo-EM. Nature. 2017;552(7685):421-425.
26. Paulino C., Neldner Y., Lam A.K.M., Kalienkova V., Brunner J.D., Schenck S., Dutzler R. Structural basis for anion conduction in the calcium-activated chloride channel TMEM16A. eLife. 2017;6:e26232.
27. Hartzell H.C., Yu K., Xiao Q., Chien L.T., Qu Z. Anoctamin / TMEM16 family members are Ca2+-activated Cl- channels. J. Physiol. 2009;587(Pt. 10):2127-2139.
28. Horväth B., Väczi K., Hegyi B., Gönczi M., Dienes B., Kistamäs K., Bänyäsz T., Magyar J. Sarcolemmal Ca2+-entry through L-type Ca2+ channels controls the profile of Ca2+-activated Cl- current in canine ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 2016;97:125-139.
29. Sipido K.R., Callewaert G., Carmeliet E. [Ca2+], transients and [Ca2+]i-dependent chloride current in single Purkinje cells from rabbit heart. J. Physiol. 1993;468:641-667.
30. Li G.R., Sun H., To J., Tse H.F., Lau C.P. Demonstration of calcium-activated transient outward chloride current and delayed rectifier potassium currents in Swine atrial myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 2004;36(4):495-504.
31. El Chemaly A., Norez C., Magaud C., Bescond J., Chatelier A., Fares N., Findlay I., Jayle C., Becq F., Faivre J.F., Bois P. ANO1 contributes to Angiotensin-II-activated Ca2+-dependent Cl- current in human atrial fibroblasts. J. Mol. Cell Cardiol. 2014;68:12-19.
32. Berg J., Yang H., Jan L.Y. Ca2+-activated Cl-channels at a glance. J. Cell Sci. 2012;125(Pt. 6):1367-1371.
33. Pedemonte N., Galietta L.J.V. Structure and function of tmem16 proteins (anoctamins). Physiol. Rev. 2014;94(2):419-459.
34. Kuruma A., Hartzell H.C. Bimodal control of a Ca2+-activated Cl- channel by different Ca2+ signals. J. Gen. Physiol. 2000;115(1):59-80.
35. Yang Y.D., Cho H., Koo J.Y., Tak M.H., Cho Y., Shim W.S., Park S.P., Lee J., Lee B., Kim B.M., Raouf R., Shin Y.K., Oh U. TMEM16A confers receptor-activated calcium-dependent chloride conductance. Nature. 2008;455(7217):1210-1215.
36. Brunner J.D., Lim N.K., Schenck S., Duerst A., Dutzler R. X-ray structure of a calcium-activated TMEM16 lipid scramblase. Nature. 2014;516(7530):207-212.
37. Schulte G. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXX. The class Frizzled receptors. Pharmacol Rev. 2010;62(4):632-667.
38. Ma K., Wang H., Yu J., Wei M., Xiao Q. New Insights on the regulation of Ca2+-activated chloride channel TMEM16A. J. Cell Physiol. 2017;232(4):707-716.
39. Chun H., Cho H., Choi J., Lee J., Kim S.M., Kim H., Oh U. Protons inhibit anoctamin 1 by competing with calcium. Cell Calcium. 2015;58(5):431-441.
40. Ferrera L., Caputo A., Galietta L.J.V. TMEM16A protein: A new identity for Ca2+-dependent Cl- channels. Physol. 2010;25(6):357-363.
41. Pifferi S., Dibattista M., Menini A. TMEM16B induces chloride currents activated by calcium in mammalian cells. Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 2009;458(6):1023-1038.
42. Jung J., Nam J.H., Park H.W., Oh U., Yoon J.H., Lee M.G. Dynamic modulation of ANO1 / TMEM16A HCO3- permeability by Ca2+/calmodulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013;110(1):360-365.
43. Vocke K., Dauner K., Hahn A., Ulbrich A., Broecker J., Keller S., Frings S., Möhrlen F. Calmodulin-dependent activation and inactivation of anoctamin calcium-gated chloride channels. J. Gen. Physiol. 2013;142(4):381-404.
44. Cipriani G., Serboiu C.S., Gherghiceanu M., Simonetta Faussone-Pellegrini M., Vannucchi M.G. NK receptors, Substance P, Ano1 expression and ultrastructural features of the muscle coat in Cav-1-/- mouse ileum. J. Cell Mol. Med. 2011;15(11):2411-2420.
45. Pritchard H., Leblanc N., Albert A.P., Greenwood I.A. Inhibitory role of phosphatidylinositol 4,5-bis-phosphate on TMEM16A-encoded calcium-activated chloride channels in rat pulmonary artery. Br. J. Pharmacol. 2014;171(18):4311-4321.
46. Bulley S., Neeb Z.P., Burris S.K., Bannister J.P., Thomas-Gatewood C.M., Jangsangthong W., Jaggar J.H. TMEM16A / ANO1 channels contribute to the myogenic response in cerebral arteries. Circ. Res. 2012;111(8):1027—1036.
47. Balderas E., Ateaga-Tlecuitl R., Rivera M., Gomo-ra J.C., Darszon A. Niflumic acid blocks native and recombinant T-type channels. J. Cell Physiol. 2012;227(6):2542-2555.
48. De La Fuente R., Namkung W., Mills A., Verk-man A.S. Small-molecule screen identifies inhibitors of a human intestinal calcium-activated chloride channel. Mol. Pharmacol. 2008;73(3):758-768.
49. Huang F., Zhang H., Wu M., et al. Calcium-activated chloride channel TMEM16A modulates mucin secretion and airway smooth muscle contraction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012;109 (40):16354-16359.
50. Oh S.J., Hwang S.J., Jung J., Yu K., Kim J., Choi J.Y., Hartzell H.C., Roh E.J., Lee C.J. MONNA, a potent and selective blocker for transmembrane protein with unknown function 16/anoctamin-1. Mol. Pharmacol. 2013;84(5):726-735.
51. Ghouli M.R., Fiacco T.A., Binder D.K. Structure-function relationships of the LRRC8 subunits and subdomains of the volume-regulated anion channel (VRAC). Front. CellNeurosci. 2022;16:962714.
52. Lutter D., Ullrich F., Lueck J.C., Kempa S., Jentsch T.J. Selective transport of neurotransmitters and modulators by distinct volume-regulated LRRC8 anion channels. J. Cell Sci. 2017;130(6):1122-1133.
53. Jentsch T.J. VRACs and other ion channels and transporters in the regulation of cell volume and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2016;17(5):293-307.
54. Deneka D., Sawicka M., Lam A.K.M, Paulino C., Dutzler R. Structure of a volume-regulated anion channel of the LRRC8 family. Nature. 2018;558(7709):254-259.
55. Kasuya G., Nakane T., Yokoyama T., Jia Y, Inoue M., Watanabe K., Nakamura R., Nishizawa T., Kusakizako T., Tsutsumi A., Yanagisawa H., Dohmae N., Hattori M., Ichijo H., Yan Z., Kikkawa M., Shirouzu M., Ishitani R., Nureki O. Cryo-EM structures of the human volume-regulated anion channel LRRC8. Nat. Struct. Mol. Biol. 2018;25(9):797-804.
56. Qiu Z., Dubin A.E., Mathur J., Tu B., Reddy K., Miraglia L.J., Reinhardt J., Orth A.P., Patapoutian A. SWELL1, a plasma membrane protein, is an essential component of volume-regulated anion channel. Cell. 2014;157(2):447-458.
57. Voss F.K., Ullrich F., Munch J., Lazarow K., Lutte D., Mah N., Andrade-Navarro M.A., von Kries J.P., Stauber T., Jentsch T.J. Identification of LRRC8 heteromers as an essential component of the volume-regulated anion channel VRAC. Science. 2014;344 (6184):634-638.
58. Okada T., Islam M.R., Tsiferova N.A., Okada Y., Sa-birov R.Z. Specific and essential but not sufficient roles of LRRC8A in the activity of volume-sensitive outwardly rectifying anion channel (VSOR). Channels. 2017;11(2):109-120.
59. Pervaiz S., Kopp A., von Kleist L., Stauber T. Absolute protein amounts and relative abundance of volume-regulated anion channel (VRAC) LRRC8 subunits in cells and tissues revealed by quantitative immunoblotting. Int. J. Mol. Sci. 2019;20(23):5879
60. Egorov Y.V., Lang D., Tyan L., Turner D., Lim E., Piro Z.D., Hernandez J.J., Lodin R., Wang R., Schmuck E.G., Raval A.N., Ralphe C.J., Kamp T.J., Rosenshtraukh L.V., Glukhov A.V Caveolae-mediated activation of mechanosensi-tive chloride channels in pulmonary veins triggers atrial ar-rhythmogenesis. J. Am. Heart Assoc. 2019;8(20):e012748.
61. Centeio R., Ousingsawat J., Schreiber R., Kunzelmann K. Ca2+ dependence of volume-regulated VRAC/LRRC8 and TMEM16A Cl- channels. Front. Cell Dev. Biol. 2020;8:596879.
62. Liu Y., Zhang H., Men H., Du Y., Xiao Z., Zhang F., Huang D., Du X., Gamper N., Zhang H. Volume-regulated Cl- current: Contributions of distinct Cl-channels and localized Ca2+ signals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2019;317(3):C466-C480.
63. Nilius B., Eggermont J., Voets T., Buyse G., Manolopoulos V., Droogmans G. Properties of volume-regulated anion channels in mammalian cells. Prog. Biophys. Mol. Biol. 1997;68(1):69-119.
64. Rudkouskaya A., Chernoguz A., Haskew-Lay-ton R.E., Mongin A.A. Two conventional protein kinase C isoforms, a and ßI, are involved in the ATP-induced activation of volume-regulated anion channel and glutamate release in cultured astrocytes. J. Neurochem. 2008;105(6):2260-2270.
65. Fisher S.K., Cheema T.A., Foster D.J., Hea-cock A.M. Volume-dependent osmolyte efflux from neural tissues: Regulation by G-protein-coupled receptors. J. Neurochem. 2008;106(5):1998-2014.
66. Nilius B., Voets T., Prenen J., Barth H., Aktories K., Kaibuchi K., Droogmans G., Eggermont J. Role of Rho and Rho kinase in the activation of volume-regulated anion channels in bovine endothelial cells. J. Physiol. 1999;516(Pt. 1):67-74.
67. Modi A.D., Khan A.N., Cheng W.Y.E., Modi D.M. KCCs, NKCCs, and NCC: Potential targets for cardiovascular therapeutics? A comprehensive review of cell and region specific expression and function. Acta Histochem. 2023;125(4):152045.
68. Wang H.S. Critical role of bicarbonate and bicarbonate transporters in cardiac function. World J. Biol. Chem. 2014;5(3):334.
69. Meor Azlan N.F., Zhang J. Role of the cation-chloride-cotransporters in cardiovascular disease. Cells. 2020;9(10):2293.
70. Hartmann A.M., Nothwang H.G. Molecular and evolutionary insights into the structural organization of cation chloride cotransporters. Front. CellNeurosci. 2015;8:470.
71. Nan J., Yuan Y., Yang X., Shan Z., Liu H., Wei F., Zhang W., Zhang Y. Cryo-EM structure of the human sodium-chloride cotransporter NCC. Sci. Adv. 2022;8(45):eadd7176.
73. Lang F., Voelkl J. Therapeutic potential of serum and glucocorticoid inducible kinase inhibition. Expert Opin. Investig. Drugs. 2013;22(6):701-714.
74. Orlov S.N., Tremblay J., Hamet P. Cell volume in vascular smooth muscle is regulated by bumetanide-sensi-tive ion transport. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1996;270(5 Pt. 1):C1388- C1397.
75. Smith J.B., Smith L. Na+/K+/Cl" cotransport in cultured vascular smooth muscle cells: Stimulation by angiotensin II and calcium ionophores, inhibition by cyclic AMP and calmodulin antagonists. J. Membr. Biol. 1987;99(1):51-63.
76. Adragna N.C., White R.E., Orlov S.N., Lauf P.K. K-Cl cotransport in vascular smooth muscle and erythrocytes: Possible implication in vasodilation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000;278(2):C381-C390.
77. Kahle K.T., Rinehart J., Ring A., Gimenez I., Gamba G., Hebert S.C., Lifton R.P. WNK protein kinases modulate cellular Cl- flux by altering the phosphorylation state of the Na-K-Cl and K-Cl cotransporters. Physiology (Bethesda). 2006;21:326-335.
78. Orlov S.N., Koltsova S.V., Kapilevich L.V., Dulin N.O., Gusakova S.V. Cation-chloride cotransporters: Regulation, physiological significance, and role in pathogenesis of arterial hypertension. Biochemistry (Mosc.). 2014;79(13):1546-1561.
79. Mount D.B., Mercado A., Song L., Xu J., George A.L., Jr., Delpire E., Gamba G. Cloning and characterization of KCC3 and KCC4, new members of the cation-chloride cotransporter gene family. J. Biol. Chem. 1999;274(23):16355-16362.
80. Lytle C., McManus T. Coordinate modulation of Na-K-2Cl cotransport and K-Cl cotransport by cell volume and chloride. Am. J. Physiol Cell Physiol. 2002;283(5):C1422-C1431.
81. Delpire E. Advances in the development of novel compounds targeting cation-chloride cotransporter physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2021;320(3):C324-C340.
82. Gagnon M., Bergeron M.J., Lavertu G., et al. Chloride extrusion enhancers as novel therapeutics for neurological diseases. Nat. Med. 2013;19(11):1524-1528.
83. Garneau A.P., Marcoux A.A., Slimani S., Tremblay L.E., Frenette-Cotton R., Mac-Way F., Isenring P. Physiological roles and molecular mechanisms of K+ - Cl- cotransport in the mammalian kidney and cardiovascular system: where are we? J. Physiol. 2019;597(6):1451-1465.
84. Uhlen M., Uhlön M., Fagerberg L., et al. Proteo-mics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 2015;347(6220):1260419.
85. Karlsson M., Zhang C., Möar L., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci. Adv. 2021;7(31):eabh2169.
86. Litvinukovä M., Talavera-Löpez C., Maatz H., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 2020;588(7838):466-472.
87. Ludwig A., Rivera C., Uvarov P. A noninvasive optical approach for assessing chloride extrusion activity of the K-Cl cotransporter KCC2 in neuronal cells. BMC Neurosci. 2017;18(1):23.
88. Garneau A.P., Marcoux A.A., Noel M., Frenette-Cotton R., Drolet M.C., Couet J., Larivifere R., Isenring P. Ablation of potassium-chloride cotransporter type 3 (Kcc3) in mouse causes multiple cardiovascular defects and isosmotic polyuria. PLoS One. 2016;11(5):e0154398.
89. Alvarez B.V., Kieller D.M., Quon A.L., Marko-vich D., Casey J.R. Slc26a6: A cardiac chloride-hydroxyl exchanger and predominant chloride-bicarbonate exchanger of the mouse heart. J. Physiol. 2004;561(Pt. 3):721-734.
90. Bonar P.T., Casey J.R. Plasma membrane Cl-/ HCO3- exchangers: Structure, mechanism and physiology. Channels. 2008;2(5):337-345.
91. Kudrycki K.E., Newman P.R., Shull G.E. cDNA cloning and tissue distribution of mRNAs for two proteins that are related to the band 3 Cl"/HCO3" exchanger. J. Biol. Chem. 1990;265(1):462-471.
92. Alvarez B.V., Kieller D.M., Quon A.L., Robertson M., Casey J.R. Cardiac hypertrophy in anion exchanger 1-null mutant mice with severe hemolytic anemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2007;292(3):H1301-H1312.
93. Lohi H., Lamprecht G., Markovich D., Heil A., Ku-jala M, Seidler U., Kere J. Isoforms of SLC26A6 mediate ani-
on transport and have functional PDZ interaction domains. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2003;284(3): C769- C779.
94. Chernova M.N., Jiang L., Friedman D.J., Dar-man R.B., Lohi H., Kere J., Vandorpe D.H., Alper S.L. Functional comparison of mouse slc26a6 anion exchanger with human SLC26A6 polypeptide variants: Differences in anion selectivity, regulation, and electrogenicity. J. Biol. Chem. 2005;280(9):8564-8580.
95. Cingolani H.E., Chiappe G.E., Ennis I.L., Morgan P.G., Alvarez B.V., Casey J.R., Dulce R.A., Pérez N.G., Camilión de Hurtado M.C. Influence of Na+-Independent Cl--HCO3- exchange on the slow force response to myocardial stretch. Circ. Res. 2003;93(11):1082-1088.
Поступила в редакцию 10.07.2024 После доработки 31.07.2024 Принята в печать 02.08.2024
REVIEW
Structural basis and molecular mechanisms of Cl- transmembrane transport in cardiomyocytes
Y.A. Voronina1' 2> *©, A.M. Karhov1,2<E>, V.S. Kuzmin1 2©
1Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Leninskie gory 1—12, Moscow, 119234, Russia; 2Academician Smirnov Institute of Experimental Cardiology, Academician ChazovNational Medical Research Centre of Cardiology,
st. Academician Chazova, 15a, Moscow, 121552, Russia *e-mail: [email protected]
The intracellular concentration of chlorine anions ([Cl-];), the equilibrium potential for chlorine anions (ECl) and transmembrane chloride currents (ICl) are the factors that significantly influence the electrophysiological properties of excitable tissue, including the myocardium. Several types of chloride (anion) conductance have been identified in the heart. In recent years, a number of transmembrane proteins demonstrating chloride conductance have been identified (CFTR, ClC, TMEM16, LRRC8), and the expression of these macromolecules in cardiac tissue has been confirmed. Accumulated data allow for establishing a molecular substrate for some chloride anion currents (IC1PKA, ICl,ir, ICl,vol, ICl,swell, ICl,Ca, Ito2) detected in the heart. Furthermore, the molecular mechanisms regulating [Cl-] and EC1 through chloride cotransporters (KCC, NKCC1) and chloride-bicarbonate exchangers have been established. The variety of structures determining chloride transmembrane conductivity and the complexity of molecular mechanisms regulating chloride homeostasis underlie the complex effects of activation of chloride transporters in the pacemaker, conduction system and working myocardium of the heart. This review discusses the structural, biophysical properties and molecular regulation of chloride transporter protein complexes identified in the myocardium. The review also covers the mechanisms by which chloride transmembrane transport influences the bioelectrical activity of cardiomyocytes.
Keywords: chloride channels, cation-chloride cotransporters, chloride-bicarbonate exchanger, chloride transport, chloride current, cardiac electrophysiology
Funding: The research was funded by Russian Science Foundation, project number 22-15-00189.
Cведения об авторах
Воронина Яна Алексеевна — ассистент кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-14-16; e-mail: [email protected]. msu.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6624-7805
Кархов Андрей Михайлович — студент магистратуры кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-14-16; e-mail: akarchoff@gmail. com; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0919-0712
Кузьмин Владислав Стефанович — докт. биол. наук, проф. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-14-16; e-mail: ku290381@ mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3075-4834
