CC BY
56
Reviews
Обзоры
Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet Инфекция и иммунитет
2019, vol. 9, no. 5-6, pp. 639-647 2019, Т. 9, № 5-6, с. 639-647
СОВРЕМЕННОЕ ПОНИМАНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ МОЛЕКУЛ ТОКСИНОВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И ПОДХОДЫ К БЛОКИРОВАНИЮ ИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
В.В. Фирстова, И.Г. Шемякин, И.А. Дятлов
ФБУНГосударственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Россия
Резюме. В обзорной статье приводятся результаты разносторонних исследований механизмов ингибирования цитотоксического действия сибиреязвенного токсина на клетки иммунной системы. Рассмотрены различные формы заболевания, иммунопатогенез и современные методы лечения сибирской язвы. Описан сибиреязвенный токсин Bacillus anthracis. Детально описана структурно-функциональная организация протективно-го антигена, летального и отечного факторов. Представлен механизм ассоциации протективного антигена и летального фактора, приводящий к образованию летального токсина, а также описан процесс образования комплекса протективный антиген — отечный фактор, формирующего отечный токсин. Рассмотрено участие доменов протективного антигена в процессе взаимодействия с рецепторами на поверхности иммунокомпе-тентных клеток и охарактеризованы особенности связывания протективного антигена с летальным фактором и отечным фактором. Описаны механизмы интернализации комплексов токсинов в эндосому и последующая транлокация эффекторных молекул в цитозоль. Проанализированы направленность действия летального и отечного факторов на структуры эукариотических клеток, механизмы цитотоксичности. На основании описанной последовательности проявления цитотоксической активности токсинами B. anthracis проанализированы подходы к блокированию их действия на различных стадиях токсикоемии. Описаны полученные к настоящему времени химерные и гуманизированные моноклональные антитела, способные нейтрализовать токсины B. anthracis на разных этапах сборки. В частности, рассмотрены препараты, ингибирующие: межрецепторные взаимодействия протективного антигена с рецепторами эукариотической клетки; фуринподобные ферменты, активирующие сборку препоры; олигомеризацию протективного антигена; связывание летального или отечного факторов с протективным антигеном; транслокацию летального или отечного факторов сибирской язвы в цитозоль клетки; транскрипцию протективного антигена с летальным или отечным факторами из эндосом; ферментативную активность летального или отечного факторов. Рассмотрены препараты, утвержденные для профилактики и лечения сибирской язвы в России и за рубежом. Описаны имеющиеся недостатки используемых препаратов и направления по их совершенствованию. В состав перспективных направлений входят инги-бирование ферментативной активности летального фактора, препятствие ассоциации компонентов токсинов, блокирование взаимодействия токсических комплексов с рецепторами клеток иммунной системы.
Ключевые слова: протективный антиген, летальный фактор, отечный фактор, токсин, иммунопатогенез.
Адрес для переписки:
Фирстова Виктория Валерьевна 142279, Россия, Московская область, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии. Тел.: 8 (4967) 36-00-03. Факс: 8 (4967) 36-00-10. E-mail: [email protected]
Contacts:
Victoria V. Firstova
142279, Russian Federation, Moscow Region, Obolensk, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Phone: +7 (4967) 36-00-03. Fax: +7 (4967) 36-00-10. E-mail: [email protected]
Библиографическое описание:
Фирстова В.В., Шемякин И.Г, Дятлов И.А. Современное понимание организации молекул токсинов сибирской язвы и подходы к блокированию их цитотоксического действия // Инфекция и иммунитет. 2019. Т. 9, № 5-6. С. 639-647. Сог 10.15789/2220-76192019-5-6-639-647
© Фирстова В.В., Шемякин И.Г, Дятлов И.А., 2019
Citation:
Firstova V.V., Shemyakin I.G., Dyatlov I.A. Current understanding of Bacillus anthracis toxin molecules organization and approaches for blocking their cytotoxic action // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2019, vol. 9, no. 5-6, pp. 639-647. doi: 10.15789/2220-76192019-5-6-639-647
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-2019-5-6-639-647
CURRENT UNDERSTANDING OF BACILLUS ANTHRACIS TOXIN MOLECULES ORGANIZATION AND APPROACHES FOR BLOCKING THEIR CYTOTOXIC ACTION
Firstova V.V., Shemyakin I.G., Dyatlov I.A.
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russian Federation
Abstract. Here, we review the data on mechanisms inhibiting cytotoxic effect of anthrax toxin on the immune system cells. Various disease forms, immunopathogenesis and contemporary methods for anthrax treatment are discussed. In addition, an anthrax toxin was outlined, whereas structural and functional organization of the protective antigen, lethal and edema factors was detailed. A mechanism for association of a protective antigen and lethal factor, protective antigen and edema factor leading to formation of a lethal toxin and edema toxin, respectively, was described. Participation of protective antigen domains in the process of interaction with surface receptors of imunocompetent cells as well as features of binding a protective antigen with lethal factor and edema factor are discussed. A mechanism of endosomal toxin complex internalization and subsequent transfer of effector molecules to the cytosol are described. Effects of the lethal factor and the edema factor on components of eukaryotic cells as well as cytotoxicity mechanisms are analyzed. The approaches to block anthrax toxin action at various stages of toxicoemia have been analyzed based on previously uncovered sequential signs of cytotoxic activity for Bacillus anthracis toxins. Currently available chimeric and humanized monoclonal antibodies are capable of neutralizing B. anthracis toxins at diverse assembly stages, particularly considering the drugs inhibiting: inter-receptor interaction between protective antigen with eukaryotic cells; furin-like enzymes activating prepore assembly; protective antigen oligomerization; binding of the lethal factor or edema factor to the protective antigen; translocation of the lethal factor or the edema factor into cell cytosol; transport of protective antigen with lethal factor or edema factor from endosomes; enzymatic activity of lethal factor or edematous factor. The anti-toxin agents approved for anthrax prevention and treatment in Russia and worldwide are discussed. The limitations of anti-toxin agents and perspectives for their improvement are also described including inhibition of lethal factor activity, interference with integration of toxin components, blockade of interactions between toxic complexes and immune cell receptors.
Key words: B. anthracis, protective antigen, lethal factor, edema factor, toxin, immunopathogenesis.
Современное понимание организации молекул токсинов сибирской язвы
Сибирская язва — особо опасная инфекция, которая в зависимости от пути проникновения возбудителя развивается в кожной, аэрогенной или гастроэнтеральной формах. У людей наиболее распространенной формой заболевания сибирской язвой является кожная при которой появляются язвы и отечность в местах проникновения патогена. При кожной форме сибирской язвы даже в отсутствие лечения летальность составляет 10—20%, а при проведении антибиотикотерапии снижается до минимума. Кишечная форма, возникающая при проглатывании спор, вызывает более серьезное системное заболевание, приводящее к поражению желудочно-кишечного тракта, лимфадениту, отеку внутренних органов и, в конечном счете, к заражению крови. На поздних стадиях заболевания эта форма сибирской язвы не поддается лечению. И, наконец, самая опасная форма сибиреязвенной инфекции — легочная, которая, как и кишечная, имеет системный характер, но характеризуется крайне быстрым развитием и высоким процентом летальности (до 80% заболевших). Даже при своевременно начатой терапии на ранних этапах заболевания сибирской язвой при кишечной, легочной или менингеальной формах — прогноз неблагоприятный.
При проникновении в легкие большая часть спор фагоцитируется макрофагами и дендритными клетками. После поглощения спор фагоциты устремляются в ближайшие лимфатические узлы для презентации антигена лимфоцитам. Однако часть спор выживает и прорастает (вегетативная форма) в фагоцитах и, таким образом, дендритные клетки и макрофаги выполняют роль системы доставки возбудителей сибирской язвы в лимфатические узлы. Вегетативные бактерии B. anthracis лизируют оболочку фагоцитов, размножаются в лимфатической системе, а затем мигрируют в кровоток.
В течение первых недель после инфицирования организма симптомы заболевания могут отсутствовать, а затем появляется кашель и поднимается температура. Бактерии проникают в кровь и, когда количество бактерий достигает критического уровня, у больного затрудняется дыхание, развивается шоковое состояние и обширные кровоизлияния, зачастую сопровождающиеся припадками. Проявление таких симптомов обуславливают летальный и отечный токсины B. anthracis. После достижения критической стадии терапия антибиотиками становится неэффективной, и в течение 24 ч в превалирующем большинстве случаев больной погибает. Это связано с тем, что даже после уничтожения бактерий антибиотиками типа ципрофлоксацина и/или доксициклина [9, 20], летальный и отчетный токсины продол-
жают циркулировать в крови и проявлять ци-тотоксичность. Поврежденные токсином макрофаги синтезируют в большом количестве провоспалительные цитокины, которые приводят к развитию шокового состояния и, как следствие, к смерти. Единственным решением для предотвращения летального исхода у больного на поздней стадии сибиреязвенной инфекции может быть специфическая терапия, направленная против токсинов. Для создания средств антитоксинной терапии необходимо сконструировать высокоэффективный ингибитор избранной мишени, а это возможно только при полном понимании механизмов проникновения токсинов и действия их в организме.
К главным факторам вирулентности B. anth-racis относятся капсульный антиген и сибиреязвенный токсин, которые начинают синтезироваться сразу после прорастания споры. Сибиреязвенный токсин представляет собой трехкомпонентную систему, стоящую из про-тективного антигена (ПА), летального фактора (ЛФ) и отечного фактора (ОФ), кодирующимися генами плазмиды рОХ1. ЛФ и ОФ являются ферментами, которые модифицируют внутриклеточные сигнальные пути, а ПА обеспечивает транслокацию ЛФ и ОФ в цитозоль клетки. Каждый из компонентов токсина отдельно нетоксичен. Эти компоненты относятся к широкому классу токсинов, именуемых АБ токсинами. Отечный и летальный факторы относятся к компоненту А, а протективный антиген — к компоненту Б. Бинарные комбинации этих секретируемых белков составляют два токсина сибирской язвы: ПА в комбинации с ЛФ образуют летальный токсин (ЛТ), а ПА в комбинации с ОФ — отечный токсин (ОТ). Протективный антиген присоединяется к рецепторам клетки хозяина и способствуют проникновению в ее цитозоль ОФ или ЛФ, формируя пору на поверхности клетки. ЛТ и ОТ препятствуют формированию клеточного ответа на бактериальную инфекцию, разрушают систему иммунитета клетки и, таким образом, способствуют распространению бактерий [3]. По мере развития болезни токсины накапливаются в кровотоке и на поздних этапах являются главной причиной патологии. Это подтверждено в экспериментах на мышиной модели: внутривенное введение ЛТ вызывает гибель экспериментальных животных. Гибель мышей от внутривенного введения ЛТ ассоциирована с шоком, разрушением сосудов и общей гипоксией. Действие ОТ приводит к повреждению тканей, дисфункции различных органов, кровоизлияниям и пониженному давлению.
Протективный антиген (ПА) массой 83 кСа является центральным компонентом токсинов
сибирской язвы. ПА характеризуется ярко выраженными иммуногенными свойствами и поэтому ПА является основным компонентом при разработке вакцин.
Мономерный ПА представляет собой белок, состоящий из 735 аминокислотных остатков, разделенный на 4 структурных домена (рис. 1, вклейка). Основные функции 1-го домена ПА (с 1 по 258 аминокислотный остаток) заключаются в связывании ЛФ и ОФ, 2-го домена (с 259 по 487) — в связывании ПА^ мономеров и формировании петли, которая встраивается в мембрану лейкоцита и формирует катион-селективный канал [36], 3-го домена (с 488 по 595) — в олиго-меризации и/или связывании ЛФ и ОФ, 4-го домена (с 596 по 735) — в связывании с рецепторами на поверхности эукариотических клеток [27].
Протективный антиген связывается с рецепторами, которые встречаются на поверхности многих типов клеток организма человека. В частности, ПА способен связываться с рецептором TEM8 (tumor endothelium marker 8), CMG2 (capillary morphogenesis protein 2), pi-интегрином и с участием других белков проникать внутрь эукариотической клетки путем рецептор-зависимого эндоцитоза [28, 32, 21]. TEM8 еще называют рецептором сибирской язвы 1 (Anthrax Toxin Receptor — ATR1), CMG2 — рецептором сибирской язвы 2 (ATR2). Основные функции белков ТЕМ8 и CMG2 заключаются в том, что они являются молекулами клеточной адгезии и вовлечены в ангиогенез [4, 16]. Экспрессия CMG2 наблюдается в большинстве человеческих тканей, а ТЕМ8 экспрессируется главным образом на опухолевых эндотелиальных и раковых клетках [16, 22]. CMG2, ТЕМ8 и 01-интегрин относятся к трансмембранным белкам типа 1, имеющим высококонсервативный внеклеточный домен фактора фон Виллебранда типа А, который связывается непосредственно с ПА. Рецепторы CMG2, ТЕМ8 и 01-интегрин имеют структурные отличия в основном в своих цитоплазматических доменах, которые не влияют на связывание и транслокацию токсинов сибирской язвы [18].
После связывания с TEM8, 01-интегрином и/или CMG2 клеточным рецептором полноразмерный ПА83 подвергается процессингу фурин-подобными протеазами клетки-хозяина с отщеплением 167 N-концевых аминокислотных остатков протективного антигена молекулярной массой около 20 kDa (ПА20), располагающихся в домене 1. Оставшаяся часть первого домена обозначается 1' (аминокислотные остатки 168—258), а вся оставшаяся часть ПА массой 63 kDa — ПА«. Домен 1' взаимодействует с двумя ионами Са2+, содержит сайт расщепления фурина и предотвращает олигомеризацию полноразмерного ПА [44].
Активированный ПА^ спонтанно образует гептамерные или октамерные структуры, называемые препорами (рис. 2, вклейка). Анализ кристаллографической структуры гептамерной препоры показал, что она построена на основании мономер-мономерного контакта между поверхностями доменов 1' и 4 ПА^. Наличие или отсутствие ПА20 практически не влияет на формирование препоры. Обязательным участником в формировании препоры является домен 3, который участвует в олигомеризации ПА, и домен 2, формирующий большую гибкую петлю, вовлеченную во взаимодействие с мембраной и в связывание с рецептором на поверхности эукариотической клетки [34].
Домены 1', 3, 4 формируют венчик, а домен 2 — чашевидную структуру 2с (из аминокислотных остатков 259—274 и 354—487) и стебель 2б (275—353) поры ПА (рис. 1). Домены 1' и 2с формируют компактную структуру протеина, ответственную за связывание с отечным и летальным факторами и обеспечивает их эндоцитоз. Диаметр образованной в мембране лейкоцита препоры составляет 20—30 А вначале, сужаясь далее до 6 А, что позволяет предположить прохождение ЛФ и ОФ внутрь клетки в нефолдированном состоянии [23].
После протеолитического отщепления части домена 1 ПА (рис. 2, синий цвет) оставшаяся часть (ПА63) олигомеризуется и связывается с ЛФ (красный цвет). Образованный летальный токсинный комплекс связывается с рецептором клеточной поверхности (желтый) и захватывается клеткой путем эндоцитоза. В процессе созревания содержимое эндосомы закисляется, что способствует превращению препоры ПА в истинную пору. Летальный фактор в кислой среде разворачивается и транслоцируется через канал РА.
Важно отметить, что сайт связывания на поверхности ПА для эффекторных субъединиц ЛФ и/или ОФ формируется только при олиго-меризации ПА. В верхней части рисунка 2 показаны два возможных варианта стехиометрии летального токсина, что обусловлено разным соотношением мономеров ПА и ЛФ: PA7-LF3 и PA8-LF4. Каждые две ПА-субъединицы создают сайт привязки для одного ЛФ. В результате гептамер ПА содержит три ЛФ и имеет пустой полусайт, в котором контакты ЛФ-ЛФ прерываются. Октамер содержит четыре молекулы ЛФ, которые полностью образует контакты ЛФ-ЛФ вокруг кольца [24].
Процесс олигомеризации ПА ускоряется в присутствии ЛФ и/или ОФ, вероятно за счет стабилизирующего действия мультимерных комплексов ЛФ и ОФ. Быстрая агрегация ПА с ЛФ или ОФ обеспечивает эффективную транслокацию энзиматических субъединиц токсинов
внутрь клетки и сводит к минимуму вероятность интернализации пустых гептамеров ПА [11]. Олигомерные комплексы ПА вызывают кластеризацию рецепторов на поверхности эукариотической клетки, усиливая эффективность связывания ПА с поверхностью клетки.
После связывания ПА с ЛФ или ОФ, образованный комплекс захватывается клеткой путем клатрин-зависимого эндоцитоза. Для интерна-лизации токсинов сибирской язвы рецепторы CMG2, ТЕМ8 и ßl-интегрин должны связаться с рецептор-подобным белком LRP6 (LRP-receptor related protein), который является необходимым участником для эффективного эн-доцитоза [28, 37, 43]. Образованный комплекс проникает внутрь клетки. Интернализация комплексов токсинов сибирской язвы стимулируется за счет кальпаин-зависимого разрушения талина, который связывает интегрины с акти-новым цитоскелетом, что способствует эндоци-тозу токсина (рис. 3, вклейка). Ингибирование кальпаина не снижает уровень адгезии ПА к рецепторам эукариотической клетки, но снижает эндоцитоз [8, 21].
После образования эндосомы начинается ее созревание в процессе которого происходит закисление среды. При снижении рН в структуре ПА происходят конформационные изменения в результате которых второй домен ПА внедряется в мембрану эндосомы, формируя истинную пору. Закисление рН среды эндосо-мы приводит также к конформационным изменениям ЛФ и ОФ, которые разворачиваются и транслоцируются через истинную пору, сформированную ПА, в цитозоль клетки [7]. Попав в цитозоль, ЛФ и ОФ катализируют реакции, нарушающие нормальное физиологическое состояние клетки.
Летальный фактор представляет собой высокоспецифичную Zn^-зависимую металлопроте-азу, которая расщепляет вблизи N-конца последовательности киназ семейства МАРКК (mitogen activated protein kinase kinases — митоген-акти-вируемые протеинкиназные киназы). Анализ трехмерной структуры этой протеазы указывает на то, что, по-видимому, эволюционно ген ЛФ появился в результате процессов дупликаций, мутаций и слияния различных генов, что привело к появлению протеазы с крайне высокой специфичностью. Летальный фактор — крупный белок весом 94 kDa, который состоит из 4 доменов [31] (рис. 4, III обложка). Домен 1 ЛФ (аминокислотные остатки 1—263) связывает ПА, он необходим для проникновения ЛФ внутрь клетки. При связывании с ПА N-концевая а-спираль ЛФ отходит от основного корпуса и перемещается в область а-зажима ПА [30]. Домен 2 (аминокислотные остатки 264—299 и 386—550) вовлечен в узнавание C-терминальной части субстратного
пептида. Домен 3 (остатки 300—385), так называемый «спиральный пучок», встроен в домен 2, и вовлечен в узнавание субстрата Р1-Р5'. Домен 4 (остатки 551—776) является каталитическим центром связывания иона Zn2+. Общая структура каталитического домена уникальна и не имеет гомологов.
Летальный фактор совместно с ПА образует ЛТ, который проявляет цитотоксичность по отношению к макрофагам. Действие ЛФ направлено на семейство сигнальных молекул MAPKK. В результате цепи последовательных фосфорилирований нескольких различных протеинкиназ активируется одна из MAP (ми-тоген-активируемый протеин) протеинкиназ. Действие ЛФ направлено на MAPKK 5, семейство белков, участвующих в передаче сигналов, необходимых для нормального роста и диф-ференцировки клеток. Протеолиз N-конца MAPKK под влиянием ЛФ блокирует сигналы необходимые для активации и рекрутинга других иммунных клеток c целью уничтожения возбудителя инфекции. Гибель клеток макро-фагального звена может происходить как через MKK (Protein Kinase Kinase)-зависимые, так и с MKK-независимые механизмы. Механизм цитотоксичности определяется особенностями клеточной культуры и наличием или отсутствием воспалительных стимулов.
Отечный фактор является кальмодулин-зависимой аденилатциклазой молекулярной массой 89 kDa. Уровень активности аденилат-циклазы ОФ примерно в 1000 раз выше, чем уровень активности аденилатциклазы млекопитающих. Используя кальмодулин и АТФ эукариотических клеток, отечный фактор повышает в них концентрацию цАМФ. За счет увеличения концентрации цАМФ развивается отек в очаге инфекции и подавляется хемотаксис нейтрофилов. С увеличением уровня клеточного цАМФ нарушается водный баланс, что препятствует нормальному функционированию сигнальных каскадов в клетке. Отечный фактор состоит из N-концевого ПА-связывающего домена, центрального каталитического домена и С-концевого спирального домена (рис. 5, III обложка). По структуре и функциям N-концевой домен гомологичен 1 домену ЛФ. Каталитический домен структурно сходен с доменами других аденилатциклаз бактериальных токсинов (например, токсинов Bordetella pertussis СуаА, Pseudomonas aeruginosa ExoY). Спиральный домен ОФ располагается напротив каталитического домена в инактивиро-ванном состоянии. Кальмодулин, встраиваясь между спиральным и каталитическим доменами ОФ, раздвигает их, что приводит к повороту одного домена относительно другого примерно на 30 градусов. Такое взаимодействие между
кальмодулином и ферментом приводит к активации ОФ за счет конформационных изменений в линкере, соединяющем каталитический и спиральный домены [31].
Разработка антитоксических препаратов с учетом механизмов проникновения энзиматических единиц токсина в цитозоль клетки
Для получения эффективного антитоксического препарата необходимо учитывать ключевые звенья механизма действия токсина. Принимая во внимание механизмы активации сибиреязвенного токсина становится понятным, что потенциальные антитоксические препараты должны ингибировать: 1) связывание ПА с рецептором клетки; 2) активность внеклеточного фурина, разрезающего ПА на две части массой 20 и 63 кСа; 3) образование олигомер-ной препоры из мономеров ПА массой 63 кСа; 4) связывание ЛФ или ОФ с ПА; 5) эндоцитоз токсина; 6) превращение олигомерных ПА пре-пор в истинные поры; 7) транслокацию из эн-досом ЛФ или ОФ; 8) ферментативную активность ЛФ и ОФ (рис. 6, III обложка) [31].
Разработка препаратов, способных нейтрализовать токсины сибирской язвы, проводится по нескольким направлениям. Одним из подходов к разработке пептидных ингибиторов металлопротеиназы ЛФ является конъюгиро-вание хелатирующих групп металлов с пептидными субстратами, обеспечивающее высокое сродство к активному сайту протеазы. Другим вариантом разработки антитоксических препаратов является проведение скрининга низкомолекулярных органических соединений с целью выявления ингибиторов сибиреязвенных токсинов, эффективность которых улучшают в дальнейшем методами комбинаторной химии [13]. Еще одним направлением является получение моноклональных антител, способных нейтрализовать токсины B. anthracis, поиск которых проводят с использованием технологии фагового дисплея [14].
К настоящему времени получено большое количество химерных и гуманизированных мо-ноклональных антител, способных нейтрализовать токсины B. anthracis. Действие разработанных моноклональных антител направлено против разных антигенов (ПА, ЛФ, ОФ) и против разных антигенных доменов токсинов. Эпитопная специфичность моноклонального антитела определяет его способность ингиби-ровать ЛТ на этапе сборки, межрецепторных взаимодействий ПА и клетки-мишени, транслокации или проявлении ферментативной активности ОФ или ЛФ.
Набольшее количество работ связано с получением антител против ПА B. anthracis. Это объясняется тем, что ЛФ и ОФ без ПА не способны проявлять токсический эффект. Кроме того, именно связывание ПА с рецепторами на поверхности эукариотической клетки (TEM8/ ANTXR1, CMG2/ANTXR2) является первым событием многоэтапного внутриклеточного проникновения токсина сибирской язвы. Поэтому препараты, ингибирующие межрецепторные взаимодействия ПА с рецепторами эукариоти-ческой клетки, будут, вероятно, проявлять особо выраженную эффективность при терапии на ранних стадиях инфекции. Значительная доля ПА связывается с CMG2 рецепторами, поэтому предполагается, что для нейтрализации сибиреязвенного токсина можно заблокировать именно их [29]. В качестве примера можно привести препарат, ингибирующий домен Ville Willebrand фактор A (vWA) сигнального пептида, в сайте которого связывается ПА. Препарат представляет собой растворимые фрагменты домена vWA CMG2 (sCMG2), ингибирующих связывание ПA-рецептора [1, 41]. Однако длительность циркуляции в организме такого рода препарата была незначительной (у крыс период полувыведения препарата всего 10 мин) [42]. Поэтому для решения этой проблемы был сконструирован слитный белок, состоящий из растворимого sCMG2 и Fc-фрагмента человеческого иммуноглобулина — CMG2-Fc, что позволило увеличить период полувыведения препарата до 30 ч [26]. На наш взгляд такого времени циркулирования препарата также недостаточно, однако он может использоваться в целях экстренной профилактики.
На начальных этапах сборки токсина сибирской язвы за счет проявления активности фу-ринподобных ферментов происходит отрезание части 1 домена ПА, что запускает следующий этап — сборку препоры. Для ингибирова-ния этого процесса можно получить антитела, блокирующие сайт, на который направлено действие фуриноподобных ферментов. Кроме того, для блокирования сборки токсина можно использовать химические вещества. Например, ярко выраженным ингибирующим действием на фурин обладает 4-гуанидинометилфенил-Arg-Tle-Arg-4-амидинобензиламид (MI-1148). В присутствии ингибиторов фурина значительный защитный эффект наблюдается не только против токсина сибирской язвы, но также и против дифтерийного токсина [17], так как оба токсина имеют схожие стадии проникновения в цитозоль. Возможно ингибирование фу-рина и является многообещающей стратегией лечения, но, вероятно, только острых инфекционных заболеваний и только в начальном периоде.
Еще одна из стратегий, направленных на ин-гибирование сборки сибиреязвенных токсинов заключается в ингибировании олигомеризации ПАиз. Путем имитации ключевых остатков ПА^, необходимых для межмолекулярных взаимодействий, стабилизирующих гептамер, были синтезированы молекулярные соединения CAVEAT, способные ингибировать олигомери-зацию ПА^ и, в итоге, снижать токсичность ЛТ и ОТ [38].
Для ингибирования следующего этапа сборки токсинов — транслокации ЛФ или ОФ сибирской язвы в цитозоль клетки — было получено химерное моноклональное антитело против ПА — cAb29, продуцируемое в генетически модифицированных клетках СНО. Химерное моноклональное антитело cAb29 способно связываться с мономерной или гептамерной формой ПА, предотвращая образование трансмембранной поры ПA. Связывание cAb29 с препо-рой предотвращает ее переход в истинную пору внутри эндосомы при понижении рН среды, тем самым ингибируя процесс транслокации ЛФ или ОФ в цитоплазму эукариотической клетки. В экспериментах на кроликах было показано, что введение антител cAb29 через 12 ч после заражения B. anthracis оказывало терапевтический эффект и все животные выживали [33]. Особенно эффективными оказались антитела к домену 1 ЛФ, способные ингибировать связывание ЛФ и ПА и прохождение в цитозоль ЛФ [10].
Для повышения эффективности монокло-нальных антител в лечении сибиреязвенной инфекции были проведены эксперименты с использованием коктейля антител против разных эпитопов и разных антигенов B. anthracis. Пассивная иммунизация антикапсульными моноклональными антителами защищала животных от инфекции даже при условии введения антител через 20 ч после заражения спорами B. anthracis [5].
Активные работы по получению токсин-ней-трализующих моноклональных антител позволили получить препарат Raxibacumab, который в 2012 г. был утвержден FDA в качестве препарата для лечения легочной формы сибирской язвы в сочетании с противомикробными средствами. Raxibacumab является полностью гуманизированным моноклональным антителом к ПА, предотвращающим связывание ПА с клеточным рецептором. Эффективность Raxibacumab (ABthrax) проявляется только на начальных стадиях инфекции, когда ПА находится в растворимой форме, то есть до олигомеризации ПА [25]. Лечебный эффект Raxibacumab был показан на обезьянах, однократное введение препарата которым увеличивало выживаемость до 64% при аэрозольном заражении сибирской
язвой [40]. Безопасность Raxibacumab для людей была подтверждена в клинических испытаниях на 326 здоровых добровольцах. Естественно, тестирование препарата на эффективность у людей не проводилось.
Obiltoxaximab (Anthim®, ETI-204) является еще одним моноклональным антителом, утвержденным в 2016 г. FDA для профилактики и лечения ингаляционной сибирской язвы. Anthim имеет молекулярную массу около 148 kDa и представляет собой химерное моно-клональное антитело к каппа-цепи IgG1 (mAb), которое связывает ПА-компонент токсина B. anthracis [15].
Для лечения сибирской язвы в комбинации с антибиотиками используется иммуноглобулин человека «Anthrasil», полученный у доноров, иммунизированных BioThrax (адсорбированной вакциной против сибирской язвы), из плазмы крови с последующей очисткой [12, 19]. По всей видимости, благодаря присутствию антител, способных реагировать с различными эпитопами ПА, такой препарат может ингиби-ровать токсин даже после этапа связывания ПА с рецептором эукариотической клетки.
Получено большое количество гуманизированных и химерных антител против ЛФ. В качестве особо перспективного препарата себя зарекомендовали моноклональные антитела против 1 домена ЛФ, так как они могут ингибировать связывание ПА и ЛФ и таким образом препятствовать проявлению токсического действия. Например, моноклональное антитело IQNLF является полностью человеческим и направлено против 1 домена ЛФ [2]. В экспериментах на мышах было показано, что однократная иммунизация IQNLF в дозе 180 мкг/мышь защищала всех мышей линии A/J от заражения спорами B. anthracis Sterne в дозе 24 LD50 [2]. Получены химерные моноклональные антитела шимпанзе/человек LF10E и LF11H также направлены против 1 домена ЛФ, однако результаты исследований показали, что эти антитела не ингибируют связывание с ПА. Тем не менее, LF10E и LF11H обеспечивают 100% защиту крыс Fischer 344 от действия ЛТ [6].
Полученных моноклональных антител против ОФ мало. Это связано, вероятно, с тем, что ОФ в меньшей степени обуславливает летальный эффект. Одним из косвенных тому подтверждений результаты сравнительных исследований способности нейтрализовать ОФ антителами, находящимися в сыворотках доноров, вакцинированных американской вакциной (anthrax vaccine adsorbed — AVA) или английской вакциной (anthrax vaccine precipitated — AVP). AVA представляет собой бесклеточный фильтрат акапсулярного, токсигенного штам-
ма B. anthracis V770-NP1-R, который адсорбируется на гидроксиде алюминия, содержит ПА и только следовые количества антигенов ЛФ и ОФ. Вакцина AVP состоит из бесклеточного фильтрата акапсулярного, токсигенного штамма B. anthracis Sterne 34F2, который осаждается сульфатом алюминия (Alum). В отличие от вакцины AVA, AVP содержит все три компонента токсина: ПA, ЛФ и ОФ. Анализ антител в сыворотке крови показал, что у доноров, вакцинированных AVP, уровень антител к ОФ был значительно выше, чем у доноров, вакцинированных AVA. Однако антитела сыворотки крови этих двух групп доноров нейтрализовывали ОТ с одинаковой выраженностью. На этом основании был сделан вывод, что решающая роль в нейтрализации ОФ принадлежит ПА [14].
Несмотря на имеющиеся для профилактики и лечения препараты, направленные на инги-бирование токсинов сибирской язвы, продолжение работ в этом направление необходимо. Raxibacumab и Anthim имеют ряд недостатков. Препараты не способны проникать через гема-тоэнцефалический барьер, а значит не могут быть использованы для лечения менингеальной формы сибирской язвы, которая часто развивается на поздней стадии инфекции. Побочные эффекты Anthim могут проявляться в виде реакций гиперчувствительности и анафилаксии, поэтому препарат рекомендуется использовать только в случае крайней необходимости. Побочные эффекты Raxibacumab также могут проявляться в виде аллергических реакций. Поэтому перед применением Raxibacumab или Anthim пациентам вводят антигистаминные препараты. Оба препарата должны храниться в холодильнике (при температуре от 2 до 8°C) и не попадать под прямые солнечные лучи. Raxibacumab и Anthim вводятся внутривенно, а в случае биотеррористической атаки предпочтительным является внутримышечный путь введения препарата.
Лечение только антибиотиками эффективно в течение четырех дней после аэрогенного проникновения спор B. anthracis. Использование антитоксина вместе с противомикробными препаратами расширяет диапазон эффективного лечения до 1 недели после заражения B. anthracis [39].
В России для лечения сибирской язвы в качестве антитоксического препарата выпускается токсин сибиреязвенный лошадиный, который может вызывать формирование аллергических реакций. Какие-либо другие отечественные препараты, направленные на ингибирование токсинов сибирской язвы отсутствуют.
Несмотря на большое количество исследований, посвященных получению человеческих моноклональных антител, способных
нейтрализовать летальный токсин B. anthracis, работы в этом направлении продолжаются. Предполагается использование моноклональ-ных антител не только для лечения, но и для проведения специфической профилактики сибирской язвы.
Источник финансирования
Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
Список литературы/References
Конфликт интересов
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.
Благодарность
Выражаем благодарность Воеводиной Нине Евгеньевне и Щербаковой Анастасии Николаевне за оказание технической поддержки.
1. Abrami L., Leppla S.H., van der Goot F.G. Receptor palmitoylation and ubiquitination regulate anthrax toxin endocytosis. J. Cell Biol., 2006, vol. 172, no. 2, pp. 309-320. doi: 10.1083/jcb.200507067
2. Albrecht M.T., Li H., Williamson E.D., LeButt C.S., Flick-Smith H.C., Quinn C.P., Westra H., Galloway D., Mateczun A., Goldman S. Human monoclonal antibodies against anthrax lethal factor and protective antigen act independently to protect against Bacillus anthracis infection and enhance endogenous immunity to anthrax. Infect. Immun., 2007, vol. 75, pp. 5425-5433.
3. Benjamin E. Manipulation of host signalling pathways by anthrax toxins. Turk. Biochem. J., 2007, vol. 402, no. 3, pp. 405-417.
4. Chen K.H., Liu S., Leysath C.E., Miller-Randolph S., Zhang Y., Fattah R., Bugge T.H., Leppla S.H. Anthrax toxin protective antigen variants that selectively utilize either the CMG2 or TEM8 receptors for cellular uptake and tumor targeting. J. Biol. Chem.,
2016, vol. 291, no. 42, pp. 22021-22029.
5. Chen Z., Moayeri M., Crown D., Emerson S., Gorshkova I., Schuck P., Leppla S.H., Purcell R.H. Novel chimpanzee/human monoclonal antibodies that neutralize anthrax lethal factor, and evidence for possible synergy with anti-protective antigen antibody. Infect. Immun., 2009, vol. 77,pp. 3902-3908. doi: 10.1128/IAI.00200-09
6. Chen Z., Moayeri M., Purcell R. Monoclonal antibody therapies against anthrax. Toxins, 2011, vol. 3,pp. 1004-1019. doi: 10.3390/ toxins3081004
7. Das D., Krantz B.A. Secondary structure preferences of the anthrax toxin protective antigen translocase. J. Mol. Biol., 2017, vol. 429, no. 5,pp. 753-762. doi: 10.1016/j.jmb.2017.01.015
8. Deu E. Proteases as antimalarial targets: strategies for genetic, chemical, and therapeutic validation. FEBS J., 2017, vol. 284, no. 16, pp. 2604-2628. doi: 10.1111/febs.14130
9. Dixon T.C., Meselson M., Guillemin J., Hanna P.C. Anthrax. N. Engl. J. Med., 1999, vol. 341, no. 11, pp. 815-826.
10. Dumas E.K., Garman L., Cuthbertson H., Charlton S., Hallis B., Engler R.J.M., Choudhari S., Picking W.D., James J.A., Farris A.D. Lethal factor antibodies contribute to lethal toxin neutralization in recipients of anthrax vaccine precipitated. Vaccine,
2017, vol. 35, no. 26,pp. 3416-3422. doi: 10.1016/j.vaccine.2017.05.006
11. Fabre L., Santelli E., Mountassif D., Donoghue A., Biswas A., Blunck R., Hanein D., Volkmann N., Liddington R., Rouiller I. Structure of anthrax lethal toxin prepore complex suggests a pathway for efficient cell entry. J. Gen. Physiol., 2016, vol. 148, no. 4, pp. 313-324. doi: 10.1085/jgp. 201611617
12. Glinert I., Bar-David E., Sittner A., Weiss S., Schlomovitz J., Ben-Shmuel A., Mechaly A., Altboum Z., Kobiler D., Levy H. Revisiting the concept of targeting only Bacillus anthracis toxins as a treatment for anthrax. Antimicrob. Agents Chemother., 2016, vol. 60, no. 8, pp. 4878-4885. doi: 10.1128/AAC.00546-16
13. Goldberg A.B., Turk B.E. Inhibitors of the metalloproteinase anthrax lethal factor. Curr. Top. Med. Chem., 2016, vol. 16, no. 21, pp. 2350-2358.
14. Goldstein J.M., Lee J., Tang X., Boyer A.E., Barr J.R., Bagarozzi D.A. Jr, Quinn C.P. Phage display analysis of monoclonal antibody binding to anthrax toxin lethal factor. Toxins (Basel), 2017, vol. 9, no. 7, pp. 221. doi: 10.3390/toxins9070221
15. Greig S.L. Obiltoxaximab: first global approval. Drugs, 2016, vol. 76, no. 7,pp. 823-830. doi: 10.1007/s40265-016-0577-0
16. Greither T., Wedler A., Rot S., Keßler J., Kehlen A., Holzhausen H.J., Bache M., Würl P., Taubert H., Kappler M. CMG2 expression is an independent prognostic factor for soft tissue sarcoma patients. Int. J. Mol. Sci., 2017, vol. 18, no. 12: E2648. doi: 10.3390/ ijms18122648
17. Hardes K., Becker G.L., Lu Y., Dahms S.O., Köhler S., Beyer W., Sandvig K., Yamamoto H., Lindberg I., Walz L., von Messling V., Than M.E., Garten W., Steinmetzer T. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. Chem. Med. Chem., 2015, vol. 10, no. 7, pp. 1218-1231. doi: 10.1002/cmdc.201500103
18. Hu K., Olsen B.R., Besschetnova T.Y. Cell autonomous ANTXR1-mediated regulation of extracellular matrix components in primary fibroblasts. Matrix Biol., 2017, vol. 62, pp. 105-114. doi: 10.1016/j.matbio.2016
19. Huang E., Pillai S.K., Bower W.A., Hendricks K.A., Guarnizo J.T., Hoyle J.D., Gorman S.E., Boyer A.E., Quinn C.P., Meaney-Delman D. Antitoxin treatment of inhalation anthrax: a systematic review. Health Secur., 2015, vol. 13, no. 6, pp. 365-377. doi: 10.1089/hs.2015.0032
20. Hughes J.M., Gerberding J.L. Anthrax bioterrorism: lessons learned and future directions. Emerg. Infect. Dis., 2002, vol. 8, no. 10, pp. 1013-1014. doi: 10.3201/eid0810.020466
21. Jeong S.Y., Martchenko M., Cohen S.N. Calpain-dependent cytoskeletal rearrangement exploited for anthrax toxin endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, vol. 110, no. 42: E4007-E4015. doi: 10.1073/pnas.1316852110
22. Jia Z., Ackroyd C., Han T., Agrawal V., Liu Y., Christensen K., Dominy B. Effects from metal ion in tumor endothelial marker 8 and anthrax protective antigen: BioLayer Interferometry experiment and molecular dynamics simulation study. J. Comput. Chem., 2017, vol. 38, no. 15, pp. 1183-1190. doi: 10.1002/jcc.24768
23. Jiang J., Pentelute B.L., Collier R.J., Zhou Z.H. Atomic structure of anthrax protective antigen pore elucidates toxin translocation. Nature, 2015, vol. 521, no 7553, pp. 545-549.
24. Krantz B.A. Anthrax lethal toxin co-complexes are stabilized by contacts between adjacent lethal factors. J. Gen. Physiol., 2016, vol. 148, no. 4, pp. 273-275. doi: 10.1085/jgp. 201611681
25. Kummerfeldt E.C. Raxibacumab: potential role in the treatment of inhalational anthrax. Infect. Drug Resist., 2014, pp. 101-110. doi: 10.2147/IDR.S47305
26. Li L., Guo Q., Liu J., Zhang J., Yin Y., Dong D., Fu L., Xu J., Chen W. Recombinant HSA-CMG2 is a promising anthrax toxin inhibitor. Toxins (Basel), 2016, vol. 8, no. 1: E28. doi: 10.3390/toxins8010028
27. Little S.F., Novak J.M., Lowe J.R., Leppla S.H., Singh Y., Klimpel K.R., Lidgerding B.C., Friedlander A.M. Characterization of lethal factor binding and cell receptor binding domains of protective antigen of Bacillus anthracis using monoclonal antibodies. Microbiology, 1996, vol. 142, pp. 707- 715.
28. Liu C.C., Kanekiyo T., Roth B., Bu G. Tyrosine-based signal mediates LRP6 receptor endocytosis and desensitization of Wnt/ P-catenin pathway signaling. J. Biol. Chem., 2014, vol. 289, no. 40,pp. 27562-27570. doi: 10.1074/jbc.M113.533927
29. Liu S., Zhang Y., Hoover B., Leppla S.H. The receptors that mediate the direct lethality of anthrax toxin. Toxins (Basel), 2012, vol. 5, no. 1, pp. 1-8. doi: 10.3390/toxins5010001
30. Machen A.J., Akkaladevi N., Trecazzi C., O'Neil P.T., Mukherjee S., Qi Y., Dillard R., Im W., Gogol E.P., White T.A., Fisher M.T. Asymmetric Cryo-EM Structure of Anthrax Toxin Protective Antigen Pore with Lethal Factor N-Terminal Domain. Toxins (Basel), 2017, vol. 9, no. 10:E298. doi: 10.3390/toxins9100298
31. Maize K.M., Kurbanov E.K., De La Mora-Rey T., Geders T.W., Hwang D.J., Walters M.A., Johnson R.L., Amin E.A., Finzel B.C. Anthrax toxin lethal factor domain 3 is highly mobile and responsive to ligand binding. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr, 2014, vol. 70 (Pt. 11), pp. 2813-2822. doi: 10.1107/S1399004714018161
32. Martchenko M., Jeong S.Y., Cohen S.N. Heterodimeric integrin complexes containing betal-integrin promote internalization and lethality of anthrax toxin. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2010, vol. 107, no. 35, pp. 15583-15588. doi: 10.1073/pnas.1010145107
33. Mechaly A., Levy H., Epstein E., Rosenfeld R., Marcus H., Ben-Arie E. A novel mechanism for antibody — based anthrax toxin neutralization: inhibition of prepore-to-pore conversion. J. Biol. Chem., 2012, vol. 287, no. 39, pp. 32665-32673. doi: 10.1074/jbc. M112.400473
34. Mogridge J., Cunningham K., Lacy D.B., Mourez M., Collier R.J. The lethal and edema factors of anthrax toxin bind only to oligomeric forms of the protective antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, vol. 99, no. 10, pp. 7045-7048. doi: 10.1073/ pnas.052160199
35. Nestorovich E.M., Bezrukov S.M. Designing inhibitors of anthrax toxin. Expert Opin. Drug. Discov., 2014, vol. 9, no. 3, pp. 299318. doi: 10.1517/17460441.2014.877884
36. Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. Nature, 1997, vol. 385, no. 6619, pp. 833-838.
37. Rawlings N.D. Bacterial calpains and the evolution of the calpain (C2) family of peptidases. Biol. Direct., 2015, vol. 10, p. 66. doi: 10.1186/s13062-015-0095-0
38. Rubert Pérez C., López-Pérez D., Chmielewski J., Lipton M. Small molecule inhibitors of anthrax toxin-induced cytotoxicity targeted against protective antigen. Chem. Biol. Drug Des., 2012, vol. 79, no. 3, pp. 260-269. doi: 10.1111/j.1747-0285.2011.01285.x
39. Rubinson L., Corey A., Hanfling D. Estimation of time period for effective human inhalational anthrax treatment including antitoxin therapy. PLoS Curr, 2017, vol. 9. doi: 10.1371/currents.outbreaks.7896c43f69838f17ce1c2c372e79d55d
40. Schneemann A., Manchester M. Anti-toxin antibodies in prophylaxis and treatment of inhalation anthrax. Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 35-43. doi: 10.2217/17460913.4.1.35
41. Scobie H.M., Thomas D., Marlett J.M., Destito G., Wigelsworth D.J., Collier R.J., Young J.A., Manchester M. A soluble receptor decoy protects rats against anthrax lethal toxin challenge. J. Infect. Dis., 2005, vol. 192, no. 6, pp. 1047-1051.
42. Thomas D., Naughton J., Cote C., Welkos S., Manchester M., Young J.A. Delayed toxicity associated with soluble anthrax toxin receptor decoy-Ig fusion protein treatment. PLoS One, 2012, vol. 7, no. 4: e34611. doi: 10.1371/journal.pone.0034611
43. Van der Goot G., Young J.A. Receptors of anthrax toxin and cell entry. Mol. Aspects Med., 2009, vol. 30, no. 6, pp. 406-412. doi: 10.1016/j.mam.2009.08.007
44. Zakowska D., Bartoszcze M., Niemcewicz M., Bielawska-Drózd A., Kocik J. New aspects of the infection mechanisms of Bacillus anthracis. Ann. Agric. Environ. Med., 2012, vol. 19, no. 4, pp. 613-618.
Авторы:
Фирстова В.В., д.б.н., главный научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, п. Оболенск, Московская область, Россия;
Шемякин И.Г., д.б.н., профессор, зам. директора по науке ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, п. Оболенск, Московская область, Россия
Дятлов И.А., академик РАН, профессор, д.м.н., директор ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, п. Оболенск, Московская область, Россия.
Поступила в редакцию 25.07.2018 Отправлена на доработку 04.03.2019 Принята к печати 15.03.2019
Authors:
Firstova V.V., PhD, MD (Biology), Head Researcher of Molecular Biology, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russian Federation, Shemyakin I.G.,PhD, MD (Biology), Professor, Deputy Director for Science, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russian Federation, Dyatlov I.A., RAS Full Member, PhD, MD (Medicine), Professor, Director, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russian Federation.
Received 25.07.2018 Revision received 04.03.2019 Accepted 15.03.2019
