CC BY
124Органический синтез и биотехнология
УДК 57.085.2
Elena R. Zabolotskaya1, Dmitry O. Vinokhodov2
MODERN METHODS OF ISOLATION AND PURIFICATION OF ENZYMES. SEPARATION OF NUCLEASES FROM PROTEOLYTIC ENZYMES IN EXTRACT OF PANCREAS OF CATTLE
St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St. Petersburg, 190013, Russia. e-mail: gelios86@mail.ru
The article discusses and describes the main chromatographic and non-chromatographic approaches and methods of isolation and purffication of enzymes and separation of nucleases from proteolytic enzymes in the extract of the pancreas.
Key words: chromatography, enzymes, RNAse, DNAse, trypsin, chymotrypsin.
Введение
Ферменты представляют собой белковые вещества, катализирующие биохимические реакции в организме. Под их влиянием сложные органические вещества расщепляются на более простые [1]. В настоящее время наука о ферментах - энзимология -превратилась в обширную отрасль, тесно связанную со многими другими науками: биохимией, физической химией, микробиологией, генетикой, сельским хозяйством, медициной и химической технологией [2]. Связь энзимологии с таким большим числом отраслей других наук предполагает и широкое применение ферментов в пищевой и легкой промышленностях, косметологии, генной инженерии, в борьбе с вредителями и в качестве медицинских препаратов. Получение ферментов является задачей биотехнологии, которая заключается в поиске оптимального источника фермента и его дальнейших выделения и очистки. Ферментные препараты трудно или невозможно получить химическим синтезом [3].
Общая схема выделения и очистки биофармацевтических белков от примесей до терапевтических степеней чистоты представлена Д.А. Гусаровым [4]. Так же интересная комплексная схема очистки рассмотрена на примере рекомбинантного человеческого
Е.Р. Заболоцкая1 , Д.О. Виноходов2
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ. ОТДЕЛЕНИЕ НУКЛЕАЗ ОТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В ЭКСТРАКТЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия. e-mail: gelios86@mail.ru
В статье обсуждаются и описываются основные хрома-тографические и нехроматографические подходы и способы выделения и очистки ферментов, а также отделение нуклеаз от протеолитических ферментов в экстракте поджелудочной железы крупного рогатого скота
Ключевые слова: хроматография, ферменты, РНКа-за, ДНКаза, трипсин, химотрипсин.
интерферона альфа 2б, которая включает в себя стадию аффинной хроматографии и двухстадийную ионообменную хроматографию с последующим диализом, стерилизующей фильтрацией и лиофильной сушкой полученного продукта [5]. В данной работе более подробно рассмотрены способы выделения и очистки получения именно ферментных препаратов.
Очистка ферментов дает возможность не только использовать их в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и лабораторной практике в качестве лекарственных средств и реактивов, но и позволяет изучать их свойства, строение и функции. На первом этапе выбирают источник, богатый нужным ферментом для проведения экстракции и получения фермента в растворенном виде. Это могут быть как микроорганизмы природных штаммов, так и генно-модифицированные, растительное сырье и животные ткани и органы. Из животных тканей экстрагировать ферменты легче, чем из микроорганизмов [2]. Экстракцию проводят разными растворителями, в зависимости от свойств фермента и сырья. Самая простая -экстракция водой, водно-солевыми растворами. Так же могут использоваться различные органические растворители, а для получения протеолитических ферментов часто применяют кислотную экстракцию.
1. Заболоцкая Елена Романовна, аспирант каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ), e-mail: gelios86@mail.ru Elena R Zabolotskaya, Post-graduate student, Department of Molecular Biotechnology
2. Виноходов Дмитрий Олегович, д-р биол. наук, доцент, зав. каф. молекулярной биотехнологии, e-mail: vinokhodov@list.ru Dmitry O. Vinokhodov, Dr Sci. (Biol.), Associate Professor Head of the Department of Molecular Biotechnology
Дата поступления - 15 ноября 2018 года
Природа кислот и их концентрация подбираются эмпирически в процессе поиска оптимальных условий для максимального выхода и сохранения биологических свойств исследуемого фермента.
Использование ферментов в медицине предполагает высокую степень их очистки, которая начинается с удаления нерастворимого остатка: дебрисса клеток или измельченного сырья. Для этого применяют физические методы: центрифугирование и фильтрацию на различном оборудовании и/или с применением различных фильтрующих материалов. Это могут быть бумажные или тканевые фильтры, волокнистые или гранулированные фильтрующие материалы, пористые стеклянные или керамические фильтры с применением давления или вакуума. Более тонкой очистки от нерастворимых остатков можно добиться использованием химических методов: изменение рН экстракта, добавление осадителей. Выбор способа предварительной очистки экстракта подбирается экспериментально и чаще всего включает в себя последовательное применение перечисленных приемов. Основная задача на данном этапе - получение максимально прозрачного раствора, содержащего удовлетворительное количество искомого биологически активного вещества (БАВ).
В настоящее время существует множество способов проведения дальнейшего фракционирования. Выбор их зависит от желаемой степени чистоты, свойств самого фермента и свойств исходного экстракта. Наименее чувствительный, но вместе с тем простой и недорогой способ - высаливание или фракционирование солями. Метод позволяет фракционировать неограниченно большое количество вещества, использовать простые технологические операции и стандартное лабораторное или промышленное оборудование [1]. Способ основан на гидрофобных свойствах молекул белков. Чаще всего для высаливания применяют сульфат аммония. Он хорошо растворим в воде и на многие ферменты оказывает стабилизирующее действие [2]. В некоторых случаях описанных выше методов уже достаточно для получения БАВ. Так, например, была получена дезоксирибонуклеаза (ДНКаза): кислотной экстракцией 0,25н серной кислотой из измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота (КРС), фильтрацией полученного экстракта, ступенчатым высаливанием сульфатом аммония, растворением осадка фермента в минимальном объеме подкисленной воды, проведением диализа и высушиванием фермента в вакууме [6]. Такой же метод был применен и для получения рибонуклеазы (РНКазы) [7]. Оба фермента, полученных данным способом обладают невысокой степенью чистоты.
Для получения более чистых продуктов в настоящее время очень широко применяют хромато-графическую очистку, которая происходит за счет взаимодействия подвижной и неподвижной фаз [8, 9]. Известен способ очистки рекомбинантной РНКазы из клеток Bacillus megaterium методом ионообменной хроматографии [10]. Но чаще всего одним видом хроматографии не ограничиваются, а применяют серию последовательных ступеней очистки. Так, например, химотрипсиноген выделяют из поджелудочной железы морской свинки путем кислотной экстракции, высаливания сульфатом аммония, осаждением фермента в его изоэлектрической точке изменением рН раствора и ионообменной хроматографией [11]. Для получения очищенной рекомбинантной РНКазы описаны несколько разных схем выделения. В одном случае клетки
Escherichia coli разрушали ультразвуком, фермент экстрагировали трис-ЭДТА буфером, пропускали раствор через колонку с фосфоцеллюлозой Р-11, уравновешенную ацетатным буфером с мочевиной, элюировали тем же буфером в градиенте хлорида натрия. После этого проводили гель-фильтрацию на Sephadex G-25 и повторяли стадию на Р-11, но без добавления мочевины в буфер. Обессоливание продукта проводили ультрафильтрацией [12]. Во втором случае клетки Esche-richia coli разрушали под давлением, фермент экстрагировали трис-HCl буфером и наносили на колонку с DEAE-сефарозой, уравновешенную тем же буфером. Элюировали в градиенте хлорида натрия, проводили диализ и полученный раствор белка наносили на колонку с CM-сефарозой, уравновешенной ацетатным буфером. Элюцию проводили так же в градиенте хлорида натрия, обессоливали ультрафильтрацией и пропускали через колонку со SpectraGel AcA 54, уравновешенную фосфатным буфером. Полученный фермент концентрировали ультрафильтрацией, проводили стерилизующую фильтрацию и замораживали [13].
Для выделения и очистки ферментов широко применяют и метод гидрофобной хроматографии. Гидрофобные свойства белков впервые описаны в начале 1970-х годов. Первоначально применялась матрица из агарозного геля с остатками алкиламина, а для элюи-рования использовался агрессивный имидазол-цитратный буфер, изменяющий конформацию белка [14]. Арифман и Шелти обнаружили, что сорбция белка может быть оптимизирована с помощью растворов с высокой концентрацией соли, например 1М сульфата аммония, а также тем, что сродство белка к гидрофобной матрице пропорционально длине производной цепи [15]. Для разделения белков методом гидрофобной хроматографии необходимо подобрать и проанализировать целый ряд условий, таких как: природа соли (катион и анион), ее концентрация, различные лиганды неподвижной фазы, состав и природа подвижной фазы и собственно условия хроматографиро-вания: температура, рН, скорость подачи потока фазы [16]. Так, например, описан способ очистки фермента гликоген-синтетазы. В качестве неподвижной фазы использовали модифицированную алкилагарозу с короткими цепочками лиганда (n = 2, n = 3). Более длинные цепи удерживают фермент так прочно, что элюировать его можно только в денатурированном виде. Элюцию проводили линейным градиентом хлорида натрия. Очистка гликоген-синтетазы происходит за счет взаимодействия между гидрокарбонатным участком цепи агарозы и гидрофобным «карманом» белка. Для некоторых белков требуются буферы сложного состава, например ß-глицерофосфат-50 мМ мер-каптоэтанол-1 мМ ЭДТА [17].
Наибольшей степени чистоты можно достичь посредством аффинной хроматографии, которая также широко применяется для получения ферментов. Аффинная хроматография основана на способности белка связываться с лигандом сорбента и образовывать биоспецифический (аффинный) комплекс [18]. Таким способом из смеси извлекают панкреатические а-химотрипсин и трипсин. На колонке с неподвижной фазой 8-(6-аминогексил)-амино-5'- АМФ-сефарозой оба фермента РНКаза и ДНКаза количественно элюируют-ся. А отделение РНКазы от ДНКазы основано на специфическом удерживании ДНКазы на 8-(6-аминогексил)-амино-2'-АМФ-сефарозе при высокой ионной силе раствора подвижной фазы. ДНКаза де-
сорбируется в этих условиях [19]. Интересный способ очистки трипсина заключается в экстракции фермента из пилорической железы трески водой. Полученный экстракт подвергали аффинной хроматографии на колонке с п-амино-бензамидиносефарозой, уравновешенной трис-буфером. Элюировали трипсин тем же буфером с добавлением хлорида натрия. Дальнейшую очистку осуществляли хроматофокусированием на колонке с анионообменной матрицей PBE-94 [20].
Обычно процесс очистки проходит несколько циклов до тех пор, пока фракции, полученные элюци-ей, не будут содержать массовую долю белка выше или равной 95 % [21].
Материалы и методы
Материалы и реактивы сорбент YMC- BioPro 75S (фирмаYMC), колонки Econo-Column разных размеров и адаптеры к ним Econo-Column (производитель Bio-Rad), колонка для ВЭЖХ Jupiter C18, 300 А, 150x4,6 мм (фирма Phenomenex), лимонная кислота моногидрат и безводная ч.д.а. ГОСТ 3652-69, серная кислота ч.д.а. ГОСТ 4204-77 , натрий лимоннокислый 5,5-водный, ч.д.а. ГОСТ 22280-76, натрий хлористый, ч.д.а. ГОСТ 4233-77, натрия гидроксид ч.д.а. ГОСТ 4328-77, кислота ортофосфорная ч.д.а. ГОСТ 6552-80, вода дистиллированная ГОСТ Р 58144-2018, трис(гидроксиметил)аминометан 99,80 % для биохимии (Acros, «Нева-Реактив» Cas № 77-86-1), медь (II) сернокислая 5-ти водная ч.д.а. ГОСТ 4165-78, натрий-калий виннокислый 4-х водный ч.д.а. ГОСТ 5845-79, калия йодистый ч.д.а. ГОСТ 4232-74, магний сернокислый 7-ми водный ч.д.а. ГОСТ 4523-77, кислота хлорная х.ч. ГОСТ 6552-80, кислота соляная ос.ч. ГОСТ 1426177, натрий уксуснокислый 3-водный, ч.д.а. ГОСТ 19978 , барий хлорнокислый, ч.д.а., спирт изопропиловый абс. ГОСТ 9805-84, спирт этиловый 1 с. ГОСТ 59622013, кальция хлорид 6-ти водный ч.д.а. ГОСТ Р 559732014 , диметилсульфоксид (ДМСО) х.ч. ТУ 6-09-381889, ледяная уксусная кислота ос.ч. ГОСТ 18270-72, п-нитроанилин ч.д.а., магний хлористый 6-ти водный ч.д.а. ГОСТ 4209-77 , натрий додецил сульфат ч.д.а. ТУ 6-09-10-1405-79, трихлоруксусная кислота (ТХУ) ч. ТУ 6-09-1926-77, акриламид ч., бисакриламид ч., ацетони-трил для хроматографии, сорт 1 ос.ч. (Криохром) ГОСТ 11097-86, ^^^^-тетраметилендиамин (ТЕМЕД) ч.д.а., кислота аминоуксусная (глицин), ч.д.а. ГОСТ 5860-75, аммоний надсернокислый (персульфат аммония) ч.д.а., Кумасси G-250/Brilliant Blue G-250 («Диа-М» кат.№ 6104-58-1ф), Low-Range SDS-PAGE Standards (BioRad, кат.№ 1610304), 2x Laemmli Sample Buffer (BioRad, кат.№ 1610737), Ribonucleic acid from torula yeast - РНК (Sigma, Cas № 63231-63-0 ), Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes - ДНК (Sigma, Cas № 438545-06-3), Na-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride - БАПНА (Sigma, Cas № 911-77-3), N-Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester - БТЭЭ (Sigma, Cas № 3483-82-7), Ribonuclease A from bovine pancreas (Sigma, Cas № 9001-99-4), Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Sigma, Cas № 9003-98-9), Trypsin from bovine pancreas (Sigma, Cas № 9002-07-7), a-Chymotrypsin from bovine pancreas (Sigma, Cas № 900407-3), кизельгур марки Super (Pall).
Методики. Для определения концентраций белка в пробах применяли биуретовый метод и спек-трофотометрические методы [22].
Для определения ферментативной активности в образцах применяли модифицированные методы [1, 23-26].
Молекулярные массы белков (свыше 10 кДа) в исследуемых образцах определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (SDSPAGE) [27] с использованием маркеров Low-Range SDS-PAGE Standards, фирмы BioRad. По данным электрофореза идентифицируют наличие или отсутствие ферментов в соответствии с их молекулярными массами, определенными по стандартным веществам.
Анализ белка в образцах проводили путем об-ращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Jupiter C18,300Â, 50x4,6 мм, фирмы Phenomenex. Наличие определяемых ферментов в полупродукте возможно идентифицировать по времени выхода вещества, определенного в сравнении со стандартными образцами. В качестве подвижной фазы используется смесь ацетонитрила и воды, подкисленной ортофосфорной кислотой до рН = 3,0 ± 0,5. Анализ проводили в градиенте ацетонитрила от 16 % до 55 % в течение 30 мин. Для определения времени выхода каждого фермента был проведен анализ стандартных образцов ферментов фирмы Sigma. Результаты представлены в таблице 1 и на рисунках 1, 2. При увеличении электропроводности раствора, время выхода продуктов может смещаться на несколько минут.
Таблица 1. Время выхода ферментов из колонки
Jupiter C18.
№ п/п Фермент Время выхода, мин
1 РНКаза 6,90-8,5
2 ТС 15,9-16,5
3 ХТС 22,1-23,8
4 ДНКаза 24,1-26,5
Рисунок 1. ВЭЖХ стандартных образцов: РНКазы/ (Sigma), ТС (Sigma BRP), ХТС (Sigma BRP), ДНКазы/ (Sigma)
Рисунок 2 ВЭЖХ стандартного образца ДНКазы (Sigma) в масштабе.
Экстракт получали с помощью кислотной экстракции ткани поджелудочной железы КРС известным способом [1], а затем осветляли и разбавляли стартовым 0,02 М цитратным буфером рН = 3,0 ± 0,5 до заданной электропроводности < 10 мСм/см.
Колонку Есопо-Со1итп с адаптером заполняли 50 мл сорбента YMC-BioPro 75Б и подключали в систему хроматографа. Насыщали колонку пропусканием 5-ти колоночных объемов стартового буфера. В процессе сорбции пропускали около 40 объемов колонки заранее подготовленного и разбавленного экстракта. Затем колонку промывали 5-ю колоночными объемами стартового буфера. Далее проводили процесс элюции с помощью с раствора с градиентом от 0 % до 35 % элюирующего буфера в количестве 10-12 колоночных объемов с одновременным сбором фракций. Окончание первой фракции получали промывкой колонки 5-ю колоночными объемами раствора с 35 % элюирующего буфера. И окончательную элюцию проводили 100 % элюрующим буфером около 5 объемов колонки. Выход белковых фракций контролировали спектрофотомет-рически. В первой фракции из колонки выходят трип-синоген и химотрипсиноген, а во второй фракции выходят нуклеазы, что подтверждается данными ВЭЖХ (рисунки 3, 4) и электрофореза по Лэммли (рисунок 5), а также материальным балансом по ферментативной активности. По окончании элюции проводили регенерацию сорбента растворами 0,1М №04, водой и 2М На рисунке 6 показан профиль сорбции-элюции экстракта ткани поджелудочной железы, а в таблице 2 приведены данные по ферментативной активности и концентрации белка в каждой фракции.
Рисунок 3. Анализ пика 1 методом ВЭЖХ
Рисунок 4. Анализ пика 2 методом ВЭЖХ
Рисунок 5. Гэль-электрофорез экстракта, фракций с И ОХ и стандартных образцов: 1 - маркер Bio-Rad, 2 - исходный подготовленный для хроматографирования экстракт, 3 - пик 1, 4 - пик 2, 5- РНКаза стандарт (Sigma), 6 - ТС стандарт (BRP), 7 - ХТС стандарт (BRP), 8 - ДНКаза стандарт (Sigma).
0 50 100 150 200 250 300 350 Рисунок 6. Профиль сорбции-элюции экстракта поджелудочной железы
Таблица 2. Результаты определения количества белка, ферментативной активности и общего выхода на стадии ионообменной
хроматографии.
Экстракт поджелудочной железы, осветленный и разбавленный. Исходные данные
Объем на колонку по факту 1740,0 мл Концентрация белка 10,40 мг/мл Общий белок на колонку
18096,00 мг
Активность на 1 мл:
Активность на 1 мг белка:
Трипсин 0,243 ПЕ/мл Трипсин 0,0398 ПЕ/мг б.
ХТС 69,61 БТЕ/мл ХТС 0,50 БТЕ/мг б.
ДНК-аза 9558,7 ЕА/мл ДНК-аза 919,11 ЕА/мг б.
РНК-аза 672,1 ЕА/мл РНК-аза 64,63 ЕА/мг б.
Концентрация белка: Тотальная активность:
Трипсин 6,10 мг/мл Трипсин 422,82 ПЕ
ХТС 6,10 мг/мл ХТС 121121,40 БТЕ
ДНК-аза 10,40 мг/мл ДНК-аза 16632138,00 ЕА
РНК-аза 10,40 мг/мл РНК-аза 1169454,00 ЕА
Проскок
Концентрация белка: 1,7 мг/мл Количество белка: 3383,00 мг
Объем: 1990 мл Выход по белку: 18,69 %
Активность на 1 мл: Активность на 1 мг белка:
Трипсин 0,000 ПЕ/мл Трипсин 0,0000 ПЕ/мг б.
ХТС 1,17 БТЕ/мл ХТС 1,30 БТЕ/мг б.
Продолжение таблицы 2.
ДНК-аза 5,2 ЕА/мл ДНК-аза 3,06 ЕА/мг б.
РНК-аза 0 ЕА/мл РНК-аза 0,00 ЕА/мг б.
Концентрация белка: Тотальная активность:
Трипсин 0,90 мг/мл Трипсин 0,00 ПЕ
ХТС 0,90 мг/мл ХТС 2328,30 БТЕ
ДНК-аза 1,70 мг/мл ДНК-аза 10348,00 ЕА
РНК-аза 1,70 мг/мл РНК-аза 0,00 ЕА
Потери на стадии
Трипсин 0,00 % ДНК-аза 0,06 %
ХТС 1,92 % РНК-аза 0,00 %
Элюция
Пик 1
Пик 2
Объем пика: 250 мл 54 мл
Конц-ция белка: 6,4 мг/мл 1,5 мг/мл
Кол-во белка: 1600,00 мг 81,00 мг
Выход по общему белку: 8,84 % 0,45 %
Активность на 1 мл:
Трипсин 0,95 ПЕ/мл 0,03 ПЕ/мл
ХТС 202,40 БТЕ/мл 10,05 БТЕ/мл
ДНК-аза 1427,4 ЕА/мл 163250 ЕА/мл
РНК-аза 151,2 ЕА/мл 15280 ЕА/мл
Концентрация белка:
Трипсин 6,40 мг/мл 1,50 мг/мл
ХТС 6,40 мг/мл 1,50 мг/мл
ДНК-аза 6,40 мг/мл 1,80 мг/мл
РНК-аза 6,40 мг/мл 1,80 мг/мл
Активность на 1 мг белка:
Трипсин 0,15 ПЕ/мг б. 0,02 ПЕ/мг б.
ХТС 1,30 БТЕ/мг б. 6,70 БТЕ/мг б.
ДНК-аза 223,0 ЕА/мг б. 90694,4 ЕА/мг б.
РНК-аза 23,63 ЕА/мг б. 8488,89 ЕА/мг б.
Тотальная активность:
Трипсин 237,5 ПЕ 1,62 ПЕ
ХТС 50600 БТЕ 542,7 БТЕ
ДНК-аза 356850 ЕА 8815500 ЕА
РНК-аза 37800 ЕА 825120 ЕА
Выход на стадии:
Трипсин 56,2 % 0,4 %
ХТС 41,8 % 0,4 %
ДНК-аза 2,1 % 53,0 %
РНК-аза 3,2 % 70,6 %
На рисунках 3 и 4 показаны результаты проведения анализа пиков методом ВЭЖХ, а на рисунке 5 - результаты электрофореза полученных фракций в сравнении со стандартными образцами и исходным экстрактом. Из хроматограмм и данных электрофореза видно, что во фракциях присутствуют искомые ферменты. Время выхода из колонки и результаты электрофореза коррелируют с этими же показателями стандартных образцов, а также соответствуют определению активности искомых ферментов во фракциях.
Заключение
В данной работе приведен краткий обзор методов выделения и очистки ферментов из разных видов сырья, а также отделение протеолитических ферментов от нуклеаз в экстракте поджелудочной железы КРС..
В подобранных условиях: буфера, рН, электропроводности, осветления, пробоподготовки и объема экстракта на сорбент YMC-BioPro 75S наблюдалась
наиболее эффективная сорбция всех четырех ферментов. Потери конечных продуктов в проскоке незначи
тельны и лежат в пределах погрешности измерений активностей и концентрации белка. Полученные результаты определения активностей, ВЭЖХ и электрофореза показали эффективное разделение смеси трип-синогена и химотрипсиногена в первом пике от нукле-аз во втором. Выходы по активности также оказались удовлетворительными/
Литература
1. Беленький Н.Г., Полонская Л. Б., Чамин Н.Н. Новое в производстве ферментов и ферментных препаратов из животного сырья. Малоярославец, 1966. 104 с.
2. ДиксонМ, УэббЭ. Ферменты / под ред. А.И. Опарина. М.: Мир, 1966. 816 с.
3. Ковалева Т.А., Сливкин А. И,, Беленова А. С,, Суслина С.Н. Биотехнология: учеб. пособие. Ч. 1. Мик-
робная биотехнология. Химическая энзимология. Воронеж: ИЦП ВГУ. 2011. С. 90.
4. Гусаров Д.А. Даунстрим-процесс очистки биофармацевтических белков // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016. № 3(16). С. 8899.
5. Шуваева Г.П, Сучилин С.С, Усачева Е.В.. Современные методы очистки медицинских препаратов, полученных микробным синтезом // Актуальная биотехнология. 2016. № 1(16). С. 41-44.
6. Mccarty М. Purification and properties of Des-oxyribonuclease isolated from beef pancreas // Journal of general physiology. 1946. Vol. 29. Is. 3. Р. 123-139.
7. Kunttz М. Crystalline Ribonuclease // Journal of General Physiology. 1940. Vol. 24. Is. 1. Р. 15-32
8. Ибрагимов А.Н., Бикмуллин А.Г., Сатаева Д.А, Лопухов Л.В. [и др.]. Хроматографические методы анализа белков Казань: ФГАОУ ВПО КФУ, 2013. 48 с.
9. Конюхов В.Ю. Хроматография // СПб.: Изд-во «Лань». 2012. 224 с.
10. Дудкина Е.В, Ульянова В.И. [и др.]. Получение новой секретируемой Рибонуклеазы Bacillus Sp. на основе рекомбинантного штамма Bacillus Megaterium. // Вестник Казанского Технологического Университета. 2013. Т. 16. № 10. стр 186-190.
11. Siekevitz Ph., Palade G.E. A Cytochemical Study On The Pancreas Of The Guinea Pig V. In vivo Incorporation Of Leucine-L-C 14 into the Chymotrypsinogen оf Various Cell Fractions // J. Biophysic. and Biochem. Cy:Rol. 1960. Vol. 7. № 4. Р. 619-634.
12. Kanayass Sh, Itayan M. Expression, purification, аnd characterization of a recombinant Ribonuclease H from Thermus Thermophilus Hb8 // Journal of Biological Ohemistry. 1992. tol. 267. № 14. P. 10184-10192.
13. Becerra S.P, Clore G.M. [et a.] Purification and characterization of the Reverse Transcriptase expressed in recombinant Rnase H domain of Hiv-L Escherichia coli // Febs Letters. 1990. Vol. 270. № 1,2. Р. 7680.
14. Fausnaugh J.L, Kennedy L.A, Regnier F.E. Comparison Of Hydrophobic-Interaction And Reversed phase Chromatography of proteins // Journal оf Chroma-tography. 1984. Vol. 3. № 1. Р. 141-155
15. Arfmann H.A., ShaltielS. Resolution and purification of histones on homologous series of hydrocarbon-coated agaroses.// Eur. J. Biochem. 1976. № 70. Р. 269273.
16. Queiroz J.A., Tomaz C.T, Cabral J.M.S. Hy-drophobic interaction Chromatography of proteins // Journal оf Biotechnology. 2001. Vol. 87. Р. 143-159.
17. Shattiel Sh, Er-E. Z Hydrophobic Chroma-tography: use for purification of Glycogen Synthetase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. №. 3. Р. 778781.
18. Османов В.К, Бирюкова О.В, Борисова А.В. Методы выделения и очистки продуктов биотехнологических производств. Н. Новгород: НижГМА, 2005. 104 с.
19. Lazarus L.H, Lee C.-Y, Wermuth B. Application of general ligand affinity Chromatography for the mutual separation of Deoxyribonuclease and Ribonuclease free of protease contamination // Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 74. Р. 138-142.
20. Asgeirsson B, Fox J.W, Bjarnason J.B. Purification and characterization of Trypsin from the poikilo-
therm Gadus Morhua // Eur. J. Biochem. 1989. № 180(1). Р. 85-94.
21. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот М.: Наука, 1985. 536 с.
22. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки, М.: Мир, 1976 368 с.
23. Anson M. The estimation of pepsin, trypsin, papainand cathepsin with hemoglobin // J. Gen. Physiol. 1938. Vol. 22. P. 79-83.
24. Нортроп Д, Кунитц М, Херриотт Р. Кристаллические ферменты. Пер. с англ. М.: Наука, 1950. 346 с.
25. Черников М. П., Никольская Г. В, Стан Е. Я. Гидролиз казеина и некоторых его компонентов протеиназами желудочно-кишечного тракта // Биохимия. 1967. Т. 32, № 6. С.1122-1127.
26. Schwert G. W, Takenaka J. A spectrophotometry determination of tripsin and chymotrypsin // Biochem. Biophys. Acta. 1955. Vol. 16.№ 47. P. 570-575.
27. Laemmi K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1972. Vol. 227. № 1. P. 680-685.
References
1. Belenky N.G., Polonskaya, L.B, Chamina N.N. New production of enzymes and enzyme products from animal raw materials. Maloyaroslavets, 1966. 104 p.
2. Dixon M, Webb E. Enzymes / ed. by A.I. Oparin. M.: Mir, 1966. 816 p.
3. Kovaieva ТА, Slivkin А.I, Beienova. AS, аnd Susm S.N. Biotechnology: studies. benefit. Part 1. Microbial biotechnology. Chemical Enzymology. Voronezh: VSU PPI. 2011. P. 90.
4. GusarovD.A. the Downstream-purification process of biopharmaceutical proteins // Development and registration of medicines. 2016. № 3 (16). P. 88-99.
5. Shuvaeva G.P, SuchWn S.S., Usacheva E.V. Modern methods of purification of medical preparations obtained by microbial synthesis // Actual biotechnology. 2016. No. 1 (16). P. 41-44.
6. McCarthy. Purification and properties of Des-oxyribonuclease isolated from beef pancreas // Journal of General physiology. 1946. T. 29. Eat. 3. P. 123-139.
7. Kunitz Martens' Crystalline Ribonuclease // Journal of General Physiology. 1940. Vol. 24. Is. 1. Р. 1532.
8. Ibragimov, A.N. BikmuHn A.G., Satayeva D.A, Lopukhov, L V. [and others]. Methods of analysis of protein Chromatographic. Kazan: FGAOU VPO Kazan Federal University, 2013. 48 p.
9. Konyukhov V.Yu. Chromatography SPb.: LAN publishing house. 2012. 224 p.
10. Dudkin E.V, U/yanov V.I. [etal.]. Obtaining a new secreted Ribonuclease Bacillus SP. on the basis of recombinant strain of Bacillus megaterium. // Bulletin оf Kazan Technological University. 2013. Vol. 16. No. 10. Р. 186-190.
11. Siekevitz Ph, Palade G.E. A Cytochemical Study On The Pancreas Of The Guinea Pig V. In vivo Incorporation Of Leucine-L-C 14 into the Chymotrypsinogen оf Various Cell Fractions // J. Biophysic. and Biochem. Cy:Rol. 1960. Vol. 7. № 4. Р. 619-634.
12. Kanayass Sh, Itayan M. Expression, purification, аnd characterization of a recombinant Ribonuclease H from Thermus Thermophilus Hb8 // Journal of Biological CTiemistry. 1992. tol. 267. № 14. P. 10184-10192.
13. Becerra S.P., Clore G.M. [et a/.] Purification and characterization of the Reverse Transcriptase expressed in recombinant Rnase H domain of Hiv-L Escherichia coli // Febs Letters. 1990. Vol. 270. № 1,2. P. 7680.
14. Fausnaugh J.L., Kennedy L.A., Regnier F.E. Comparison Of Hydrophobic-Interaction And Reversed phase Chromatography of proteins // Journal of Chromatography. 1984. Vol. 3. № 1. P. 141-155
15. Arfmann H.A., ShaltielS. Resolution and purification of histones on homologous series of hydrocarbon-coated agaroses.// Eur. J. Biochem. 1976. № 70. P. 269273.
16. Queiroz J.A., Tomaz C.T., Cabral J.M.S. Hydrophobic interaction Chromatography of proteins // Journal of Biotechnology. 2001. Vol. 87. P. 143-159.
17. Shaltiel Sh, Er-E. Z Hydrophobic Chromatography: use for purification of Glycogen Synthetase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. №. 3. P. 778781.
18. Osmanov V.K., Biryukova.O.V, Borisova A.V. Methods of isolation and purification of biotechnological products manufactures N. Novgorod: Nizhny Novgorod State Medical Academy, 2005. 104 p.
19. Lazarus L.H, Lee C.-Y, Wermuth B. Application of general ligand affinity Chromatography for the mutual separation of Deoxyribonuclease and Ribonuclease
free of protease contamination // Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 74. P. 138-142.
20. Asgeirsson BB., Fox J.W, BBjarnason J.BB. Purification and characterization of Trypsin from the poikilo-therm Gadus Morhua // Eur. J. Biochem. 1989. № 180(1). P. 85-94.
21. Osterman L.A. Chromatography of proteins and nucleic acids, Moscow: Nauka, 1985. 536 p.
22. Deveni T., Gorgey J. Amino acids, peptides and proteins, M.: Mir, 1976 368 p.
23. Anson M. The estimation of pepsin, trypsin, papainand cathepsin with hemoglobin // J. Gen. Physiol. 1938. Vol. 22. P. 79-83.
24. Northrop D, Kunitz M, Herriott R. Crystalline enzymes. Trans. with English. Moscow: Nauka, 1950. 346 p.
25. Chemikov M.P., Nikol'skaya G.V., Stan E.Ya. Hydrolysis of casein and some of its components by gastrointestinal proteinases // Biochemistry. 1967. Vol. 32, № 6. P. 1122-1127.
26. Schwert G. W, Takenaka J. A spectrophotometry determination of tripsin and chymotrypsin // Biochem. Biophys. Acta. 1955. Vol. 16.№ 47. P. 570-575.
27. Laemmii K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1972. Vol. 227. № 1. P. 680-685.
