CC BY
13УДК 57.085.2 Elena R. Zabolotskaya1, Dmitry O. Vinokhodov2
CLARIFICATION OF EXTRACT OF PANCREAS OF CATTLE
St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St. Petersburg, 190013, Russia. e-mail: gelios86@mail.ru
Since the processes of hydrolytic cleavage are widely used in various industries, the production of hydrolytic enzymes is one of the promising directions in biotechnology. Various types of liquid chromatography are often used for isolation and purification of proteins. They require careful preparation of the liquids to be examined. In the article various ways of clarification of an extract of a pancreas are presented.
Key words: enzymes, clarification, pancreatic extract, filtration, chromatography
Введение
Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии [1]. Особенно ценными для производства являются гидролитические ферменты, поскольку процессы гидролитического расщепления широко применяются в разных отраслях промышленности [2]. Многие биологически активные вещества (БАВ) впервые были получены из природного растительного и животного сырья и использовались для лечения болезней растений, животных, человека, для борьбы с вредителями [3]. Потребность БАВ на современном этапе тесно связана с решением глобальных проблем интенсификации производства и экологическим оздоровлением окружающей среды, а именно: получением новых видов продуктов различного назначения и в первую очередь препаратов профилактического и терапевтического действия, утилизацией отходов промышленности и сельского хозяйства, получением экологически безопасных средств защиты. Разработка промышленной технологии производства БАВ из сырья природного происхождения позволяет осуществить комплексное использование биоресурсов [3]. Однако для получения более чистых продуктов и ускорения процесса выделения и очистки необходимо использовать современное оборудование, расходные материалы и применять методики и приемы, разработанные в последние годы. Для выделения и очистки белков, в частности, ферментов очень часто применяют различные виды жидкостной хроматографии. Современные сорбенты обладают высокой емкостью и селективностью, но являются мелкозернистыми. И этот факт обуславливает качественные особенности исследуемого материала. Жидкость, при подаче на колонку с мелкозернистым сор-
Е.Р. Заболоцкая1 , Д.О. Виноходов2
ОСВЕТЛЕНИЕ ЭКСТРАКТА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия. e-mail: gelios86@mail.ru
Процессы гидролитического расщепления широко применяются в различны/х отраслях промышленности, производство гидролитических ферментов является одним из перспективных направлений в биотехнологии. Для вы/деления и очистки белков часто применяют различные виды/ жидкостной хроматографии, которая требует тщательной пробоподготовки исследуемых жидкостей. В статье представлены/ различные способы/ осветления экстракта поджелудочной железы/.
Ключевые слова: ферменты, осветление, экстракт поджелудочной железы, фильтрация, хроматография
бентом, должна быть прозрачной, не вязкой, без инородных включений. В противном случае колонка засоряется, ухудшается хроматографический профиль, прекращается качественное разделение веществ, увеличивается давление в колонке, что в конечном итоге может привести к остановке процесса и поломке оборудования. Поэтому при работе с такими сорбентами на современных автоматизированных хроматографах особое внимание нужно уделить пробоподготовке исследуемого образца. Экстракты органов животных, в частности поджелудочной железы крупного рогатого скота (КРС), получаются мутными, вязкими, с жировыми включениями даже после фильтрации и центрифугирования. Различные виды исходного сырья дают и различные по качеству экстракты, для осветления которых применяют разнообразные методы. Это может быть осаждение продукта ацетоном [4] или осветление экстракта термической обработкой [5, 6]. Но перечисленные методы нельзя применить для получения ферментов из поджелудочной железы, поскольку они являются термолабильными, особенно дезоксирибону-клеаза (ДНКаза), и инактивируются в результате обработки органическими растворителями [7]. Широкое применение в медицинской промышленности для стерилизующей, осветляющей и тонкой фильтрации жидких сред находят применение патронные фильтры, основным элементом которых является полимерная мембрана. Микрофильтрация является одним из наиболее распространенных промышленных мембранных процессов [8]. В настоящей работе рассматриваются три способа осветления экстракта поджелудочной железы для подготовки его к последующему хро-матографированию.
1. Заболоцкая Елена Романовна, аспирант каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ), e-mail: gelios86@mail.ru Elena R Zabolotskaya, Post-graduate student, Department of Molecular Biotechnology
2. Виноходов Дмитрий Олегович, д-р биол. наук, доцент, зав. каф. молекулярной биотехнологии, e-mail: vinokhodov@list.ru Dmitry O. Vinokhodov, Dr Sci. (Biol.), Associate Professor Head of the Department of Molecular Biotechnology
Дата поступления - 31 октября 2018 года
Материалы и методы
Экстракт получен обработкой раствором 0,25 н серной кислоты поджелудочной железы КРС способом, описанным в [9, 10]. Основная масса жмыха удалена грубой фильтрацией и центрифугированием в течение 20 мин. при 3000 об/мин на центрифуге К24 с охлаждением. Подготовленный экстракт замораживали [11, 12], а затем оттаивали [13].
Одну часть экстракта подвергали двухступенчатой микрофильтрации на мембранных капсульных элементах марки КфВгП из полипропилена, которые производятся по запатентованной технологии (ООО НПП «Технофильтр», Москва). На фильтр экстракт подавался перистальтическим насосом MasterFlex L/S (США) со скоростью 50 мл/мин. Сначала применяли фильтр с диаметром пор 20 мкм, а затем фильтр с диаметром пор 1 мкм. Результат осветления оценивали визуально в сравнении с исходным размороженным экстрактом.
У второй части экстракта изменяли рН [9]. Для этого при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке ПЭ-6110 (ООО «Экросхим», Россия) и контроле рН на рН-метре «Эксперт» (ООО «Эконикс-Экспрерт», Россия) в экстракт добавляли сухой трис-гидроксиметил-аминометан (99 % для биохимии, Acros, «Нева-Реактив» Cas № 77-86-1) до значения рН = 8-9. Экстракт центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин на настольной центрифуге Elmi СМ-6М (Латвия). Образовавшийся осадок отделяли, а к экстракту при непрерывном перемешивании и контроле рН добавляли раствор 2,5н серной кислоты до достижения значения рН = 2-3. Экстракт снова центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, и, после отделения осадка, анализировали. Результат оценивали визуально в сравнении с исходным размороженным экстрактом.
Третью часть экстракта пропускали самотеком с приблизительной скоростью потока 0,25 мл/мин через стеклянную колонку диаметром 1 см, заполненную сорбентом Purolite А845 (США) на высоту слоя 7 см. На выходе из колонки экстракт собирали и оценивали результат осветления визуально, в сравнении с исходным размороженным экстрактом.
Результаты и обсуждение
На рисунке 1 показаны результаты осветления экстракта в трех описанных экспериментах.
Рисунок 1. Осветление экстракта: 1 - исходный размороженный экстракт, 2 - Экстракт после двухступенчатой очистки на «Технофильтре», 3 - экстракт после смещения рН, 4 - экстракт после пропускания через Purolite А845
Во втором и третьем экспериментах экстракты получились прозрачными, что позволило провести дополнительные исследования методами обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и электрофореза на наличие интересующих нас ферментов и их предшественников: трипсино-гена (ТС), химотрипсиногена (ХТС), дезоксирибонукле-азы (ДНКазы) и рибонуклеазы (РНКазы). ВЭЖХ проводили на приборе Shimadzu LC-2030C (Япония) в градиенте ацетонитрила от 16% до 55%. На рис. 2-5 представлены полученные хроматограммы. В таблице 1 представлено время выхода ферментов из колонки.
Таблица 1. Время выхода ферментов из колонки
№ п/п Фермент Время выхода, мин
1 РНКаза 7,98-8,5
2 ТС 15,9-16,5
3 ХТС 22,1-22,8
4 ДНКаза 23,5-24,8
Рисунок 2. ВЭЖХ стандартных образцов: РНКазы (Sigma), ТС (BRP), ХТС (BRP), ДНКазы (Sigma)
Рисунок 3. ВЭЖХ стандартного образца ДНКазы (Sigma) в масштабе.
Множественная PDA 1 229nm.4nm
ХТС £
тс я
1 23 471
JLA _ Jv
10 15 20 25 30 35
Рисунок 4. ВЭЖХ Экстракта, осветленного смещением рН;
Рисунок 5 ВЭЖХ экстракта, осветленного Purolite А845;
На рисунке 6 представлены результаты анализа качественного состава исследуемых экстрактов методом одномерного гель-электрофореза в 12 %-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия (SDS) согласно стандартному протоколу по Лэммли [14]. Электрофорез проводили в ячейке Mini-Protean (Bio-Rad Laboratories, США).
100 Kj>
50кД> — .
12 3456 789
Рисунок 6. Гель-электрофорез экстрактов и стандартных образцов: 1- маркер Bio-Rad, 2- исходный размороженный экстракт, 3- экстракт после «Технофильтра», 4- экстракт после смещения рН, 5- экстракт после Purolite А845, 6- РНКаза стандарт (Sigma), 7- ТС стандарт (BRP), 8- ХТС стандарт (BRP), 9- ДНКаза стандарт (Sigma).
Заключение
Показано, что для капсульных фильтров экстракт поджелудочной железы является слишком сложной средой и данные фильтры не дают требуемой степени осветления. Пропускание через стеклянную колонку с сорбентом Purolite А845 длительный и, несмотря на хорошую степень осветления и инертность сорбента Purolite А845 по отношению к искомым ферментам, не является оптимальным. Для ускорения осветления экстракта данным методом необходимо провести дополнительные исследования по подбору высоты слоя сорбента и диаметра колонки.
Наиболее эффективным и быстрым является осветление экстракта центрифугированием с предварительным изменением рН. При этом при смещении рН искомые ферменты не выпадают в осадок. Их наличие в осветленном экстракте описанным способом экстракте показано методами ВЭЖХ и электрофореза.
Литература
1. Царенко О.В. Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы: дис. ... канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 2000. 125 с.
2. Гладун Д. В,, Ракша Н.Г., Савчук О. М, Остапенко Л.1. Антарктичн морськ пдробюнти новi перспективы джерела отримання гiдролiтичних ферменпв // Ukrainian Biopharmaceutical Journal. No. 6 (41). 2015. Р. 52-55.
3. Салова Т.Ю., Громова Н.Ю. Теоретические аспекты получения биологически активных веществ из растительного и животного сырья // Успехи современного естествознания. 2016. № 3. С. 39-43.
4. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Кравченко В. И., Трофимович Б. Г., Беседнова Н.Н., Сыропятов Б. Я. Способ получения пептидов, обладающих антипроте-азным, иммуностимулирующим и гипотензивным действием: пат. 2036648 Рос. Федерация.. № 92 5038271; заявл. 20.03.1992; опубл. 1995. БИ № 22. 2003
5. Стекольников Л. И., Самойленко И. И. Способ получения препарата гиалуроновой кислоты для использования в офтальмологии: пат. 2052265. Рос. Федерация.. m 92 003570; заявл. 02.11.1992; опубл. 1995
6. Мельников Н.В., Михайлова Н-A, Нигамов Ф.Н., Зобова Т.И., Хабибуллина AS. Способ получения гидролизата мозговой ткани: пат. 2147888 Рос. Федерация. m 98103542/14; заявл. 24.02.1998; опубл. 27.04.2000. Бюл. N° 12. 2000.
7. ДиксонМ, УэббЭ. Ферменты / под ред. A.M. Опарина. М.: Мир, 1966. 816 с.
8. Серякова A.В. Исследование экстракции низкомолекулярных компонентов мембранных модулей: сб. науч. тр. SWorld Выпуск 3(40). Том 1. Иваново: Научный мир, 2015. С. 70-72.
9. Беленький Н.Г,,Полонская Л.Б,Чамин Н.Н. Новое в производстве ферментов и ферментных препаратов из животного сырья. Малоярославец, 1966. 104 с.
10. Дмитренко Л.В., Глазова Н.В., Рудометова Н.В. и др. Способ получения гидролитических ферментов: пат. 2021372 Рос. Федерация.. m 4942523/13; заявл. 30.04.1991; опубл. 15.10.1994.
11. Мельников Н.В, Нигамов Ф.Н., /лсы/нбаев М.М. Способ получения пептидов, обладающих антиго-надотропным действием: пат. 2136296 Рос. Федерация.. m 97120213/14; заявл. 04.12.1997; опубл. 10.09.1999.
12. Aнтипов С.Т., Овсянников В.Ю. Исследование охлаждения экстрактов поджелудочной железы, печени и желчи // Вестник международной академии холода. 2002. N° 4. С. 36-37.
13. Сафонова Г.М. Способ выделения натриевой соли ДНК из тканей животного происхождения: пат. 2302876. Рос. Федерация. m 2005132525/15; заявл. 21.10.2005; опубл. 20.07.2007. БИ N° 20. 2007
14. Laemmli K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1972. Vol. 227. N° 1. P. 680-685.
References
1. Carenko O.V. Hromatograficheskaja ochistka gidroliticheskih fermentov iz podzheludochnoj zhelezy: dis. ... kand. biol. nauk. Sankt-Peterburg, 2000. 125 s.
2. Gaadun D.V., Raksha N.G., Savchuk O.M., Ostapenko L.I. Antarktichni mors'ki gidrobionti novi per-spektivni dzherela otrimannja gidrolitichnih fermentiv // Ukrainian Biopharmaceutical Journal. No. 6 (41). 2015. R. 52-55.
3. Salova T.Ju, Gromova N.Ju. Teoreticheskie aspekty poluchenija biologicheski aktivnyh veshhestv iz rastitel'nogo i zhivotnogo syr'ja // Uspehi sovremennogo estestvoznanija. 2016. m 3. S. 39-43.
4. Pivnenko T.N, Jepshtejn L.M, Kravchenko V.I, Trofímovich B.G, Besednova N.N, Syropjatov BJa. Sposob poluchenija peptidov, obladajushhih antiprotea-znym, immunostimulirujushhim i gipotenzivnym dejstviem: pat. 2036648 Ros. Federacija.. m 92 5038271; zajavl. 20.03.1992; opubl. 1995. BI N° 22. 2003
5. Stekol'nikov L.I, Samojlenko I.I. Sposob poluchenija preparata gialuronovoj kisloty dlja ispol'zovanija v oftal'mologii: pat. 2052265. Ros. Federacija.. m 92 003570; zajavl. 02.11.1992; opubl. 1995
6. Mel'nikov N. V, Mihajlova N.A, Nigamov F.N, Zobova T.I, Habibullina A.G. Sposob poluchenija gidroli-zata mozgovoj tkani: pat. 2147888 Ros. Federacija. m
98103542/14; zajavl. 24.02.1998; opubl. 27.04.2000. Bjul. № 12. 2000.
7. Dikson M, Ujebb Je. Fermenty / pod red. A.I. Oparina. M.: Mir, 1966. Kol-vo str.
8. Serjakova A.V. Issledovanie jekstrakcii niz-komolekuljarnyh komponentov membrannyh modulej: sb. nauch. tr. SWorld Vypusk 3(40). Tom 1. Ivanovo: Nauch-nyj mir, 2015. S. 70-72.
9. Belen'kijN.G.,Polonskaja L.B.,Chamin N.N. No-voe v proizvodstve fermentov i fermentnyh preparatov iz zhivotnogo syr'ja. Malojaroslavec, 1966. 104 s.
10. Dmitrenko L.V., Glazova N.V., Rudometova N. V. [i dr.], Sposob poluchenija gidroliticheskih fermentov: pat. 2021372 Ros. Federacija.. № 4942523/13; zajavl. 30.04.1991; opubl. 15.10.1994.
11. Mel'nikov N. V, Nigamov F.N., Alsynbaev M.M. Sposob poluchenija peptidov, obiadajushhih antigonado-tropnym dejstviem: pat. 2136296 Ros. Federacija.. № 97120213/14; zajavl. 04.12.1997; opubl. 10.09.1999.
12. Antipov S.T., Ovsjannikov VJu. Issledovanie ohlazhdenija jekstraktov podzheludochnoj zhelezy, peche-ni i zhelchi // Vestnik mezhdunarodnoj akademii holoda. 2002. № 4. S. 36-37.
13. Safonova G.M. Sposob vydelenija natrievoj soli DNK iz tkanej zhivotnogo proishozhdenija: pat. 2302876. Ros. Federacija. № 2005132525/15; zajavl. 21.10.2005; opubl. 20.07.2007. BI № 20. 2007
14. Laemmii K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1972. Vol. 227. № 1. P. 680-685.
