CC BY
28
Вопросы ли Агностики
Современная диагностика лямблиозной инфекции у детей с хроническим гепатитом В
Ф. И. ИноятовА, Г. З. Иногамова, Ш. У. Абаумаажиаова, Н. К. ВАЛИЕВА, Н. Ф. НУРМАТОВА, Д. F! Юсупов
Республиканский специализированный научно-практический мЕдииинский Центр Педиатрии МЗ РУз, Узбекистан, Ташкент
Обследование 200 детей с ХГВ позволило установить частоту лямблиозной инфекции в 41,0% случаев. Из существующих диагностических тестов выявления лямблий наиболее чувствительными и специфичными явились методы: иммунофлуоресценции — выявление специфического антигена (70,2%) и ПЦР — выявление DNA L. intestinaiis в фекалиях (78,0%). Лямблиозная инфекция пролонгирует репликативную активность HBV.
Ключевые слова: хронический вирусный гепатит, лямблиоз, диагностика, маркеры HBV и L. intestinaiis, дети
Contemporary Methods of Giardia Infection Diagnostics in Children with Chronic Hepatitis B
F. I. iNOYATOVA, G. Z. iNOGAMOVA, SH. U. ABDUMADZHIDOVA, N. K. VALIEVA, N. F. NURMATOVA, D. R. YUSUPOV
Specialized Republican Research and Practical Medical Center of Pediatrics, Uzbekistan, Tashkent
In examination of 200 children with ChHB, giardia infection was detected in 41,0% of the cases. Among the existing tests for diagnostic of giardia infection the method of immunofluorescence, detecting specific antigen (70,2%), and PCR method, detecting Lintestinaiis DNA in feces (78,0%), proved to be most sensitive and specific. Giardia infection prolongs replication activity of the HBV
Key words: chronic viral hepatitis, giardian infection, diagnostic, HBV and Lintestinaiis markers, children
Контактная информация: Иноятова Флора Ильясовна — д.м.н., проф., зав. отделом гепатологии Республиканского специализированного научно-практического центра педиатрии МЗ РУз; Узбекистан, 100019, Ташкент, С. Рахимовский район, ул. Чимбай 2, проезд Талант 3; (99871) 228-78-27
УДК 616.36-002 :619.9-002.9
Хронический гепатит В (ХГВ) представляет серьезную проблему для здравоохранения большинства стран мира, в том числе и в Узбекистане. Ввиду его повсеместного распространения в виде малосимптомных, тяжелых и прогрессирующих форм вплоть до цирроза печени (30—70%) и гепатоцеллюлярной карциномы (5—30%). С ростом этой патологии (до 45% в структуре соматической патологии) также значительно возрастает заболеваемость инфекциями, вернувшимися после многолетнего отсутствия или регистрации на спорадическом уровне. В этом ряду, по общему признанию специалистов, находятся паразитозы, обладающие низкой иммуногенностью [1—3]. Одним из наиболее распространенных среди населения Земли паразитозов является лямблиоз (до 20—30%). В частности, по данным экспертов ВОЗ в странах Азии, Африки и Латинской Америки ежегодно лямблиозом заражается около 200 млн. человек, а клиническими формами страдает 500 тыс. больных в год. При этом, до 80% приходится на детей и подростков, с большей выявляемостью у детей от 2-х до 8 лет (50%), а к 16 годам снижается до 7—10% [4—8]. В то же время становится очевидным, что одной из многих причин повышенной восприимчивости у детей является наличие хронических заболеваний, среди которых одним из наиболее неблагоприятных является ХГВ. Это обусловлено генерализацией вирусной инфекции с полисистемной органной недостаточностью, что в итоге приводит к угнетению сопротивляемости макроорганизма и, уже в условиях сочетанной вирусно-па-разитарной инфекции, способствует развитию двух параллельных взаимоусугубляющих процессов. Наряду с этим, в нашей гепатологической практике бывают случаи течения ХГВ, неподдающегося базисному лечению, связанные с мас-
кировкой заболевания клиническими формами лямблиоза и определенными трудностями раннего выявления L. intestinalis стандартными методами диагностики. Это диктует необходимость совершенствования методов диагностики с использованием чувствительных тестов.
Цель исследования: оценка информативности существующих методов диагностики лямблиозной инфекции у детей с ХГВ с последующим выявлением взаимосвязей маркеров HBV и L. intestinalis.
Материалы и методы исследования
В клиническое исследование с подозрением на лямблиоз (наличие трех и более симптомов, таких как «мраморная белизна» кожи носа, депигментация кожи лица и плеч, гиперкератоз, заеды в углах рта, тики, бруксизм, ги-перкинезы и энурез) были включены 200 детей, больных ХГВ, мальчиков 75%, девочек 25%, среди которых паразитарная инвазия была обнаружена у 82 (41,0%) детей. Возраст больных был от 3 до 15 лет, большинство детей дошкольного возраста (61,5%). Диагноз ХВГ устанавливали на основании подробного анамнеза, клинического обследования, ряда биохимических и инструментальных исследований с использованием классификации, принятой на Всемирном конгрессе экспертов-гепатологов (Лос-Анджелес, 1994). Давность ХГВ, в среднем, составила 4,2 + 0,3 лет. Распределение по активности ХГВ показало, что 60% детей имели умеренную, 25% детей выраженную и 15% — минимальную степень активности ХГВ.
Вирусологическую верификацию HBV проводили на основании обнаружения НВэАд, НВэАЬ, НВеАд, НВеАЬ, суммарные HBcorAb методом ИФА с использованием наборов
■ Ф. И. Иноятовл и др. Современная лилгностикА лямБлиозной инфЕкиии у летей с хроническим гепатитом В
Таблица 1. Сравнительная характеристика методов диагностики лямблиоза у детей, больных ХГВ
фирмы «HUMEN» (Германия). Анализ крови на предмет обнаружения НВУ-ДНК методом ПЦР проводили с использованием коммерческих тест-систем «Авиценна» (г. Москва).
Методом ИФА проводили: определение антител к лямблиозному антигену класса IgM и IgG в сыворотке крови с использованием наборов фирмы «PLATE SCREEN» (Италия); антител к лямблиозному антигену класса IgA в слюне с использованием наборов «секреторный 1дА-ИФА» (Германия); методом иммунофлюоресценции определяли антиген L. intestinalis в фекалиях с использованием наборов «Биотек» (США). Методом ПЦР качественного анализа определялись DNA L. intestinalis в крови, слюне и фекалиях с использованием коммерческих тест систем «Master-Cycler» (Германия). Копрологическое обследование основывалось на микроскопии осадочных компонентов фекалий и проводилось трехкратно через день. Вычислялся коэффициент позитивности (КП) — по отношению оптической плотности (ОП) к критической. Математическая обработка проводилась методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента по специальной компьютерной программе Excel-2000.
Результаты и их обсуждение
Серологическое выявление у детей, больных ХГВ, специфических антител в сыворотке крови в нашем исследовании подтвердило мнение большинства авторов [4, 9] о низкой чувствительности (IgM — 26,8% и IgG — 31,7%) этого метода в диагностике лямблиоза (табл. 1). При этом КП IgM находился в низких титражных пределах: 1,0—1,2, IgG, напротив, в относительно высоких: 2,1—2,9. Высокий уровень ОП антител класса G у данных больных свидетельствовал о наличии хронической лямблиозной инвазии. Из них в 20,8% случаях IgG выявлялись в сочетании с IgM, такой вариант расценивался нами как обострение хронической формы лямблиоза при невысокой степени инвазии. Положительные пробы сочетались с обнаружением цист лямблий в копрограмме на фоне их общей выявляемости в 24,5% случаев и антигена L. intestinalis в 17,2% случаев с КП 1—2.
Объяснение низкой чувствительности ИФА метода у данной категории больных, по-видимому, можно усмотреть в неэффективности механизмов гуморальной защиты (состояние иммунодефицита), характерной для ХГВ. В связи с этим, учитывая недостаточную изученность ан-
тигенной структуры лямблий и их токсинов, а также отсутствие четкого параллелизма между обнаружением цист лямблий в копрограмме и выявлением специфических антител в сыворотке крови, полагаться только на результаты серологического исследования для диагностики лямблиозной инвазии при ХГВ у детей, на наш взгляд, преждевременно.
Далее, при исследовании 82 представленных образцов фекалий методом иммунофлюоресценции, у 58 (70,7%) больных детей был обнаружен антиген L. intestinalis. Из них в 82,7% случаев ОП антигена была высокой: с колебанием в пределах выше 1,00 (1,540—1,919) у 27,5% детей; выше 2,00(2,433-2,629) у 41,4% больных и выше 3,00 (3,202—3,879) у 13,8% детей. Это соответствовало высокому КП: в первом случае > 6,7; во втором > 10,6 и в третьем > 14,0 и свидетельствовало о выраженной лямбли-озной инвазии. Причем, на фоне полученных результатов микроскопии, процент их совпадения равнялся 100. В том числе только у 12,1% больных детей выявление антигена сочеталось с положительными образцами специфических антител IgG. В остальных случаях (17,3% серопозитивных больных) титражная ОП специфического антигена в фекалиях была ниже единицы с предельными колебаниями 0,171 — 0,435, что соответствовало КП от 1,1 до 1,9 и свидетельствовало о вялотекущем процессе лямблиозной инфекции.
Исследование методом ПЦР в различных биологических средах (кровь, фекалии, слюна) выявило неоднозначность итоговых результатов. Так, относительно более чувствительной оказалась ПЦР-диагностика DNA L. intestinalis в фекалиях — 78,0% (64 пациента) положительных образцов. При этом процент совпадения со специфическим антигеном составил 85,9 (55 пациента) и с микроскопией кала — 75,0. В других случаях DNA L. intestinalis (14,0%) и специфический антиген (5,2%) в фекалиях выявлялись изолированно. В образцах крови чувствительность ПЦР метода составила 48,7%, из которых 37,8% образцов сочетались с положительными результатами специфического антигена и DNA L. intestinalis в фекалиях, что свидетельствовало о транслокации лямблиозного агента. Несмотря на высокую чувствительность метода ПЦР, его специфичность оказалась относительно меньше (76,8%) метода иммунофлюоресценции (96,6%). Наряду с этим, ПЦР-диагностика L. intestinalis в слюне не выявила не одного положительного результата, что видимо исключает возможность использования данного метода в диагностике лямблиоза у больных детей при ХГВ.
Исследования методом ИФА секреторного IgA в слюне (82 образцов) свидетельствовали о характерном выявлении высоких титров у большинства (93,9%) больных с лямбли-озом, коэффициент вариации которых находился в пределах 410,0—715,0 мкг/мл при нормальных предельных величинах 57—260 мкг/мл. По-видимому, объяснение резко повышенным титрам IgA в слюне можно усмотреть в реакциях местного иммунитета на проникновение не только лямблий, но и других бактерий, а также нейтрализации вирусов, персистирующих в организме больных детей, в данном случае это HBV-инфекция [6]. Важно отметить, что при сопоставительном анализе всех изучаемых параметров у детей, высокие титры IgA в слюне сочетались с позитивны-
Метод Чувствительность Специфичность
Микроскопия фекалий 24,5% 96,6%
ИФА IgM в сыворотке крови 26,8% 84,1%
IgG в сыворотке крови 31,7% 77,5%
IgA в слюне 99,1% 8,3%
Антиген в фекалиях 70,7% 96,6%
ПЦР DNA L. intestinalis в крови 48,9% 91,6%
DNA L. intestinalis в фекалиях 78,0% 76,8%
DNA L. intestinalis в слюне 0% 0%
■ Ф. И. Иноятовл и др. Современная лиагностика лямБлиозной инфЕкиии у летей с хроническим гепатитом В
Таблица 2. Частота встречаемости маркеров HBV и L. intestinalisу детей, больных ХГВ
Маркер DNA L intestinalis в крови (-), DNA L. intestinalis в фекалиях (+), антиген L. intestinalis (-), n = 9 (I) DNA L intestinalis в крови (-), DNA L. intestinalis в фекалиях (+), антиген L. intestinalis (+), n =40 (II) DNA L. intestinalis в крови (+), DNA L. intestinalis в фекалиях (+), антиген L. intestinalis (+), n = 15 (III) p
М ± m,% М ± m,% М ± m,% I—II II—III I—III
HBsAg 100,0 87,5 ± 5,2 100,0 <0,05 <0,05 >0,05
HBsAb 55,5 ± 16,5 20,0 ± 6,3 13,3 ± 8,7 <0,05 >0,05 <0,001
HBeAg 33,3 ± 15,7 45,0 ± 7,8 86,6 ± 8,7 >0,05 <0,05 <0,01
HBeAb 66,6 ± 15,7 60,0 ± 7,7 33,3 ± 12,1 >0,05 >0,05 >0,05
HBV-DNA 33,3 ± 15,7 75,0 ± 6,8 100,0 <0,05 <0,01 <0,001
p — достоверность различий между исследуемыми группами
ми результатами антигена в фекалиях в 39,0% случаях, DNA L. intestinalis в фекалиях у 21,9% детей и у 9,7% — с позитивным результатом DNA L. intestinalis в крови. При этом диагностически значимый титр в первом случае составил, в среднем, 550,0 + 12,2 мкг/мл; во втором и третьем — 626,0 + 23,2 мкг/мл. У всех указанных больных выявлялась высокая оптическая плотность специфического антигена в фекалиях с КП > 14,0, что свидетельствовало о массивной инвазии и, по-видимому, транслокации лямблиоз-ной инфекции из кишечника в кровь.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что приоритетом в лабораторном выявлении лямблиоза у детей, больных ХГВ, можно считать методы иммунофлуорес-ценции и ПЦР фекалий. Другие лабораторные тесты, как микроскопия осадочных компонентов фекалий, выявления специфических антител IgM и G в сыворотке крови в ИФА, секреторного IgA в слюне можно рекомендовать для косвенной диагностики и интерпретации лямблиозной инвазии. Эти данные со всей очевидностью подчеркивают важность своевременной элиминации лямблиозной инфекции при HB-вирусном поражении печени, что явилось предпосылкой для дальнейшего этапа — выявления взаимосвязей маркерного профиля двух инфекций — HBV и L. intestenal/s.
Так, под наблюдением находились 64 ребенка, больных ХГВ, с маркерами активации лямблиозной инфекции. В частности, это 15 детей с наличием антигена в фекалиях, DNA L. intestinalis в крови и в фекалиях; 40 — с антигеном и DNA L. intestinalis в фекалиях и 9 детей только с позитивным DNA L. intestinalis в фекалиях. Анализ показал (табл. 2), что HBsAg обнаруживался практически у больных всех изучаемых групп.
Детекция HBsAb в большей степени выявлялась у детей I группы (58,3%, р< 0,05). Напротив, маркер активной репликации HBV — HВеAg превалировал у детей с выраженной активацией лямблиозного процесса (86,6%, р < 0,05), в других группах е-антиген встречался практически одинаково (37,5 и 45,0% соответственно в I и II группах). При этом антитела к HBeAg отмечались у более половины детей I (62,5%) и II (60,0%) групп и только у трети (33,3%) больных III группы (р<0,05). Другой маркер активной вирусной репликации— HBV-DNA выявлялся у большинства больных III (100,0%) и II (75,0%) групп. У детей с только позитивным антигеном — в 41,6% случаев (р< 0,01).
Таким образом, видимая связь репликации HBV-ин-фекции с активностью лямблиозного процесса, маркерами которой являются DNA L. intestinalis в фекалиях/крови и антиген L. intestinalis в фекалиях, позволяет предполагать, что одной из причин активации патологического процесса в печени при ХГВ и, возможно, его прогресси-рования, является наличие сопутствующего лямблиоза.
Выводы
1. В структуре сопутствующих заболеваний при ХГВ у детей лямблиозная инфекция регистрируется в 41,0% случаев. Приоритетом в лабораторной диагностике лямблиозной инфекции у детей, больных ХГВ, является метод иммунофлу-оресценции — выявление специфического антигена и ПЦР — выявление DNA L. intestinalis в фекалиях. Для других лабораторных тестов, таких как микроскопия осадочных компонентов фекалий, ИФА — выявление специфических антител IgM и IgG в сыворотке крови, характерна низкая чувствительность и соответственно малая диагностическая значимость.
2. Значимыми критериями активации лямблиозной инфекции при ХГВ у детей являются: повышение ОП специфического антигена в фекалиях (выше 1,540— не выраженная степень инвазии; выше 2,433 — умеренно выраженная степень инвазии; выше 3,202 — высокая степень инвазии), повышение титра секреторного IgA выше 550,0 мкг/мл в слюне; положительная DNA L. intestinalis в ПЦР крови.
3. Выявленная связь репликативной активности HBV с активацией лямблиозной инфекции у больных ХГВ диктует необходимость своевременного ее выявления и лечения с использованием специфических препаратов с учетом их гепатотоксичности, биодоступности и эффективности.
Литература:
1. Апросина З.Г., Серов В.В. Хронические вирусные гепатиты. — М., 2002 г.
2. Современные аспекты диагностики лямблиоза у человека / Е.В. Агафонова и др. // РМЖ. — 2008. — Т. 16, № 7. — С. 146—149.
3. Вирусные гепатиты у детей с соматической патологией / А.В. Смирнов и др. // Педиатрия. — 2001. — Спец. вып. — С. 18—22.
4. Диагностика и лечение лямблиоза у детей / Е.А. Корниенко и др. // Инфекционные болезни. — 2009. — Т. 7, № 1. — С. 43—48.
5. Бельмер С.В. Лямблиоз у детей // РМЖ. — 2004. — Т. 12, № 3. — С. 141—144.
6. Клиническая паразитология. — ВОЗ, Женева, 2002. — С. 231—240.
7. Поляков В.Е. Лямблиоз у детей и подростков / В.Е. Поляков, И.А. Иванов, С.И. Казакова // РМЖ. — 2004. — № 6. — C. 47—50.
