CC BY
0УДК 637.072
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ФАЛЬСИФИКАЦИИ СЫРЬЯ И ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ДЕТЕКЦИИ НЕСАНКЦИОНИРОВАННЫХ ПРИМЕСЕЙ
В КОРМАХ
КРИВЕЦКАЯ АЛЕНА МИХАЙЛОВНА
Младший научный сотрудник Национального координационного центра биобезопасности Института генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск,
Республика Беларусь
МОЗГОВА ГАЛИНА ВАЛЕРЬЕВНА
Руководитель Национального координационного центра биобезопасности Института генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Республика Беларусь
ДРОБОТ НАДЕЖДА ИГОРЕВНА
Научный сотрудник Национального координационного центра биобезопасности Института генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Республика Беларусь
ОСТАПЧИК ВИКТОРИЯ СЕРГЕЕВНА
Младший научный сотрудник Национального координационного центра биобезопасности Института генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск,
Республика Беларусь
ОСТРОВСКАЯ АНАСТАСИЯ НИКОЛАЕВНА
Научный сотрудник Национального координационного центра биобезопасности Института генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Республика Беларусь
Аннотация: Идентификация видовой принадлежности биологического материала -гарант качества и безопасности импортируемого сырья, продуктов питания и кормов, инструмент борьбы с экономическим мошенничеством. Продукция, содержащая мясные ингредиенты, подвергается всем видам фальсификации, что объясняется высокими ценами на них и ограниченностью ресурсов. Важность испытаний определяется тем, что такая продукция, как правило, состоит из ряда ингредиентов, что делает возможным их непреднамеренное или умышленное загрязнение неразрешенными составляющими. В статье приводится обзор методов, используемых для выявления фальсифицирующих примесей в продуктах питания, сырье и кормах, содержащих мясные ингредиенты. Дается подробное описание метода ПЦР-РВ для определения фальсифицирующих ДНК отдельных видов животных в мясной продукции и результаты испытаний образцов на наличие фальсифицирующих примесей, проведенных в Национальном координационном центре биобезопасности. Приводятся доводы о необходимости введения порогового уровня детекции ДНК видов животных с целью принятия решений по продукции, содержащей следовые количества ДНК незаявленных видов, как технически неустранимой примеси.
Ключевые слова: фальсификация сырья и пищевой продукции, установление несанкционированных примесей в кормах, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, ПЦР-РВ, экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)
Мясо является одним из наиболее распространенных и ценных продуктов питания человека, так как содержит почти все необходимые вещества для роста и развития организма. Мясная промышленность всегда относилась к одной из важнейших отраслей производства, показатели ее развития составляют предмет пристального интереса со стороны государства.
В настоящее время потребление мяса в мире на душу населения в целом составляет порядка пятидесяти двух килограмм, при этом в развитых странах Запада - свыше девяносто пяти килограмм, а в развивающихся - более сорока килограмм [1].
Установление видовой принадлежности мясных продуктов является одним из важнейших этапов в стандартном анализе по контролю качества продуктов питания и сырья для их производства. Анализ позволяет определить источник животного белка и выявить фальсификаты продуктов питания и кормов, и оградить потребителей от некачественной, а порой и опасной продукции.
Идентификация видовой принадлежности биологического материала - гарант качества и безопасности импортируемого сырья и продуктов питания, инструмент борьбы с экономическим мошенничеством. Важность испытаний определяется тем, что такая продукция, как правило, состоит из ряда ингредиентов, что делает возможным ее непреднамеренное или умышленное загрязнение неразрешенными составляющими. Товары этой группы подвергаются всем видам фальсификации. Появляются не разрешенные фальсификаты малоценного мясного сырья, когда дорогостоящие виды мяса заменяются более дешевыми (например, баранина - свининой, говядина - кониной, индейка - курицей) [2]. Из-за этого не только изменяются потребительские свойства готовых изделий, но и возникает опасность для здоровья потребителей, например, в результате аллергической реакции на определенный вид мяса. Определение наличия следов свинины в мясе также очень важно для религиозно ориентированных производств так называемых «халяльных» и «кошерных» продуктов. Кроме того, все больше пищевых продуктов ориентировано на так называемое «органическое» происхождение, например, мясо крупного рогатого скота, выращенного в естественных условиях на местной кормовой базе, без применения искусственных и нетипичных для региона кормовых добавок.
Наибольшее беспокойство у ветеринарных врачей вызывают возможные подмены мясом животных, пораженных прионами или вирусами, создающими большой риск в эпизоотическом и эпидемическом отношениях (губкообразные энцефалопатии, африканская чума свиней, ящур и др.), а также сырьем, импорт которого по каким-либо причинам запрещен [3]. Установление видовой принадлежности ингредиентов, входящих в состав пищевых продуктов, в криминалистике обычно связано с возможностью несанкционированного использования мяса диких животных.
Для борьбы с недобросовестными производителями создан ряд национальных, региональных организаций и международных сетей и платформ, в том числе Агентство Европейского союза по сотрудничеству в обеспечении законности (ЕВРОПОЛ). При проведении экспертизы подлинности мяса должны достигаться следующие цели исследования: идентификация вида мяса, способы фальсификации и методы их выявления.
Существуют следующие методы определения видовой принадлежности мяса и мясной продукции:
Определение температуры плавления жира. Видовую принадлежность мяса различных животных можно определить по температуре плавления жира. Наиболее низкую температуру плавления имеют жир собаки, лошади, затем свиней и высокую - говяжий и бараний жир. Это дает возможность отличить бараний жир от жира собаки, говяжий - от конского.
Качественная реакция на гликоген. Гликоген - животный крахмал, главный резервный полисахарид, образующийся в мышцах и печени млекопитающих из глюкозы. Так, в говядине гликогена содержится 0,2-0,3 % (примерно такое же количество в баранине и свинине), мясе кошки - 0,5 %, конине - около 1 %, а в мясе собаки - около 2 %. Положительная реакция -фильтрат окрашивается в вишнево-красный цвет, который при нагревании до 80 0С обесцвечивается, а при охлаждении вновь восстанавливается, что соответствует мясу лошади, медведя, собаки, кошки. Отрицательная реакция - фильтрат окрашивается в желтый цвет, что характерно для мяса КРС, овцы, козы, свиньи, кролика.
Реакция преципитации - наиболее достоверный метод установления видовой принадлежности мяса. Сущность этой реакции состоит в том, что при взаимодействии раствора белка (Антиген) с соответствующей преципитирующей сывороткой (Антитело) образуются осадки - преципитины. Данным способом можно определить видовую принадлежность мяса, даже если оно было подвергнуто посолу или тепловой обработке.
Задача выявления фальсификации пищевой продукции, связанной с умышленным (или неумышленным) изменением информации о качестве продукции является наиболее сложной по сравнению с общей оценкой пищевой безопасности, но не менее актуальной.
Методы органолептического, физико-химического и микробиологического контроля дают возможность определить свежесть и безопасность в инфекционном отношении мясного сырья и готовых мясных изделий. Но с их помощью нельзя установить видовой состав мяса в продуктах, особенно если количество измененной мышечной ткани незначительно по отношению к основному сырью [4]. Поэтому наиболее перспективны для определения видовой принадлежности ДНК животных с целью установления фальсификации сырья, пищевой продукции и несанкционированных примесей в кормах - методы ДНК-диагностики.
Общепринятая методика для видовой идентификации мясных ингредиентов животных и птицы в продуктах питания и сырье - недорогая, точная, качественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Она позволяет с высокой точностью выявить наличие искомого видоспецифичного фрагмента ДНК, присутствующего в образце в очень малом количестве [4]. Для регулирования требований к сырью и продукции в Республике Беларусь принят ГОСТ 31719-2012 «Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)», который распространяется на качественное определение видовой принадлежности мясных и растительных ингредиентов, содержащихся в кормах, пищевых продуктах, продовольственном сырье растительного, животного происхождения, в том числе подвергавшихся термической обработке. Данный стандарт применяется в аккредитованных лабораториях, занимающихся видовой идентификацией сырьевого состава методом ПЦР-РВ, в том числе и в Национальном координационном центре биобезопасности (НКЦБ) Института генетики и цитологии НАН Беларуси.
Метод качественной ПЦР-РВ обладает высокой точностью: у белорусских производителей тест-систем лимит определения на отдельные виды мясных ингредиентов составляет от трех геном-эквивалентов ДНК-мишени в реакции ПЦР для детекции крупного и мелкого рогатого скота до пятидесяти - для свиньи, курицы и индейки [5].
Преимущества ПЦР в режиме реального времени:
- высокая достоверность анализа;
- короткий срок осуществления ПЦР;
- высокая специфичность;
- высокая чувствительность;
- объединение этапов амплификации и детекции результатов анализа, возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время ее проведения;
- высокая производительность;
- возможность количественной оценки исходной ДНК матрицы. Преимущества метода ПЦР-РВ обусловлены тем обстоятельством, что количественное определение происходит не на конечной стадии ПЦР (плато), а на стадии, где экспоненциальный рост количества амплифицированной ДНК ^п величина) достигает точки, значительно более высокой, чем для фонового сигнала. Этот способ измерения существенно повышает точность количественного определения, так как существует прямая корреляция между начальным количеством матрицы и стадией, на которой амплификация начинает становиться экспоненциальной.
- возможность мультиплексирования ПЦР с целью определения ДНК нескольких видов животных в одном анализе для исследования фальсификатов в многокомпонентной продукции;
- регистрация и учет данных в электронном формате.
Во многих современных приборах для ПЦР-РВ предусмотрены варианты детекции нескольких флуоресцентных красителей одновременно. Для этого детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном для него диапазоне (канале). Даипазон этот выбирается таким образом, чтобы детектировать сигнал только одного красителя, и не затрагивать область соседних.
Если настроить прибор на детекцию сигнала в максимуме флуоресценции каждого красителя, то остальные красители в этом максимуме будут иметь очень низкую флуоресценцию и ей можно пренебречь. Таким образом, исследователь может использовать четыре независимых канала и повысить производительность мультиплексной ПЦР-РВ. Каналы обычно называют по названию красителя, максимум которого они детектируют. На сегодняшний день широко известны пять каналов:
- канал FAM/SybrGreen;
- канал JOE/HEX;
- канал TAMRA/Cy3;
- канал ROX/SuperROX;
- канал Cy5.
Самые распространенные варианты мультиплексной ПЦР-РВ: детекция по двум каналам - FAM и HEX, трем каналам - FAM, HEX и Cy5, и четырем каналам - FAM, HEX, ROX и Cy5.
Совсем не обязательно чтобы название канала совпадало с названием красителя, главное, чтобы используемый краситель спектрально соответствовал характеристикам канала. Так, например, для канала JOE можно использовать зонды с красителем HEX или VIC. Подобрать подходящий краситель для использования в ПЦР-РВ довольно трудно, поскольку нужно, чтобы он обладал хорошими спектральными свойствами, то есть флуоресцировал в нужном диапазоне своего канала, и при этом не флуоресцировал в соседних каналах. Так же важным аспектом является его химическая стабильность и фотостабильность и возможность применения в синтезе олигонуклеотидов.
Для выявления фрагментов видоспецифичной ДНК животных и растений часто используют тест-системы для качественной ПЦР-РВ, содержащие праймеры, специфичные к ДНК определенного вида животных, например для определения ДНК видов Sus scrofa, Bovinae, Ovis aries, Equus caballus, Gallus gallus, Meleagris gallopavo, Glycine max и др., производимых компаниями Российской Федерации и Беларуси.
В 2023 г. методом качественной ПЦР-РВ с использованием наборов для мультиплексной ПЦР-РВ в НКЦБ было проанализировано 302 образца продуктов питания и кормов с целью выявления фальсифицирующих либо несанкционированных примесей ДНК отдельных видов животных. Количество образцов, в которых обнаружено наличие таких примесей - 22. При этом следует отметить, что фирмы-производители тест-систем устанавливают в инструкциях к ним пороговый цикл, после которого считается, что образец не содержит искомый ген-мишень, указывающий на наличие определенного вида животного. Порог, установленный производителем к тест-системе в наших исследованиях, - 30-й цикл.
На рисунке 1 представлены положительные образцы, проанализированные в НКЦБ, содержащие ДНК птицы (Gallus gallus). Из рисунка 1 видно, что контроль выходит на примерно на 22 цикле, а два положительных образца - на 11 цикле. Таким образом, продукт ПЦР синтезируется на ранних циклах ПЦР, что достоверно указывает на наличие ДНК курицы в анализируемом образце. Если бы для такого образца был бы проведен обсчет количественного содержания гена-мишени, то был бы выявлено высокий процент содержания ДНК Gallus gallus.
Необходимо отметить, что 22,7 % образцов, в которых было выявлено наличие фальсифицирующей ДНК, составляют образцы, где синтез ПЦР-продукта с гена-мишени начинался на циклах, близких к пороговому. Так, на рисунке 2 представлен образец, в котором синтез начинался практически на 29 цикле. Поскольку в инструкции производителя указано, что пороговый цикл, после которого считается, что образец не содержит искомый ген-мишень,
3 О
указывающий на наличие определенного вида животного - 30 цикл, протокол испытаний на такой образец выдается в лаборатории, как положительный. Вместе с тем определить является ли эта несанкционированная примесь умышленным фальсификатом либо технически неустранимой примесью на производстве не представляется возможным.
2000
1500
= 1000 ас
500
О
А - Положительный контроль, ДНК Gallus gallus; Б - положительные образцы, в которых установлено наличие ДНК Gallus gallus Рисунок 1 - Детекция фальсификатов ДНК отдельных видов животных в мясной продукции
экспресс-методом ПЦР-РВ
10ОО 300 600 400 200
О 10 20 30 40
Циклы
Отдельные образцы, которых ДНК курицы выходит на разных циклах: А - на 25,14 цикле, Б - на 28,72 цикле и В - на - 30,42 цикле Рисунок 2 - Детекция фальсификатов ДНК отдельных видов животных в мясной продукции
экспресс-методом ПЦР-РВ
То, что достаточно большой процент испытанных в лаборатории НКЦБ и других лабораториях образцов составляют образцы, в которых синтез с гена-мишени начинается близко к пороговому циклу, поднимает вопрос о необходимости принятия пороговой системы
ОФ "Международный научно-исследовательский центр "Endless Light in Science"
выявления различных видов мясных ингредиентов на уровне стран ЕАЭС и внесения изменений в технический регламент Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034) в части установления термина «технологически неустранимая примесь» и порогового значения, после которого данный ингредиент считается таковым. Обосновано это тем, что метод качественной ПЦР-РВ обладает высокой чувствительностью и может выявить следовые количества ДНК определенного вида, и в результате будет считаться, что даже при наличии трех геном-эквивалентов ДНК-мишени, в продукции содержится фальсификат мясного ингредиента, который, например, не был указан поставщиком в сертификате качества.
В настоящее время разработаны тест-системы для количественного и полуколичественного определения содержания ДНК-мишени некоторых отдельных видов животных, например, набор реагентов для количественного определения ДНК курицы и ДНК свиньи с эндогенным внутренним контролем методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией [6], набор реагентов для качественной и полуколичественной оценки содержания мясного ингредиента кур (Gallus gallus) в мясной продукции (за исключением консервов) методом полимеразной цепной реакции в реальном времени [7]. Однако для точного подтверждения количественного содержания мясных ингредиентов необходимо разработать методики количественного определения видоспецифичной ДНК как в цельном мясе, так и для количественной оценки процентного соотношения фальсифицирующих примесей к основному сырью в готовой продукции сложного состава, в которой могут содержаться примеси различных видов мяса.
Для снижения затрат на проведение количественной ПЦР-РВ, а также трудозатрат, существует возможность спланировать ее так, чтобы провести количественный анализ целевого гена-мишени, нескольких целевых генов и эндогенного гена или нескольких эндогенных генов, по сравнению с содержанием которых рассчитывается количество видоспецифичной ДНК, в различных пробирках, либо валидировать методику детекции в одной пробирке, то есть «мультиплексную» реакцию. Оба варианта постановки эксперимента имеют свои преимущества и недостатки: «мультиплексные» реакции сберегают время и реагенты (становится возможно проанализировать в два раза больше образцов в одном эксперименте), позволяют избежать ошибок эксперимента в анализе контрольного и целевого гена, так как испытание ведется в одной пробирке, но, в то же время, они менее чувствительны с точки зрения предела количественного обнаружения LOQ, вследствие взаимного воздействия двух реакций и различного расхода реагентов в этих двух реакциях. С другой стороны, раздельные реакции для анализа контрольного гена и целевого гена более чувствительны с точки зрения LOQ, но требуют в два раза больше реагентов и занимают больше места для размещения аппаратуры для ПЦР-РВ, более подвержены риску, например, ошибкам при пипетировании, если анализируется только один образец.
Системы валидации новой методики для количественного определения генно-модифицированных линий и количественной видоспецифичной идентификации ДНК животных очень похожи, поскольку расчет содержания ДНК-мишени в обоих случаях необходимо производить по отношению к эндогенному гену - контролю. Несмотря на то, что количественное определение видоспецифичной ДНК может быть затруднено в сложном многокомпонентном образце, содержащем много «фонов» эндогенной ДНК в разных концентрациях, план валидации ПЦР-анализа в режиме реального времени может осуществляться по аналогии с детекцией ГМО и включать следующие компоненты:
- первая ПЦР-система, созданная для выявления ДНК определенного вида животного, входящего в состав пищевой продукции;
- вторая ПЦР-система, созданная для выявления эндогенной видоспецифичной (контрольной) последовательности, пригодной для использования в качестве «нормализатора» в расчетах относительной концентрации (или концентраций) целевой видоспецифичной ДНК;
- стандартные кривые для целевой последовательности, и для эндогенного контроля, нормализованные по отношению к эндогенному контролю.
Для каждого экспериментального образца количество целевой последовательности и эндогенной контрольной последовательностей определяется по соответствующей стандартной кривой. Количество целевой последовательности нормализуется по отношению к количеству эндогенного контроля, чтобы получить относительную концентрацию целевой последовательности. В дополнение к этому, при количественном определении как контрольного гена, так и целевой видоспецифичной последовательности, должны быть добавлены отрицательные контроли, не содержащие матрицы. Для того чтобы избежать статистической флуктуации между различными экспериментами, количественное определение контрольного гена и видоспецифичной последовательности ДНК должно осуществляться в той же самой постановке ПЦР-анализа (ко-амплификация), а не в различных постановках анализа.
Таким образом, благодаря внедрению в аккредитованных лабораториях «золотого стандарта» - метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени стало возможно достоверно устанавливать наличие отдельных видов животных, что позволяет усилить надзор и предотвращать распространение фальсификации продукции. Вместе с тем, установление порогового значения для такого вида ПЦР-РВ [4], а также дальнейшее совершенствование методов количественной ПЦР позволит различать умышленно произведенный подлог от технически неизбежной контаминации пищевого сырья, возникающей в процессе технологической обработки мяса. Внедрение указанных выше подходов для количественной оценки сырья сложного состава, содержащего несколько видов мяса, позволит предприятиям избежать необоснованных затрат на удаление партий продукции, содержание в которой технически неустранимой примеси не заявленных видов мяса не достигает порогового уровня.
1. Врублевская, В. В. Оценка состояния мясного рынка и воспроизводственного процесса в условиях обеспечения продовольственной безопасности / В. В. Врублевская, А. И. Мамаева // Статистика и Экономика. - 2022. - Т. 19, № 6. - С. 21-27. - DOI 10.21686/25003925-2022-6-21-27.
2. Identification of meat origin in food products - a review / Rahmati Sh. [et al.] // Food Control. 2016. Vol. 68. p. 379-390.
3. Комарова И.Н., Серегин И.Г., Валихов А.Ф. Полимеразная цепная реакция - современный метод выявления фальсификации мясного сырья и продуктов// Мясная индустрия. 2004. №2. С. 37-41.
4. ДНК-идентификация животных для выявления фальсификаций продуктов питания / М. Михайлова, Р. Шейко, Е. Лагун [и др.] // Наука и инновации. - 2020. - № 10(212). - с. 40-
5. АртБиоТех [Электронный ресурс]: На видопринадлежность - 2024. - Режим доступа: https://qpcr.by/vidospeczifichnost/ - Дата доступа: 29.04.2024.
6. ОрганикТест [Электронный ресурс]: ПЦР Наборы - 2024. - Режим доступа: https://organictest.ru/- Дата доступа: 29.04.2024.
7. Научно-производственная компания Синтол [Электронный ресурс]: Для идентификации сырьевого состава мясной и рыбной продукции - 2024. - Режим доступа: https://www.syntol.ru/syntolprice160424.pdf?v=1 - Дата доступа: 30.04.2024.
ЛИТЕРАТУРА
45.
