CC BY
63
Экспрессия ¡N08 и биосинтез метаболитов оксида азота при росте опухолей различного гистогенеза
CV
И
ш и
В.П. Дерягина1, Н.И. Рыжова1, Л.В. Кривошеева1, И.С. Голубева2, Л.А. Савлучинская1, Д.А. Хоченков2 о
1 Научно-исследовательский институт канцерогенеза, о
2Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Российский 2
онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 0=
■si
Контакты: Валентина Петровна Дерягина derygina@inbox.ru
и ш
Изучены в динамике образование метаболитов оксида азота (NO): нитритов, нитратов, летучих нитрозаминов, а также экс- Ц прессия фермента — индуцибельной NO-синтазы (iNOS) в экспериментах на мышах c подкожно перевиваемыми, спонтанными и химически индуцированными опухолями. Выявлено повышенное образование нитритов + нитратов в опухолях или их выделение с мочой при росте опухолей независимо от их гистологического типа. Суммарная концентрация нитритов и нитратов в опухолях достигает микромолярных уровней, характерных для нитрозирующего стресса. Способность перитонеальных макрофагов + моноцитов генерировать нитриты подавляется на стадии интенсивного роста карциномы легких Льюиса, что может указывать на снижение цитотоксических свойств иммунных клеток. Показана возможность образования в опухолях карциномы Эрлиха летучих N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина — соединений с выраженными канцерогенными свойствами. С использованием иммуногистохимического метода выявлена положительная экспрессия iNOS в отдельных участках опухолевой ткани карциномы легких на всех контролируемых сроках роста опухолей. Иммуноокрашивание отсутствовало или было слабым в метастазах легких. Это может свидетельствовать о селекционном отборе клеток с низкой активностью iNOS, мигрирующих в легкие.
Ключевые слова: биосинтез, метаболиты оксида азота, нитриты, нитраты, нитрозамины, макрофаги, экспрессия iNOS, перевиваемые опухоли, спонтанные опухоли, химически индуцированные опухоли
DOI: 10.17650/2313-805X-2016-3-3-73—80
iNOS expression and biosynthesis of nitric oxide metabolites in the course of tumor growth of different histogenesis
V.P. Deryagina1, N.I. Ryzhova1, L. V. Krivosheeva1, I.S. Golubeva2, L.A. Savluchinskaya1, D.A. Khochenkov2
Research Institute of Carcinogenesis, 2Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Cancer, N.N. Blokhin Russian Cancer Reseach Center, Ministry of Health of Russia; ca
24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia
The dynamics of the production of nitric oxide (NO) metabolites: nitrites, nitrates, volatile nitrosamines and iNOS expression was studied in mice with subcutaneous transplanted, spontaneous and chemical- induced tumors. Tumor growth was accompanied by increased production of nitrites + nitrates in tumors or their release with urine that not dependent on tumor histotype. The total concentration of nitrites and nitrates in tumors reached micromolar levels characteristic of nitrosative stress. The ability of peritoneal macrophages + monocytes to generates nitrites was suppressed at the stage of intensive growth of the Lewis lung carcinoma, which may indicate a decrease in the cytotoxic properties of immune cells. The possibility of formation in the Erlich carcinoma of volative N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethyl-amine compounds with pronounced carcinogenic properties was demonstrated. A positive expression of iNOS was revealed in some areas of lung carcinoma at all investigated time points using the immunohistochemical method. The lungs metastases were not stain or weakly stained. This may indicate selection of the cells with a low activity of iNOS migrating in the lungs.
Key words: biosynthesis, nitric oxide metabolites, nitrites, nitrates, N-nitrosamines, macrophages, expression of iNOS, transplanted tumors, spontaneous tumors, chemical-induced tumors
x
Введение
Оксид азота (N0) — универсальный и необходимый регулятор физиологических реакций: иммунных, ней-рональных, сосудистых и др. [1]. За последние десятилетия получены убедительные доказательства участия N0 в патогенезе злокачественных опухолей [2, 3]. Известно, что синтез N0 осуществляется многими типами клеток, в том числе опухолевыми, и основан на ферментативной трансформации гуанидинового фрагмента аминокислоты Ь-аргинина в реакции с кислородом
с участием коферментов NADPH, FAD, FMN, тетра-гидробиоптерина и NO-синтаз (NOS) [4, 5]. Полагают, что многократное повышение образования NO в опухолях является следствием активации одной из изо-форм NOS — индуцибельной NOS (iNOS) под влиянием провоспалительных и антипатогенных факторов: интерферона у, фактора некроза опухоли а, интерлей-кина 1р, бактериального липополисахарида, белков теплового шока и др. [6, 7]. Продолжительная гиперпродукция NO и его метаболитов (нитритов, перокси-
CV
со
ев
и ш u
ж ш
и
нитрита, окислов азота, нитрозаминов) приводит к повреждению ДНК через дезаминирование и нитрование оснований, алкилирование, образование аддуктов, до-зозависимых разрывов, а также посттрансляционной химической модификации ДНК-репарирующих ферментов, способствуя таким образом прогрессии опухолей [8—11]. Данные клинических исследований показывают, что содержание и активность ¡N08 существенно увеличиваются в опухолях различной локализации и гистогенеза и положительно коррелируют со стадией и плохим прогнозом у больных меланомой, при опухолях молочной железы, яичников, головы и шеи и колорек-тальной карциноме [8]. Формирование биологического ответа клеток на действие N0 зависит от его концентрации в клетках и межклеточной среде, а также от времени поддержания этих концентраций [12—14]. В то же время внимание исследователей сосредоточено на изучении реакций N0 с ключевыми реагентами (кислород и его активные формы, углекислый газ и др.) и на биохимических (под влиянием N0) модификациях белков, содержащих гем, тиоловые и тирозиновые остатки, металлы переменной валентности. Однако направление действия N0, изменяющего активность критических сигнальных белков, вовлеченных в канцерогенез, в значительной мере определяется концентрацией соединения [13, 14].
Известно, что N0 в реакции с кислородом, а также свободными радикалами (О2- , • ОН) и металлами переменной валентности окисляется до N02 ^N0 + 02 ^ 2N02), но при увеличении концентрации N0 в среде, происходит быстрое образование других окислов азота - ^03 и ^04 ^02 + N0 ^03; + ^04). ^03 и ^04, 0N00- и нитриты проявляют нитрозирующие свойства (в условиях низких, физиологических и даже повышенных значений уровня рН) в реакциях с аминами и тиолами, что может приводить к образованию ^нитрозаминов и нитрозотиолов [13, 15-17]. Макрофаги, стимулированные липополисаха-ридами и цитокинами, также могут синтезировать ^ни-трозамины [17]. С учетом собственных данных и данных литературы о существенном повышении биосинтеза опухолевой тканью соединений с нитрозирующими свойствами мы предположили возможность образования нитрозосоединений, в том числе канцерогенных ^нитрозаминов в самой опухоли. Таким образом, представляет научный и практический интерес изучение интенсивности биосинтеза соединений с нитро-зирующими свойствами метаболитов N0, экспрессии фермента ¡N08 в опухолях на моделях опухолевого роста, отличающихся метастатическим потенциалом. Задачи исследования:
♦ определить уровни эндогенного образования метаболитов N0 — нитритов, нитратов и нитрозосоединений у мышей на разных моделях опухолевого роста;
♦ изучить в динамике биосинтез нитритов перито-неальными макрофагами у мышей с метастази-рующей карциномой легких Льюиса;
♦ изучить в динамике экспрессию iNOS в опухолевой ткани и метастазах у мышей с карциномой легких Льюиса.
Материалы и методы
Работа проведена на мышах-самцах линий Fj (CBA/LacxC57BL/6) (далее Fp n = 140), Balb/c (n = 60), Fj (C57BL/6xDBA/2) (далее BDF, n = 50) и CBA/Lac (n = 30), полученных из питомника «Столбовая». Всех животных содержали на брикетированном корме при свободном доступе к воде. Штаммы опухоли карциномы Эрлиха и карциномы Льюиса получены из банка РОНЦ им. Н.Н. Блохина (использовали 2-3-и пассажи опухоли in vivo). Опухолевые клетки карциномы Эрлиха (106 клеток на мышь) перевивали подкожно в правую паховую область, а карциномы Льюиса (5 x 106 клеток на мышь) — в правую подмышечную область.
Биосинтез NO определяли по концентрации стабильных продуктов аэробного окисления NO — ионов NO3- и NO2- в опухолях — и по их выделению с мочой у мышей с перевиваемыми опухолями. Известно, что нитриты и нитраты являются конечными метаболитами NO и до 95 % их выводятся с мочой.
Сбор суточной мочи проводили до перевивки опухолей и после нее еженедельно в сроки, приведенные в табл. 1. Для этого мышей помещали по 5 штук в обменные клетки на сутки, лишив корма, при свободном доступе к дистиллированной воде.
Концентрацию нитритов и нитратов (с предвари -тельным восстановлением нитратов до нитритов пористым кадмием) определяли спектрофотометрическим
Таблица 1. Выделение нитритов (NO-) + нитратов (NO-) с мочой в процессе роста карциномы Эрлиха у мышей линии Balb/с (n = 10) и карциномы легких Льюиса у мышей линии Ft (CBA/Lac х C57BL/6)
(n = 10) 1
Сутки роста опухоли Выделение NO2- + NO3-, моль/кг массы тела животного
Карцинома Эрлиха Карцинома легких Льюиса
Контроль (1,10 ± 0,44) x 10-7 (5,60 ± 2,74) x 10-7
3-и (2,44 ± 1,22) x 10-6*
4-е (4,45 ± 3,29) x 10-7*
7-е (2,09 ± 0,23) x 10-6*
10-е (1,34 ± 0,38) x 10-6*
14-е (3,78 ± 1,83) x 10-6*
17-е (3,88 ± 1,41) x 10-6*
21-е (7,25 ± 2,05) x 10-7
24-е (4,10 ± 0,73) x 10-6*
29-е (8,14 ± 2,76) x 10-7
32-е (7,0 ± 3,63) x 10-
* Сравнение с контролем, p < 0,01.
методом с использованием реагента Грисса в опухолях, моче, перитонеальной жидкости [18]. Оптическую плотность окрашенных растворов определяли на спектрофотометре СФ-46. Концентрацию нитритов + нитратов в опухолевой ткани выражали в моль/кг ткани и в моль/кг массы тела животного (м.т.ж.), при расчете учитывали массу опухоли и массу животного на момент контроля. Для выделения опухолей мышей умерщвляли под эфирным наркозом.
Образование нитритов макрофагами и моноцитами определяли по содержанию в перитонеальной жидкости N0^ (моль) в расчете на 106 клеток на 7, 14, 21 и 29-е сутки роста карциномы Льюиса у мышей линии (табл. 2). Резидентные клетки перитонеальной жидкости получали промыванием брюшной полости раствором Хенкса в объеме 2 мл. Количество клеток в пе-ритонеальной жидкости подсчитывали в камере Горяева, клеточный состав определяли по морфологическим критериям в мазках, окрашенных по Романовскому—Гимза.
Таблица 2. Образование нитритов NОперитонеальными клетками (макрофагами + моноцитами) мышей линии ¥1 (СЕЛ/Ьас х С57ЕЬ/6) с перевиваемой карциномой легких Льюиса
Сутки роста опухоли
Количество макрофагов (х 103) в 1 мкл
Количество NO2-на 10б клеток, моль
7-е
14-е
21-е
29-е (n = 6) Здоровые животные
1,32 ± 0,23 1,81 ± 0,09* 1,57 ± 0,09* 2,0 ± 0,26* 1,42 ± 0,09
(1,5 ± 0,9) х 10-7 Не обнаружено (6,0 ± 3,0) х 10-8* (3,5 ± 2,1) х 10-7 (1,8 ± 0,46) х 10-7
Примечание. В группах по 10 животных, кроме указанного значения п. * Сравнение с показателем для здоровых животных, р < 0,01.
Анализ содержания летучих N-нитрозаминов в образцах опухолевой ткани проводили методом, включающим перегонку исследуемых соединений с водяным паром, экстракцию из водного дистиллята дихлорме-таном с последующей очисткой и концентрированием экстракта [19]. Идентификацию и количественное определение N-нитрозаминов осуществляли газохро-матографическим методом с использованием термоэнергетического анализатора ТЕА-800 (Cambridge Scientific, Великобритания) с программным обеспечением для автоматической обработки данных Clarity.
Экспрессию iNOS определяли иммуногистохими-ческим методом в парафиновых микросрезах легких и опухолей, полученных от мышей с карциномой Льюиса [20]. Для выявления iNOS использовали поликлональ-ные кроличьи антитела к iNOS (Santa Cruz Biotechnology, США), для предотвращения неспецифического связывания антител с опухолью применяли блокатор (Invitrogen, США) и дополнительно блокирующий пептид sc-649P (Santa Cruz Biotechnology, США). Препа-
раты изучали под световым микроскопом Вю1аш (Ло-мо, Россия).
Мы применяли комбинированную (количественную и качественную) оценку экспрессии iN0S в опухолевой ткани.
Количественная оценка. При окрашивании участка опухолевой ткани, который составляет менее 25 % общей площади среза, экспрессию iN0S считали отрицательной (0), 25—50 % — умеренной (1+), 50—75 % — сильной (2+), > 75 % — очень сильной (3+).
Качественная оценка. Интенсивность окрашивания опухолевой ткани, метастазов, ткани легких оценивали по следующим критериям: отсутствие окрашивания (0), слабая интенсивность окрашивания более 25 % опухолевой ткани (1+), средняя интенсивность окрашивания более 25 % опухолевой ткани (2+), сильная интенсивность окрашивания более 25 % опухолевой ткани (3+).
Выраженность экспрессии оценивали с учетом суммарного значения количественного и качественного показателей: отсутствие экспрессии считали при суммарном значении, равном 0 или 1, экспрессия была положительной при суммарном значении 2 (+), умеренной — при 3—4 (++), сильной — при 5—6 (+++).
Проверку значимости различий между данными, представленными в таблицах как среднее значение ± выборочное стандартное отклонение, выполняли с применением ^критерия Стьюдента. Гипотезу о наличии связи между показателями проверяли с помощью регрессионного анализа.
Результаты и обсуждение
Результаты определения концентрации нитритов и нитратов показали, что суммарное значение метаболитов в опухолях с ростом карциномы Эрлиха увеличивалось особенно интенсивно на 3-й неделе, достигая уровня (7,80 ± 2,57) х 10-5 моль/кг опухоли, что в 10,7 раза (р < 0,01) выше аналогичного показателя, зарегистрированного на 7-е сутки (табл. 3). На терминальной стадии роста карциномы Эрлиха (28-е сутки) отмечали существенное снижение концентрации нитритов + нитратов в опухолевой ткани. При определении концентрации нитритов + нитратов, рассчитанной на кг м.т.ж., максимальное увеличение (в 39,9 раза (р < 0,01)) зарегистрировано на 3-й неделе роста опухоли по сравнению с показателем, отмеченным на 7-е сутки у мышей с карциномой Эрлиха (см. табл. 3). Оценка суммарного биосинтеза метаболитов N0 по экскреции с мочой выявила увеличение их выделения в процессе роста карциномы Эрлиха у мышей линии Ва1Ь/с (см. табл. 1). Так, выделение нитритов + нитратов на 24-е сутки возросло в 37,3 раза (р < 0,01) по сравнению с показателем здоровых мышей ((1,1 ± 0,44) х 10-7 моль/кг м.т.ж.) Средний объем опухоли за этот период увеличился в 44,7 ± 10,6 раза. Прослеживается положительная связь между объемом карциномы Эрлиха и уровнем суточного выделения нитритов + нитратов с мочой (коэффициент детерминации 0,99). Следует отметить, что
CV
CS
и ш u
X ш
и
см со
ев
Таблица 3. Концентрация нитритов NО-) + нитратов (М03-) в опухолях карциномы Эрлиха и карциномы легких Льюиса в разные сроки их роста у мышей линии ¥1 (СЕЛ/Ьас х С57ЕЬ/6) (п = 10)
Сутки роста опухоли Карцинома Эрлиха Карцинома легких Льюиса
Масса опухоли, г Концентрация N0^ + *0з-, моль/кг опухоли Концентрация N0^ + N0^, моль/кг массы тела животного Масса опухоли, г Концентрация N0^ + N0^, моль/кг опухоли Концентрация N0^ + N0^, моль/кг массы тела животного
«я ш и
7 е 0,912 ± 0,30 (7,30 ± 3,49) х 10-6 (1,66 ± 0,79) х 10-7 0,240 ± 0,11 (3,60 ± 0,46) х 10-5 (2,88 ± 0,37) х 10-7
ОС 14-е 4 1,695 ± 0,28 (1,73 ± 0,76) х 10-5** (7,33 ± 3,22) х 10-7** 1,742 ± 0,61 (1,96 ± 0,54) х 10-5** (1,14 ± 0,31) х 10-6**
21 и 3,395 ± 0,68 (7,80 ± 2,57) х 10-5** (6,63 ± 2,18) х 10-6** 4,910 ± 1,75 (1,09 ± 0,29) х 10-5** (1,78 ± 0,47) х 10-6**
ш 28-е 5,42 ± 1,63 (2,05 ± 1,44) х 10-5* (2,78 ± 1,95) х 10-6** - - -
Е 29-е - - - 8,292 ± 1,66 (6,92 ± 3,92) х 10-6** (4,87 ± 2,76) х 10-7*
* р < 0,05. ** Сравнение с соответствующим показателем на 7-е сутки роста опухолей, р < 0,01.
X ш
и
нитраты являлись основной окисленной формой N0, обнаруживаемой как в опухолевой ткани, так и в моче.
Изменение концентраций нитритов + нитратов в процессе роста метастазирующей карциномы Льюиса у мышей линии имело свои особенности (см. табл. 3). Максимальная суммарная концентрация нитритов и нитратов в опухолевой ткани карциномы Льюиса, зарегистрированная на 7-е сутки, составила (3,60 ± 0,46) х 10-5 моль/кг опухоли, в дальнейшем она снижалась. В то же время при расчете концентрации нитритов и нитратов, выраженной в моль/кг м.т.ж., этот показатель достигал максимального значения на 21-е сутки и в 6,2 раза превышал показатель, определяемый на 7-е сутки. Следует отметить, что расчет концентрации нитритов + нитратов на кг м.т.ж. позволяет учитывать влияние увеличения массы опухоли, продуцирующей N0. Определение биосинтеза метаболитов N0 по экскреции с мочой выявило достоверный рост их выделения в 6,75 раза в контрольный срок 14-х суток у мышей линии с карциномой Льюиса (см. табл. 1).
В экспериментах на мышах-самцах линии СВД/Ьае, предрасположенных к образованию гепатом, повышенную ((3,73 ± 1,87) х 10-5 моль/кг м.т.ж.) экскрецию нитритов + нитратов с мочой обнаружили у 8-месячных мышей (период появления первых спонтанных опухолей). У 20-месячных мышей (91 % животных с опухолями) регистрировали снижение выделения не только по сравнению с 8-месячными, но и с 3-месячными мышами в 4,6 и 2,1 раза соответственно.
В опытах на мышах-самцах линии с индуцированными бенз(а)пиреном (в сумме 144 мкг на мышь) опухолями различной локализации в возрасте 22 и 25 мес регистрировали достоверное увеличение экскреции нитритов + нитратов в 10 и 17 раз соответственно. Следует отметить, что выделение метаболитов у мышей со спонтанными и индуцированными бенз(а)пиреном опухолями сопоставимо с аналогичным показателем у мышей с перевиваемыми опухолями.
Оценивая используемые подходы анализа эндогенного синтеза нитритов + нитратов, основанные на
определении их концентрации в опухолевой ткани или экскреции с мочой, можно отметить наличие синхронности изменений показателей в первые 3 недели роста карциномы Эрлиха у мышей различных линий (Б1 и Ва1Ь/е). Для карциномы Льюиса такой очевидной согласованности в результатах, полученных разными способами, нет, однако и здесь подтверждается нарушение регуляции биосинтеза N0 при прогрессии опухоли. Необходимо отметить, что показатель биосинтеза, оцениваемый по экскреции метаболитов N0 с мочой, является интегральным и включает также метаболиты N0, образовавшиеся другими типами клеток для поддержания жизненно важных физиологических процессов [1, 5]. Помимо этого, следует указать на возможность депонирования N0 в виде динитрозильных железо-серных комплексов, Б-нитрозотиолов, Б-нитрозогемо-глобина (№^N0), нитрозильных комплексов гемоглобина (№N0) и других комплексов. Кроме того, количество N0, связанное в комплексах и молекулах, может превышать количество N0 в форме нитритов и нитратов [21—23]. Также возможно восстановление нитритов до N0 неэнзиматическим путем в условиях снижения уровня рН в опухолевой ткани, а также с помощью ферментов дыхательной цепи митохондрий, электронно-транспортной цепи эндоплазматического ретикулума и цитохрома Р-450 микросом [24].
Известно, что N0 — важный медиатор противоопухолевой защиты. Продуцируемый иммунными клетками (макрофагами и нейтрофилами) N0 оказывает цитостатическое и цитотоксическое действия на опухолевые клетки различного гистогенеза и тумороген-ности [25].
Результаты определения активности резидентных перитонеальных макрофагов + моноцитов по образованию ими N0^ (моль на 106 клеток) показали существенное снижение концентрации N0^ в пери-тонеальной жидкости мышей с карциномой Льюиса на 14-е и 21-е сутки роста опухоли. В эти сроки концентрация N0^ в перитонеальной жидкости либо не определялась, либо имела очень малые значения
(см. табл. 1). Можно полагать, что уменьшение продукции NO макрофагами может привести к снижению их цитотоксических свойств.
К настоящему времени выявлены органы (носоглотка, ротовая полость, желудок, пораженная гельминтами печень, инфицированный желчный пузырь, кишечник, инфицированный мочевой пузырь и инфицированное влагалище), в которых при определенных условиях возможно образование канцерогенных N-нитрозосоединений. В результате паразитарной или бактериальной инфекции, развития воспалительных процессов и возникновения активных форм азота (АФА), проявляющих нитрозирующую активность, возможно образование N-нитрозаминов и нитрозотиолов в условиях низких, физиологических и даже повышенных значений рН [26].
Газохроматографический анализ опухолей карциномы Эрлиха (рис. 1), выделенных у мышей-самцов (n = 24) линий Fj и BDF на 14, 21, 28 и 35-е сутки выявил следующие соединения: N-нитрозодиметиламин (НДМА) и N-нитрозодиэтиламин (НДЭА). Отмечается выраженная вариабельность концентраций нитро-заминов в опухолях мышей линии F1, которая изменялась от 0,029 до 0,546 мкг/100 г ткани для НДМА, от 0,14 до 0,49 мкг/100 г ткани для НДЭА. На позднем сроке роста карциномы Эрлиха средняя концентрация НДМА в опухолях мышей линии BDF составила 0,165 ± 0,148 мкг/100 г, а НДЭА - 0,48 ± 0,46 мкг/100 г. В контрольных образцах мышечной ткани, полученной от мышей, нитрозамины не обнаружены (рис. 2).
Есть основания полагать, что увеличение биосинтеза метаболитов NO опухолью происходит, прежде всего, за счет активации iNOS, однако нельзя исключить участия других изоформ NOS, особенно эндоте-лиальной [27].
Иммуногистохимическое определение экспрессии iNOS в микросрезах опухолевой ткани карциномы Льюиса (рис. 3) показало, что фермент выявлялся в основном на участках, расположенных ближе к периферии опухоли и в клетках стромы на всех контролируемых сроках. При этом интенсивность иммуно-окрашивания несколько уменьшалась на 2-й неделе, однако на терминальной стадии количество клеток, экспрессирующих фермент, увеличивалось, при этом окрашивание было менее выраженным. В целом экспрессию фермента в опухолевой ткани можно оценить как положительную (табл. 4).
В опухолевых клетках, метастазирующих в легкие (см. рис. 3), иммуноокрашивание отсутствовало, что может свидетельствовать о селекционном отборе мигрирующих в легкие опухолевых клеток с низкой активностью iNOS.
Таким образом, полученные данные отражают воз -можность образования метаболитов NO в опухолях различного гистогенеза. Суммарная среднеарифметическая концентрация NO2- + NO3- в опухолевой ткани карциномы Эрлиха изменялась в интервале от 3,5
180 -
160 -
ш s
| 140 -
ос СР П.
та
Х 120 -
100 -
V
4 6
Время, мин
10
Рис. 1. Результаты анализа на содержание И-нитрозаминов в опухолях у мышей линии ¥ 1 (СБЛ/Ьас х С57БЬ/6) с карциномой Эрлиха (14-е сутки)
150 -
145 -
140 -В м
<и 135 -и н е
* 130 -
я р
го 125 -х
120 -115 -
4 6
Время, мин
Рис. 2. Результаты анализа на содержание И-нитрозаминов в мышечной ткани мышей линии ¥1 (С57ЕЬ/6 х ВЕЛ/2 с карциномой Эрлиха (контроль)
до 37,0 мкмоль (в эквиваленте N0), а в ткани карциномы Льюиса — от 3,3 до 17,0 мкмоль. С учетом неравномерной экспрессии iN0S в карциноме Льюиса можно полагать, что на отдельных участках локальная концентрация N0 для этого типа опухоли может увеличиваться в 2—3 раза.
Как показали исследования на культуре опухолевых клеток молочной железы (МБА-МВ-231 и МСБ-7), низкие уровни концентрации N0 (нмоль/л) увеличивают пролиферацию клеток через РВК/рЛЙ и Яа^ МЕК/ЕЯК 1/2 сигнальные каскады [14].
Активность ряда важных для канцерогенеза белков (ШБ-1а, р53, ЕЯК) находили в зависимости от уровня концентрации N0 в микроокружении опухолевых клеток МСБ-7. При низких уровнях концентраций N0 (< 50 нмоль) фосфорилируются ЕЯК посредством гу-анилатциклазозависимого механизма. Аккумуляцию ШБ-1а наблюдали при средних уровнях концентрации
CV
ев
и ш u
X ш
и
0
2
8
см со
ев
и ш и
ж ш
и
Рис. 3. Иммуногистохимическое выявление ¡N03 в микросрезах легких и опухолевой ткани карциномы легких Льюиса в разные сроки ее роста (х400, докрашивание гематоксилином): а — иммуногистохимическое выявление ¡N03в опухолевой ткани без обработки антителами к ферменту, реакция отсутствует (7-е сутки); б — коричневое окрашивание свидетельствует о наличии ¡N03 в опухолевой ткани на 7-е сутки ее роста; в — иммуногистохимическое определение ¡N03 без обработки антителами к ферменту, низкая интенсивность окрашивания; г — положительная реакция умеренной интенсивности в микросрезах опухолевой ткани (21-е сутки); д, е — низкая интенсивность окрашивания метастазов опухоли в легкие (21-е сутки)
N0 (> 1,0 х 10-7 моль), в то время как фосфорилиро-вание серина р53-Р-(Бег-15) имело место при значительно более высоких уровнях (> 3,0 х 10-7 моль). Исследователи считают, что при достижении концентрации N0 в тканях > 1 мкмоль создаются условия, классифицируемые как нитрозирующий стресс [12, 28]. При этом скорость реакций N0 с 02 увеличивается, что приводит к образованию более реакционных окислов азота с вы-
Таблица 4. Экспрессия ¡N03 при росте карциномы легких Льюиса у мышей линии ¥1 (СЕЛ/Ьас х С57ЕЬ/6)
Сутки роста Опухолевая Строма Легкие Метастазы
опухоли ткань в легких
7-е ++ ++ ++ -
14-е + + + 0
21-е + + + 0
28-е + + 0 +
Примечание. «0» — отсутствие экспрессии;«+» — положительная экспрессия;«++» — умеренная экспрессия;« — » — экспрессию не определяли.
раженными нитрозирующими свойствами. Показано, что при концентрациях N0 > 1 мкмоль нитрозировались критические белки, такие как РАЕР и каспазы [13].
Следовательно, в нашем случае при росте карциномы Льюиса на участках опухоли с выраженной экспрессией iN0S концентрация АФА иногда достигает уровней, характерных для нитрозирующего стресса. В этих условиях АФА могут инициировать апоптоз, повреждать ДНК, ингибировать митохондриальное дыхание, а также вызывать химическую модификацию белков, оказывая разнонаправленное действие на развитие опухоли.
N0 проявляет себя как про-, так и антиметастатическое соединение, действие которого осуществляется через регуляцию сигнальных путей еОМР, СОХ-2, и оказывает влияние на активность матричных металло-протеиназ, интегринов в зависимости от экспозиции N0, типа клеток и т. д. [29]. Если принимать во внимание данные других авторов, можно прийти к заключению, что повышение уровня N0 в первичной опухоли способствует ее прогрессии и метастазированию. Но в процессе диссеминации опухоли экспрессия iN0S в метастазирующих клетках большей частью по-
давлена [29]. Не противоречат этому выводу и данные исследования, выполненного ранее в Институте канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Авторы обнаружили, что низкотуморогенные и неметастазирующие клоны трансформированных эмбриональных клеток хомяка (STME) продуцировали значительное количество NO в ответ на индукцию макрофагами. Клетки со средней и высокой метастазирующей активностью, в отличие от неметастазирующих, демонстрировали низкую секрецию радикала [30]. Полученные в настоящей работе результаты отражают увеличение содержания iNOS в первичной опухоли и низкую экспрессию фермента в метастазах легких мышей с карциномой Льюиса и не расходятся с данными других исследователей [29].
Обнаружение в опухолевой ткани летучих нитро-заминов является еще одним непрямым индикатором образования реактивных форм азота: нитритов, N2O3, ONOO- и других форм, которые в реакции нитрозиро-вания при взаимодействии со вторичными аминами могут образовать канцерогенные нитрозамины. Известно, что N-нитрозамины — сильные мутагены, которые алкилируют ДНК и проявляют высокую бластомоген-ную активность, причем установлено, что ни один вид подопытных животных не оказался резистентным к их действию [17, 26].
Образовавшийся в клетках NO имеет короткий полупериод жизни (6—10 с) и действует паракринно, в то время как более стабильные его метаболиты — нитриты и нитраты — в виде ионов циркулируют по всему организму с током крови и могут оказывать модулирующее влияние на многочисленные молекулы-мишени, в том числе на иммунные клетки и эритроциты. Так, в ранее проведенных нами исследованиях in vitro обнаружено снижение на 45,8—65,4 % (р < 0,05) образования активных форм кислорода стимулированными резидентными перитонеальными макрофагами и подавление на 11,2—76,4 % (p < 0,05) способности продуцировать активные формы кислорода аккумулированными перитонеальными нейтрофилами при концентрациях нитритов в среде от 17,3 мкмоль до 2,73 ммоль. В условиях in vivo продолжительное поступление в организм мышей линии Balb/c нитрита натрия с водой в концентрации 500 мг/л оказывало иммуно-супрессивное действие, проявляющееся в угнетении на 49 % лейкопоэза и снижении на 35 % фагоцитар-
ной активности стимулированных нейтрофилов крови у мышей [31].
Повышенная продукция нитритов в опухоли может способствовать образованию продуктов радикальной природы. Известно, что нитриты способны окислять окси-гемоглобин до метгемоглобина с образованием супероксид анион-, нитрозильного и феррилгемоглобин-радикалов, а в условиях гипоксии взаимодействие дезоксигемоглобина (II) с нитритами приводит к образованию NO [32]. Способность нитритов индуцировать in vitro и in vivo образование радикальных соединений была подтверждена в выполненных нами ранее работах [33].
Интерес вызывают исследования, в которых показано, что нитриты оказывают потенцирующее действие на рост перевиваемых опухолей и канцерогенез, индуцированный химическими и биологическими факторами [34].
Приведенные данные указывают на то, что при действии на организм повышенных доз нитритов возможно снижение функциональной активности эффек-торных клеток врожденного иммунитета и дополнительное образование высокореакционных радикальных продуктов, что может неоднозначно влиять на рост опухолей.
Выводы
Рост опухолей различного гистогенеза сопровождается повышением образования в опухолях метаболитов NO — нитратов и нитритов, концентрация которых на отдельных участках опухоли достигает уровней, характерных для нитрозирующего стресса, что может вызвать разнонаправленное действие АФА на рост опухолей.
На стадии интенсивного роста перевиваемой карциномы Льюиса способность перитонеальных макрофагов + моноцитов генерировать нитриты подавляется, что может указывать на снижение их цитотоксических свойств.
Показана возможность образования в опухолях карциномы Эрлиха канцерогенных НДМА и НДЭА, способных повышать частоту мутаций в клетках.
В опухолевых клетках карциномы Льюиса на всех контролируемых сроках ее роста выявлена положительная экспрессия iNOS, в то время как в метастазах в легкие иммуноокрашивание отсутствовало, что может свидетельствовать о селекционном отборе мигрирующих в легкие клеток с низкой активностью iNOS.
CV
es
и ш u
X ш
и
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Ignarro L.J. Nitric oxide, second edition: biology and pathobiology. 2nd edn. Academic Press, 2009.
2. Wink D.A., Vodovotz Y., Laval J. et al. The multifaceted roles of nitric oxide
in cancer. Carcinogenesis 1998;19(5): 711-21.
3. Cheng H., Wang L., Mollica M. et al. Nitric oxide in cancer metastasis. Cancer Lett 2014;353(1):1-7.
4. Hibbs J.B. Jr. Synthesis of nitric oxide from L-arginine: a recently discovered pathway induced by cytokines with antitu-mour and antimicrobial activity. Res Immunol 1991;142(7):565-9.
CV
со
ев
и ш u
ж ш
и
5. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота. М.: Вузовская книга, 2004. 360 с. [Granik V.G., Grigor'ev N.B. Nitrogen oxide. Мoscow: Vuzovskaya kniga, 2004. 360 p.
(In Russ.)].
6. Nathan C., Xie Q.W. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J Biol Chem 1994;269(19):13725-8.
7. Melillo G., Musso T., Sica A. et al. A hypoxia-responsive element mediates
a novel pathway of activation of the inducible nitric oxide synthase promoter. J Exp Med 1995;182(6):1683—93.
8. Mocellin S., Bronte V., Nitti D. Nitric oxide, a double edged sword in cancer biology: searching for therapeutic opportunities. Med Res Rev 2006;27(3):317-52.
9. Xu W., Liu L.Z., Loizidou M. et al. The role of nitric oxide in cancer. Cell Research 2002;12(5-6):311-20.
10. Felley-Bosco E. Role of nitric oxide in genotoxicity: implication for carcinogenesis. Cancer Metastasis Rev 1998;17(1):25-37.
11. Jones L.E. Jr., Ying J.L., Hofseth A.B. et al. Differential effects of reactive nitrogen species on DNA base excision repair initiated by the alkyladenine DNA glycosilase. Carcinogenesis 2009;30(12):2123-9.
12. Thomas D.D., Ridnour L.A., Isenberg J.S. et al. The chemical biology
of nitric oxide. implication in cellular signaling. Free Radic Biol Med 2008;45(1):18-31.
13. Ridnour L.A., Thomas D.D., Mancardi D. et al. The chemistry of nitrosative stress induced by nitric oxide and reactive nitrogen oxide species. Putting perspective on stressful biological situations. Biol Chem 2004;385(1):1-10.
14. Pervin S., Singh R., Hernandez E. et al. Nitric oxide in physiologic concentrations targets the translational machinery to increase the proliferation of human breast cancer cells: involvement of mammalian target of rapamy-cin/elF4E pathway. Cancer Res 2007;67(1):289-99.
15. Недоспасов А. А. Биогенный NO в конкурентных отношениях. Биохимия 1998;63(7б):881-904. [Nedospasov А.А. Biogenous NO in competitive relations. Biokhimiya = Biochemistry 1998;63 (7b):881-904. (In Russ.)].
16. Choudhari Sh.K., Chaudhary M., Bagde S. et al. Nitric oxide and cancer: a review. Word J Oncol 2013;11:118.
17. Preussmann R. Carcirogenic N-nitroso compounds and their environmental significance. Naturwissenschaften 1984;71(1):25-30.
18. Tsikas D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assay based
on the Griess reaction: appraisal of the Griess reaction in the L-arginine/nitric oxide area of research. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2007;851(1-2):51-70.
19. Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Методические указания по методам контроля. МУК 4.4.1.011-93. [Determination of volatile N-nitrosamines
in the food stock and foodstuffs. Меthodology guidelines on control methods. МУК 4.4.1.011-93. (In Russ.)].
20. Vakkala M., Kahlos K., Lakari E. et al. In-ducible nitric oxide synthase expression, apoptosis, and angiogenesis in in situ and invasive breast carcinomas. Clin Cancer Res 2000;6(6):2408-16.
21. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях. Вестник РАМН 2000;(4):3-5. [Vanin AF. Nitrogen oxide in biomedical studies. Vestnik RAMN = RAMS Herald 2000;(4):3-5. (In Russ.)].
22. Gaston B., Reilly J., Drazen J.M. et al. Endogenous nitrogen oxides and bronchodila-tor S-nitrosothiols in human airways. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90(23):10957-61.
23. Осипов А.Н., Борисенко Г. Г., Владимиров Ю.А. Биологическая роль нитро-зильных комплексов гемопротеинов. Успехи биологической химии 2007;47: 259-92. ^sipov А.N., Borisenkо G.G., Vladimirov Yu.А. Biological role of nitrosel hemoproteins' complexes. Uspekhi bio-logicheskoy khimii = Successes of Biological Chemistry 2007;47:259-92. (In Russ.)].
24. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охо-тин В.Е., Косицин Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М.: Наука, 1997. 156 с. [Reutov V.P., Sorokirn Е.G., Оkhotin V. Е., Kositsyn N.S. Cyclic nitrogen oxide transformations in the organism of mammals. Мoscow: Naukа, 1997. 156 p. (In Russ.)].
25. Hibbs J.B. Jr. Synthesis of nitric oxide from L-arginine: a recently discovered pathway induced by cytokines with antitumour and antimicrobial activity. Res Immunol 1991;142(7):565-9.
26. Bartsch H. N-nitroso compounds and human cancer: where do stand? IARC Sci Publ 1991;(105):1-10.
27. Muntane J., la Mata M.D. Nitric oxide and cancer. World J Hepatol 2010;2(9): 337-44.
28. Thomas D.D., Espey M.G., Ridnour L.A. et al. Hypoxic inducible factor 1alpha, extra-
cellular signal-regulated kinase, and p-53 are regulated by distinct threshold concentrations of nitric oxide. Proc Natl Acad Sci 2004;101(24):8894-9.
29. Cheng H., Wang L., Mollica M. et al. Nitric oxide in cancer metastasis. Cancer Lett 2014;353(1):1-7.
30. Burdelya L.G., Grosheva I.A., Dyakova N.A., Deichman G.I. Nonactivated macrophage-induced nitric oxide production by tumor cells differing in tumorogenic and spontaneous metastatic activities. Tumor Biol 1998;19:346-55.
31. Дерягина В.П., Машковцев Ю.В., Ильницкий А. П. Экспериментальное изучение функциональной активности нейтрофилов и макрофагов в условиях воздействия нитрита натрия. Биомедицинская химия 2003;49(1):19-26. [Deryagim V.P., Маshkovtsev Yu.V., Il'nitskiy А. P. Experimental studies
of the functional activity of neutrophils and macrophages, influenced by thes sodium nitrite. Biomeditsinskaya khimiya = Biomedical Chemistry 2003;49 (1):19-26. (In Russ.)].
32. Степуро И.И., Чайковская Н.А., Солодунов А. А., Арцукевич А.Н. Образование NO в процессе окисления ферроформ гемоглобина нитритом. Биохимия 1997;62(9):1122-9. [Stepura I.I., Chaykovskaya N.А., Solodunov А.А., Аrtsukevich А^. NO formation in the process of nitrite oxidation of hemoglobin ferro-forms. Biokhimiya = Biochemistry 1997;62 (9):1122-9. (In Russ.)].
33. Дерягина В.П. Образование свободно-радикальных соединений при действии нитрита натрия на организм животных
и в условиях in vitro. Токсикологический вестник 2003;(6):20-5. [Deryagim V.P. Formation of free radical compounds under the influence of the sodium nitrite on animals' organism and in in vitro conditions. Toksiko-logicheskiy vestnik = Тшаэ^ю Herald 2003;(6):20-5. (In Russ.)].
34. Ильницкий А.П., Реутов В.П., Рыжова Н.И. и др. Модифицирующее действие нитритов на легочный бластомогенез
и вирусный лейкозогенез у мышей: возможная роль окиси и двуокиси азота. Вестник РАМН 2000;(7):11-6. [Il'nitskiy А. P., Reutov V.P., Ryzhovа N.I. et al. Моdifying nitrites' influence on the pulmonary blastomogenesis and viral leucogenesis at mice: possible role of the nitrogen oxide and nitrogen dioxide. Vestnik RAMN = Herald RAMS 2000; (7):11-6. (In Russ.)].
