CC BY
110
НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ
© КОВАЛЕВ В.В., ГОРБАЧЕВ В.И. -
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОНИТОРИНГА ОКСИДА АЗОТА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, ИХ ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ
В.В. Ковалев, В.И. Горбачев
(Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н. проф. A.A. Дзизинский, кафедра анестезиологии и реаниматологии, зав. — д.м.н., проф. В.И. Горбачев)
Резюме. Проведен сравнительный анализ широко известных и применяющихся в настоящее время методов определения уровня оксида азота в организме, а также представлены перспективные и разрабатывающиеся подходы к его мониторингу в биомедицинских исследованиях. Показано, что прямые методы обеспечивают более высокую чувствительность и точность определения, однако отличаются высокой стоимостью и трудоемкостью. В то же время, непрямые методики более доступны в клинической практике и экспериментальных исследованиях, но полученные с их использованием данные менее надежны для интерпретации и не всегда достоверны. Ключевые слова. Оксид азота, мониторинг, биологические объекты.
С идентификации в 1987 году оксида азота (N0) в качестве эндотелиального фактора расслабления сосудов начался интенсивный процесс его изучения в биологических объектах. Оксид азота играет важную био-регуляторную роль в регуляции местного сосудистого тонуса и системный гемодинамических реакций, реализации иммунного ответа, нейротропных эффектов [1,2,8,19]. Оценка состояния системы, осуществляющей контроль уровня оксида азота в организме, необходима для коррекции нарушений, развивающихся в ней при различный патологических состояниях. Для осуществления этих целей требуется точный метод, позволяющий фиксировать небольшие отклонения от фоновой концентрации оксида азота в реальных клинических условиях.
Основные трудности, связанные с изучением и определением оксида азота — это малая величина времени его полужизни в физиологических условиях (~ 6 с) и высокая биологическая и химическая активность. Вследствие этого, большинство методов, направленных на определение уровня оксида азота, являются косвенными и основаны на регистрации продуктов окисления, выделяемых в биологических системах, ферментов - «маркеров», либо вызытаемых им физиологических эффектов [1,6,14,20].
В настоящее время в биомедицинских исследованиях разработаны и применяются следующие методы, позволяющие оценить функциональный статус нитро-ксидергической системы:
1. Определение ближайших стабильных метаболитов N0 — нитрита и нитрата в различных биологических жидкостях организма — кровь, моча, слюна (В.Б. Карпюк и соавт, 2000; П.П. Голиков и соавт., 2000 и др.), является одной из наиболее популярный методик, но главный ее недостаток - это отсутствие доказанной прямой коррелятивной связи между содержанием оксида азота и его метаболитов в организме. Низкую точность и большую ошибку определения может обусловливать возможность восстановления экзогенных нитратов, что имеет место при терапии нитросодержащими препаратами, либо при поступлении нитратов с пищей. Кроме того, не весь оксид азота, синтезируемый в организме,
окисляется до нитритов и нитратов, часть его связывается редуцированным гемоглобином с образованием метгемоглобина, а остальное количество реагирует с молекулами активного кислорода с образованием пе-роксинитрита, нитрогендиоксида, гидроксильного радикала и других производных. Также эта методика не позволяет оценить уровень оксида азота в режиме реального времени, т.к. содержание метаболитов является скорее результирующим показателем, нежели отражает мгновенное содержание NO в организме. Главными достоинствами являются относительная простота и дешевизна метода, отсутствие потребности в дорогостоящей аппаратуре. Чаще всего используют фотоэлек-троколориметрические методы, основанные на окрашивании нитрита в присутствии реактива Грисса, а уровень нитрита определяют по калибровочной кривой [4,6,9,20]. При определении нитрата, являющегося одним из конечных метаболитов оксида азота в организме, производят окисление нитритов в присутствии ионов кадмия.
2. Изучение различных изоформ NO-синтаз (конститутивных и индуцибельных) в качестве ферментов, осуществляющих биосинтез оксида азота в организме (В.П. Реутов, 2000 и др.). Иммуногистохимический метод достаточно точен и удобен, однако не позволяет проводить измерение in vivo, поскольку требует исследования гистологических препаратов (срезы органов и тканей), поэтому чаще используется в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных [3,5,8,12,14,15,21,22,23].
3. Определение НАДФН-диафоразы, которая может служить маркером для конститутивных NO-синтаз (эн-дотелиальной и нейрональной) — гистохимический тет-разолиевый метод (M.Kelm, 1991; A.Loesh, 1993; А.В.Сахарова, 2000). Имеет метод недостатки, присущие предыдущему , кроме этого он не является достаточно селективным по отношению к оксиду азота [10]. Наиболее широко применяется в экспериментальных исследованиях, посвященных изучению нейротропных эффектов оксида азота (протекторное и токсическое действие в мозговой ткани).
4. Выявление депо оксида азота гистохимическим окрашиванием по двухвалентному железу, основанное на образовании в организме динигрозильных комплексов железа ^^.Нйпеу, 1992 и др.). Метод также требует изучения срезов органов и тканей, и, следовательно, не применим в клинической практике [7].
5. Метод фоторелаксации, основанный на разрушении депо N0 введением ^ацетилцистеина или диэтил-тиокарбамата с образованием вазоактивных продуктов; при этом объем депо оценивают по степени расслабления сосуда (А.Ф.Ванин, 1999; В.Ми11ег, 1996). Применяется в экспериментальных исследованиях для изучения регулирующего влияния оксида азота на местный кровоток и сосудистый тонус.
6. Определение уровня метгемоглобина (№-N0), являющегося продуктом взаимодействия оксида азота с восстановленным железом гема, основано на физико-химических свойствах оксида азота, имеющего сродство к гемоглобину, в 20 раз превышающее таковое для кислорода. Имеет большую ошибку, низкую чувствительность, невысокую селективность, требовательно к условиям забора и транспортировки пробы крови. Кроме этого, метгемоглобин может определяться в крови пациентов при ряде патологических состояний (острые отравления, терапия метгемоглобинобразующими препаратами и др.).
7. Метод стимулирования гуанилатциклазы, основанный на биорегуляторном влиянии оксида азота на активность этого фермента, предполагает изучение вызываемых им физиологических эффектов [11]. Сложен в воспроизводстве и неоднозначен в интерпретации результатов, поскольку до настоящего времени до конца не изучен комплекс механизмов регуляции сложных внутриклеточных реакций.
8. Антиагрегационный метод, в основе которого лежит способность оксида азота тормозить агрегацию тромбоцитов и влиять на гемокоагуляционный потенциал. Его применение в клинической практике практически не осуществимо, а также ограничено в экспериментальных работах. Как известно, помимо оксида азота, достаточно большое количество различных метаболитов, низко- и крупномолекулярных соединений, гормонов способно оказывать аналогичное воздействие, что резко снижает селективность определения.
9. Измерение концентрации L-цитруллина, образующегося в результате биосинтеза N0, в ряде исследований используется для оценки продукции оксида азота в организме, однако не является достаточно точным и достоверным, в связи с чем не получило широкого распространения.
10. Хемилюминесцентный метод считается одним из наиболее чувствительных и позволяет вести измерения в режиме реального времени (И.Ю. Малышев, 1999). При этом проводят спектрофотометрическое определение содержания нитритов в конденсате выдыхаемого воздуха. Перспективен при ингаляционной терапии экзогенным оксидом азота, позволяя проводить его мониторинг во вдыхаемой и выдыхаемой смеси при лечении синдрома легочной гипертензии в кардиохирургии и интенсивной терапии синдрома острого повреждения легких. Недостатком, как и для всех вышеперечисленных методов, является косвенное определение оксида азота, основанное на регистрации его метаболитов.
11. «Золотым стандартом», на который ориентируются большинство исследователей, в настоящее время является разработанный А.Ф. Ваниным (1984) прямой количественный метод, позволяющий оценивать скорость генерации оксида азота по включению последнего в комплексы с двухвалентным железом и диэтилтио-карбаматом. Вводимый в организм в диамагнитной форме динитрозильный комплекс железа под действием оксида азота в организме превращается в парамагнитную форму, что позволяет использовать для его детекции метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). К недостаткам данного метода относятся техническая сложность методики; дороговизна используемой аппаратуры, а также необходимость введения в организм экзогенных субстратов (Na-ДЭТК, раствор цитрата железа), что исключает возможность его использования в клинической практике. Главным недостатком является воспроизводимость указанной методики только в экспериментах на лабораторных животных, поскольку она предполагает ЭПР-анализ образцов, взятых из замороженных в жидком азоте органов и тканей. Тем не менее, метод электронного парамагнитного резонанса в силу высокой точности и надежности является одним из наиболее достоверных в биомедицинских исследованиях [1,2].
Часть отмеченных трудностей позволяет преодолеть запатентованный в 1999 году усовершенствованный вариант метода, согласно которому комплекс двухвалентного железа, способный связывать NO, помещается в пакет из полупроницаемой полимерной мембраны, например, из полидиалкилсилоксана (силиконовая резина). Этот зонд доставляется в организм пациента (либо хирургическим путем, либо под язык) и выдерживается там определенное время, необходимое для проникновения оксида азота через мембрану и образования адекватного количества нитрозильного комплекса железа. Затем зонд извлекается и производится определение ex vivo содержания оксида азота методом ЭПР-анализа. К сожалению, подобные исследования доступны лишь в крупных научно-исследовательских институтах, оснащённых дорогостоящей аппаратурой.
12. Квантовые (лазерные) методики, основанные на регистрации спектра, вызванного облучением исследуемого объекта волнами определенной длины и частоты, несомненно, заслуживают большого внимания, но в литературных источниках нет указаний на их успешное применение в биологических объектах. В настоящее время они находятся в стадии экспериментальной разработки.
13. Рост интереса к определению уровня оксида азота непосредственно в биологических системах (in vivo) требует чувствительного и селективного метода для измерения его малых концентраций. С учетом этих позиций, электрохимический метод является одним из наиболее перспективных среди аналитических подходов к мониторингу уровня оксида азота, а использование сенсорных электродов позволяет вести подобные измерения [13,16,17].
Известны несколько работ, нацеленных на создание электрохимических датчиков, пригодных для прямого определения содержания оксида азота в биологических объектах. Так, в работе K.Shibuki (1990) сообщено о создании датчика, основанного на миниатюрном элект-
роде Кларка, в котором платиновый рабочий электрод и серебряный электрод сравнения помещены внутри микропипетки, заполненной электролитом. Открыпый конец пипетки запечатан тонкой мембраной из хлороп-ренового каучука, допускающей проникновение газов (в том числе NO) к рабочему электроду, одновременно исключая доступ других веществ. Исполызование такого датчика позволило получиты данные о синтезе оксида азота в срезе ткани мозжечка крысы. Имеются, однако, некоторые существенные недостатки в этом проекте, среди которых трудносты подготовки и недолго-вечносты датчика являются наиболее существенными.
В 1997 г. быт запатентован сенсор на оксид азота, в котором аналитическим сигналом служит ток окисления NO на рабочем электроде из углеродных материалов, модифицированный электрополимеризацией на поверхности пленки тетракис(3-метокси-4-гидрокси-фенил)-порфирина никеля и затем покрытых слоем Nafion® (T.Malinski, 1997). Быти предприняты попытки продемонстрироваты возможносты исполызования таких датчиков для определения NO в биологических системах, однако чувствителыносты сенсорного электрода быта недостаточно высокой [18]. Так, концентрация NO, соответствующая нормалыному физиологическому уровню, быта ниже предела обнаружения. Выще-ление NO удавалосы обнаружиты толыко при добавлении в систему вещества, стимулирующего его синтез.
Электрохимические датчики для определения оксида азота постоянно совершенствуются. Важными задачами являются повышение чувствителыности, селективности и стабилыности сенсорных электродов, а также их миниатюризация. В последние годы появилисы коммерческие продукты, представляющие собой электрохимические сенсоры на NO в сочетании с приборным и программным обеспечением. Например, фирма World Precision Instruments (WPI) предлагает линейку сенсоров на NO, обеспечивающих предел обнаружения 0.30.5 nM NO. Следует отметиты, однако, что столы низкие пределы обнаружения быти достигнуты при исследовании характеристик датчиков в моделыных системах — фосфатных буферных растворах. В имеющейся литературе пока отсутствуют данные о резулытатах применения этих коммерческих продуктов в реалыных биологических системах.
Физико-химические свойства NO позволяют проводить его окисление при потенциалах, близких к +0.80 В (Ag/AgCl) на гладких электродах, однако исполызо-вание катализаторов, модифицирующих их поверх-носты, позволяет улучшиты как чувствителыносты, так и стабилыносты сенсоров [16,17,24]. Существенным требованием к амперометрическому датчику является покрытие поверхности электрода тонким слоем модификатора, который позволяет ионный транспорт, чтобы обеспечиты электропроводимосты. Это условие делает необходимым исполызование для модификации ионо-обменников или композитных материалов, где, по крайней мере, один из компонентов ионный. Также необходимо, чтобы модифицирующие агенты быти водо-нерастворимы. Нитрит, аскорбат и другие (обыино анионные) вещества, содержащиеся в биологических средах, могут серыезно мешаты количественному определению. Влияние нитрита наиболее серыезно, так как он
не только окисляется при потенциалах, близких к та-ковыш для оксида азота, но и, кроме того, является одним из преобладающих продуктов его окисления. Ас-корбат, с другой стороны, окисляется при значительно менее положительных потенциалах и, таким образом, обусловливает высокий фоновыш ток. Кроме того, адсорбция белков, содержащихся в биологических жидкостях в значительном количестве, может также представлять трудности, блокируя поверхность электрода. Учитывая, что большинство веществ, мешающих определению оксида азота, являются анионами или отрицательно заряжены при физиологическом рН, использование анионных модификаторов представляется желательным и оптимальным. Нанесение на электродную поверхность нафионовой мембраны предотвращает побочные процессы окисления нитритов, которые затрудняют определение оксида азота.
В сравнении с перечисленными прямыши и непря-мыши методами определения оксида азота в биологических системах, электрохимический мониторинг имеет существенные преимущества. Основанный на окислении оксида азота на электроде под воздействием электрохимических процессов, он является прямым, не зависит от присутствия посторонних субстратов и не предполагает введения в организм каких-либо веществ и соединений, способных оказать отрицательное влияние на метаболические процессы. Имеется возможность проводить определение оксида азота в динамике и исключается этап предварительной подготовки образцов органов и тканей (введение экзогенных субстратов, взятие образцов, их заморозка). Эти обстоятельства, а также относительная доступность оборудования, делают электрохимический метод одним из наиболее перспективных для оценки продукции оксида азота в организме. Важной задачей является повышение чувствительности и селективности сенсорных электродов, а также остается актуальной проблема их стабильности в биологических системах.
Таким образом, большое количество разнообразных методов мониторинга оксида азота, применяемых в настоящее время в биомедицинских исследованиях, свидетельствует об отсутствии простого, точного и доступного метода, позволяющего проводить подобные измерения. Одни из них позволяют достичь высокой степени надежности и воспроизводимости, однако отличаются технической сложностью и дороговизной. Другие относительно просты и доступны, но точность определения далека от желаемой для подобного рода исследований. Большинство из разработанных методов по своей сути являются косвенными, прямые же либо получили сугубо экспериментальное применение, либо отличаются технической сложностью и требуют дорогостоящей аппаратуры и высококвалифицированного персонала. Применение относительно простого, но достаточно чувствительного электрохимического метода может оказаться весьма перспективным в экспериментальных и клинических исследованиях. Это может способствовать расширению представлений о роли оксида азота в патогенезе заболеваний различных органов и систем организма, в первую очередь кровообращения, центральной нервной системы, а также многих критических состояний в интенсивной терапии и реаниматологии.
THE CONTEMPORARY METHODS OF MONITORING NITRIC OXIDE IN BIOLOGICAL OBJECTS, THEIR ADVANTAGES AND SHORTCOMINGS
V.V. Kovalev, V.I. Gorbachov (Irkutsk State Institute for Medical Advanced Studies)
There has been conducted the comparative analysis of the methods of defining the level of nitric oxide which are widely known and applied at present, as well as the perspective and developed approaches to its monitoring in bio-medical investigations have been presented. It has been shown that the direct methods provide higher sensitivity and accuracy of definition, but are distinguished by high cost and labour-intensity. At the same time the indirect methods are more accurate in clinical practice and experimental investigations, but the data, obtained with their use, are less reliable for interpretation and are not always reliable.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ванин А. Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях. // Вестн. Росс. академии медицинских наук. — 2000. - № 4. - С.3-5.
2. Ванин А. Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы. // Биохимия. — 1998. — Т. 63, №№ 7. - С. 867-869.
3. Гервазиев Ю.В., Соколов Н.Н. Механизмы регуляции активности синтазы окиси азота. // Вопросы медицинской химии. — 1999. — Т. 45, №№ 3. — С.187-199.
4. Голиков П.П., Картавенко В.И., Николаева Н.Ю. и др. Состояние вазоактивных факторов у больных с тяжелой сочетанной травмой. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. — 1998. — J№ 3. — С.20-22.
5. Зенков Н.К., Меньшиков Е.Б., Реутов В.П. NO-синтазы в норме и при патологии различного генеза. // Вестн. Росс. академии медицинских наук. — 2000. — № 4. — С.30-34.
6. Карпюк В.Б., Черняк Ю. С., Шубич М.Г. Лабораторный мониторинг состояния нитроксидергической вазоре-лаксации при субарахноидальном кровоизлиянии. // Клинич. лабор. диагностика. — 2000. — J№ 5. — С.16-18.
7. Лобышева И.И., Сереженков В.А., Ванин А. Ф. Взаимодействие динитрозильных тиолсодержащих комплексов железа с пероксинитритом и перекисью водорода in vitro. // Биохимия. — 1999. — Т. 64, J№ 2. — С.194-200.
8. Меньщикова Е.Б., Зенков НК, Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях. // Биохимия. — 2000. — Т. 65, J№ 4. — С.485-503.
9. Реутов В.П. Биохимическое предопределение NO-син-тазной и нитритредуктазной компонент цикла оксида азота. // Биохимия. — 1999. — Т. 64, J№ 5. — С.634-651.
10. Сахарова А.В., Ложникова С.М. Ультраструктурная локализация NO-синтазной NADPH-диафоразы в периферическом нерве и ее изменение при дифтерийной полинейропатии. // Вестн. Росс. академии медицинских наук. — 2000. — JJ 4. — С.44-48.
11. Северина И. С. Растворимая гуанилатциклаза в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота. // Биохимия. — 1998. — Т. 63., JJ 7. — С.939-947.
12. Bredt D.S., Hwang P.M., Glatt C.E. et al. Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles
cytochrome P-450 reductase. // Nature. — 1991. — Vol.351.
- P.714-718.
13. Espadas-Torre C. Thromboresistant chemical sensors using combined nitric oxide release/ion sensing polymeric films. // J. Am. Chem. Soc. - 1997. - Vol. 119. - P.2321-2322.
14. Forstermann U., Closs E.I., Pollock J.S. et.al. Nitric oxide synthase isozymes, characterization, purification, molecular cloning and function. // Hypertension. - 1994. - Vol. 23. - P.1121-1131.
15. Furakawa K., Harrison D. G., Saleh D. et al. Expression of nitric-oxide syntase Hyman nasal-mucjsa. // Amer. J. Respirat. Crit. Care Med. - 1996. - Vol. 153, № 2. - P.847-850.
16. KashevskiiA.V., SafronovA.Y., Ikeda O. Behaviors of H2TTP and CoTPPCl in Nafion film and the catalytic activity for nitric oxide oxidation. // J. of Electroanalytical Chemistry.
- 2001. - Vol. 510. - P.86-95.
17. Lantoine F., Trevin S., Bedioui F., Devynck J. Selective and sensitive electrochemical measurement of nitric oxide in aqueous solution: discussion and new results. // J. of Electroanalytical Chemistry. - 1995. - Vol. 392. - P.85-89.
18. Malinski T, Radomski M. W., Taha Z., Moncada S. Direct electrochemical measurement of nitric oxide released from human platelets. // Biochemical and biophysical research commumications. - 1993. - Vol. 194, №№ 2. - P.960-965.
19. Moncada S/, Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. // Pharmacol. Rev. - 1991. - Vol. 43. - P.109-142.
20. Nakaki T. Physiological and clinical significance of NO (nitric oxide) - a review. // Keio J. Med. - 1994. - Vol. 43. -P.15-26.
21. Nathan C., Xie Q. Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls. // Cell. - 1994. - Vol. 79. - P.915-918.
22. Walter R., SchufnerA., Schoedon G. Differential regulation of constitutive and inducible Nitric-oxide by inflammatory stimul in murine endothelial cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1994. - Vol. 202, №№ 1. - P.450-455.
23. Wang Y, Marsden P.A. Nitric oxide synthases: biochemical and molecular regulation. // Curr. Opin. Nephrol. Hyper-tens. - 1995. - Vol. 4. - P. 12-22.
24. ZhangX., Cardosa L., Broderick M. et. al. An integrated Nitric Oxide Sensor Based on Carbon Fiber Coated with Selective Membranes. // Electroanalysis. - 2000. - Vol. 12, № 14. - P.1113-1117.
