CC BY
131
УДК 544.7:556.538.8:614.8
С.И. Трофимов, И.В. Михеева
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ЭКСПРЕСС-МЕТОДА
ОЦЕНКИ УРОВНЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЗАРАЖЁННОСТИ ВОДНОЙ СРЕДЫ
В работе приводятся результаты поисковых лабораторных исследований повышения достоверности хемилюминесцентного экспрессного метода оценки уровня бактериальной заражённости проб воды на основе применения некоторых видов специальной водоподготовки. Пробы воды отобраны из различных водоисточников центрального района европейской части России.
Ключевые слова: хемилюминесценция, люминол, величина световыхода, общее микробное число КОЕ, посевы проб на питательные среды.
S. Trofimov, I. Mikheeva
IMPROVEMENT OF CHEMILUMINESCENT EXPRESS METHOD OF EVALUATION BACTERIAL CONTAMINATION LEVEL OF WATER ENVIRONMENT
The article presents the results of laboratory researching of the improvement chemiluminescent express method of evaluation bacterial contamination water tests level using special water treatment. Water tests are taken from various water sources in the central region of the European part of Russia.
Ключевые слова: chemiluminescence, luminal, light output quantity, microbial number of CFU (colony-forming unit), inoculations.
В настоящее время повсеместно обостряется санитарно-эпидемиологическая обстановка в окружающей человека среде вследствие растущего общего и специфического бактериального её загрязнения и, в первую очередь, питьевой воды и продуктов питания.
Главная задача аварийно-спасательных служб МЧС России и системы государственных врачей России как в повседневной жизни в условиях здоровой экологической обстановки, так и при возникновении и ликвидации чрезвычайных техногенных или природных ситуаций, когда законодательно предусмотрено вынесение мотивированного постановления об ограничении или запрещении использовать бактериально заражённые водные объекты в целях питьевого, хозяйственно-бытового водоснабжения, купания, занятий спортом, отдыха и в лечебных целях, состоит в незамедлительном обеспечении населения качественной для потребления водой [1].
Обеспечить целенаправленное проведение экстренных предупредительных и защитных мероприятий в районе предполагаемого или реального бактериального заражения возможно только при наличии полной и достоверной информации о сложившейся санитарно-эпидемиологической обстановке, опасность которой в экспрессном режиме должна быть оценена неспецифической разведкой, проводимой подразделеними РХБЗ формирований МЧС России.
Исследования различных современных методов индикации микробной фазы в окружающей среде убедительно обосновали все преимущества использования хемилюминесцентного анализа и перспективность его дальнейшего совершенствования не только из-за возможности обнаружения в водной пробе бактериологической составляющей без последующей групповой и специфической идентификации микроорганизмов, но и по исключительной пороговой чувствительности метода, экспрессности проведения анализа и низкой стоимости технических средств [2, 3].
Несмотря на то, что в настоящее время разработаны санитарные требования и принципы са-нитарно-бактериологической разведки, сформированы соответствующие производственные структуры, приняты на оснащение соответствующие приборы, силами МЧС России в полном объёме не обеспечивается выполнение предъявляемых требований по выявлению обстановки по оценке уровня бактериальной заражённости различных элементов окружающей среды. Главная причина состоит в несовершенстве технических средств биологической разведки.
Подразделения РХБЗ в своей работе имеют единственное войсковое техническое средство -автоматический сигнализатор АСП-13 для обнаружения аэрозольных специальных примесей, который не обеспечивает высокочувствительного обнаружения не только биологических аэрозолей на фоне различных мешающих примесей, но и не позволяет количественно оценить уровень её бактериального заражения. Прибор имеет малое быстродействие при крайне низкой степени его оперативной готовности и информативности [4].
Однако, используя приборную приставку «Волна» совместно с АСП-13, удалось в экспериментальном порядке установить влияние микробиологического компонентного состава на кинетику хемилюминесцентной люминольной реакции с построением кинетических кривых реакций с качественной оценкой присутствия или практического отсутствия вирусно-риккетсной области наряду с бактериальной областью в двухмерном пространстве регистрируемых признаков - каталитической активности микробиоты и времени достижения максимума хемилюминесцентной реакции. С практической стороны обеспечения бактериологической безопасности населения результаты указанных исследований не дают нормированных оценок потребительского качества воды, что, в свою очередь, не позволяет аргументированно давать разрешения или вводить ограничения на отдельные виды водопользования.
В Академии гражданской защиты МЧС России в учебном процессе используется малогабаритный переносной макетный прибор - анализатор жидких проб ОСЕ-2 и его модификация ЛИК, в основу работы которых положена регистрация энергии световыхода фотонов при реакции взаимодействия исследуемой капли воды и рабочего люминольного раствора (люминолозависимая хе-милюминесценция), что аналогично работе прибора АСП. На кафедре «Химии и материаловедения» разработана методика проведения лабораторной работы по определению общего количества бактерий в дистиллированной воде на основе прибора ОСЕ-2 [5]. При изучении научно-практической эффективности и значимости указанного экспрессного аналитического метода на приборе ОСЕ-2 были установлены существенные недостатки, которые в основном свойственны прибору АСП-13.
Как известно, любая проба воды, взятая из водоисточников окружающей среды, представляет собой сложную многокомпонентную систему массы веществ различного физико-химического состава и состояния, живой и неживой природы (рис. 1) [6].
По своему составу регистрируемый выход хемилюминесцентной реакции люминола с пробой натуральной воды является многокомпонентным, т. е. отражающим в общем потоке фотонов реакции всех без исключения прореагировавших различных веществ, находящихся в воде: тончайших механических взвесей и эмульсий, микропланктона, всего многообразия микробной фазы, растворов органических и неорганических химических соединений (рис. 1).
ВЕЛИЧИНА СВЕТОВЫХОДА Доля участия компонента в реакции КОМПОНЕНТЫ В ВОДНОЙ пробе, дающие ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНУЮ РЕАКЦИЮ
МИКРОПЛАНКТОН (МИКРОФЛОРА, МИКРОФАУНА) механические взвеси, эмульсии
МИКРОБНАЯ ФАЗА Полный состав Общее микробное содержание (кл/мл)
ОБЩЕЕ МИКРОБНОЕ ЧИСЛО (ОМЧ КОЕ/мл) (санитарно-показательное)
ХИМИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ Органические соединения Неорганические соединения
Рис. 1. Интегральный характер потока световыхода хемилюминесцентной реакции пробы воды
Вклад каждой из перечисленных фаз в общем спектре люминесцентной реакции зависит от его вида и процентного содержания в воде, что в свою очередь определяется как генезисом воды (поверхностная, подземная), так и особенностями появления и развития очагового бактериального загрязнения (естественно-природного или антропогенно-техногенного).
Вполне очевидно, что величина диагностирующего санитарного показателя пригодности воды для потребления по степени её бактериального загрязнения - значение ОМЧ КОЕ/мл - хеми-люминесцентным методом не может быть определена напрямую с помощью анализатора жидких проб ОСЕ-2.
Для решения экспериментальной задачи с целью подбора и испытания надёжного способа пробоподготовки исследуемой воды так, чтобы в экспрессном режиме основного процесса хемилю-минесцентного анализа возможно было удалить из этой пробы всю микробиоту, т. е. микропланктон и микробную фазу, оставив в фильтрате только различные растворы, была реализована программа ультрафильтрации проб воды через трековые мембраны № 5 и 7 с параллельным определением на тех же пробах воды нормативных классификационных значений санитарных бактериологических показателей ОМЧ КОЕ/мл и БГКП КОЕ/мл методом посева на питательных средах.
В процессе исследований методом хемилюминесценции оценивалась как общая величина световыхода, так и световой поток на каждом этапе фильтрации через различные мембранные фильтры. Определялась эффективность разных режимов фильтрации.
Для экспериментальной работы в полевых условиях были отобраны в самом центре европейской части России (в районе Московской области) 15 проб воды из поверхностных водоисточ-ноков (пруды, ручьи, реки, водохранилище) и из подземных водоисточников (родники из горизонтов подземных вод, колодцы грунтовых вод, скважинные водозаборы).
Дополнительно были приготовлены ещё 2 пробы воды: № 1 - кипячёная городская водопроводная вода в качестве базисного эталона для всей серии экспериментов и № 7 - дистиллированная вода с разведёнными в ней пищевыми дрожжами (табл. 1).
Таблица 1
Сведения по исследованным пробам воды
Номер пробы воды Сведения о водоисточнике Сведения о воде
1 Городская водопроводная кипячёная вода Эталонный замер, «очень чистой» воды
2 Родник из подземных вод в межморенных песках Родник каптирован, вода разбирается как «особо чистая»
3 Родник из подземных вод в межморенных песках Родник каптирован, вода разбирается как «особо чистая»
4 Родник из подземных вод в межморенных песках Родник каптирован, вода «особо чистая», с сильным привкусом железа
5 Вода из скважины в известняках Вода нехлорированная, «особо чистая»
6 Колодезная вода из горизонта грунтовых вод Вода разбирается как «особо чистая»
7 Дистиллированная вода с разведёнными в ней пищевыми дрожжами Раствор мутный, с белым оттенком
8 Яхромское водохранилище канала им. Москвы Вода прозрачная, без видимых взвесей
9 Дмитровский пруд рыбного хозяйства Вода прозрачная, без видимых взвесей
10 Сходненский пруд форелевого хозяйства Вода прозрачная, без видимых взвесей
11 Проточный городской пруд в зоне отдыха Вода прозрачная, без видимых взвесей
12 Внутригородской ручей Вода слабо мутная, бесцветная, с мельчайшей взвесью
13 Внутрипоселковый ручей Вода прозрачная, бесцветная, с мельчайшей взвесью
14 Река Сходня в микрорайоне Тушино г. Москва Вода прозрачная, бесцветная, с редкой мельчайшей взвесью
15 Река Москва в районе Строгино Вода прозрачная, без видимых взвесей
16 Сточные воды Дмитровского рыбооткор-мочного пруда Вода прозрачная, бесцветная, с мельчайшей взвесью
17 Сточные сбросные канализационные воды в ручей Вода слабо мутная, бесцветная, с мельчайшей взвесью
Основной природный химический состав вод опробованных водоисточников слабоминерализованный, гидрокарбонатно-кальциевый, незначительно хлоридно-сульфатно-натриевый. В редких местах в подземной воде отмечается высокое содержание ионов железа (проба воды № 4).
Результаты экспериментальных работ по бактериологическим анализам проб воды из различных водоисточников после фракционного разделения их состава приведены в табл. 2.
Результаты замеров световыхода хемилюминесцентной реакции исследуемой воды У0) и образовавшихся её фильтратов в процессе тонкой фильтрации У и ультрафильтрации У2), полученные впервые в области люминолозависимой хемилюминесценции для оценки бактериальной заражённости воды, подтверждают эффективность разработанного фильтрационного метода разделения общего потока замеренного световыхода реакции исследуемой пробы воды с люминолом на три раздельные части в соответствии с относительным объёмом (в процентах) каждой из трёх дис-
персных фаз, составляющих природный водный раствор: микропланктона с микровзвесями (А), микробной части (В) и химических растворов органических и неорганических соединений (С).
Расчёты величины процентного содержания каждой из этих фаз выполнены по следующим формулам, а результаты расчётов приведены в табл. 3.
1. По замеренным значениям световыхода хемилюминесцентной реакции:
а) Jo = JА + Jв + Jc ;
б) Jl = Jв + Jc ;
в) J2 = Jc .
2. По относительному объёму дисперсных фаз в пробе воды:
а) фазы А - микропланктона с микровзвесями - (10 - Jl) : J0 ;
б) фазы В - бактериальной - (I - J2) : J0 ;
в) фазы С - химических растворов - J2 : J0 .
Таблица 2
Результаты экспериментальных работ по бактериологическим анализам проб воды
Бактериальные свойства воды
Бактериальная загрязнённость по люминесцентной реакции (условные единицы) Бактериальный состав воды (санитарные показатели)
Применение мембранных фильтров
Номер пробы Исследуемая вода Фильтрат исследуемой воды Фильтрат исследуемой воды после фильтра № 7 иМЧ, КиЕ/мл (БГКП, КОЕ/мл) по посевам
воды после фильтра № 5 на питательных средах
Величина Величина Величина Натуральная вода После После
световыхода То световыхода световыхода 12 фильтра № 5 фильтра № 7
1 240 - - - - -
2 244 240 232 32 (0) 5 (0) 0(0)
3 264 262 256 29 (0) 1 (0) 0 (0)
4 4350 - - 12 (0) 3 (0) 0 (0)
5 246 230 220 10 (0) 0 (0) 0 (0)
6 232 228 224 34 (0) 4 (0) 0 (0)
7 2900 - - - - -
8 1070 892 334 384 (30) 219 (10) 58 (4)
9 2180 1216 136 3027 (160) 172 (50) 140 (8)
10 1920 - - 1350 (20) - -
11 5700 - - 1460 (200) - -
12 5040 - - 1520 (200) - -
13 4350 - - 1540 (20) - -
14 4850 - - 1780 (220) - -
15 4100 - - 1430 (80) - -
16 17500 8064 1376 6060 (350) 1750 (270) 780 (180)
17 41870 - - 3700 (800) - -
Достоверность и практическая точность получаемых результатов на основе предлагаемого экспрессного способа определения микробного загрязнения водной среды была проверена сравнением этих результатов с результатами параллельных определений в лабораторных условиях клас-
сификационных санитарных показателей качества воды по общему микробному числу колониеоб-разующих единиц (ОМЧ КОЕ /кл).
Основное содержание усовершенствованного экспрессного способа определения микробного загрязнения водной среды, не имеющего аналога, может быть взято в основу разработки индикационного прибора бактериологической разведки нового поколения, непосредственное применение которого в практической деятельности аварийно-спасательных подразделений МЧС России и гражданских организаций гражданской обороны может быть использовано в штатной «Мобильной станции обеззараживания локальных источников и труднодоступных объектов для снижения риска опасного воздействия химических и биологических факторов» («МСОЛИ»), в оснащении звеньев ветеринарной, фитопатологической и инженерной разведки ГО [7].
Таблица 3
Результаты расчётов процентного содержания дисперсных фаз
Номер пробы воды Величина световыхода Доля участия каждого компонента в регистрируемом световыходе (%) Классификационный санитарный показатель ОМЧ КОЕ/мл натуральной воды
По методу мембранных фильтров
Микропланктон, взвеси Микробная фаза Химические растворы
1 240 - - - -
2 244 1.6 3.3 95.1 32
3 264 0.8 2.3 97.0 29
4 4350 - - - -
5 246 6.5 4.1 89.4 10
6 232 1.7 1.7 96.6 34
7 2900 - - - -
8 1070 16.6 52.1 31.2 384
9 2180 44.2 49.5 6.2 3027
13 4350 - - - -
16 17500 53.9 38.2 7.9 6060
17 41870 - - - -
Полученные результаты исследований позволили обратиться в РОСПАТЕНТ ФГУ ФИПС с заявкой на получение патента на разработанный экспрессный метод (Регистрационный номер 2011127927 от 08.07.2011 г.).
Литература
1. Федеральный закон Российской Федерации от 30 марта 1999 года № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения». - М.: ИНФРА-М, 2002. - 40 с.
2. Левчук М.Н. Аналитические системы выявления биологической обстановки. Часть I. Технические средства неспецифической биологической разведки и контроля. - М.: ВУ РХБЗ, 2000.
3. Кармишин А.Ю. Экспрессная методика частичной групповой идентификации микроорганизмов. -М.: ВУ РХБЗ, 2006.
4. Автоматический сигнализатор для обнаружения аэрозолей специальных примесей АСП. Техническое описание и инструкция по эксплуатации 5И2.845.014 ТО, 1990.
5. Козловская Э.Б. Физико-химические и физические методы анализа. Лабораторные работы, под ред. Пушкина И.А. - Новогорск: Академия гражданской защиты, 1999. - 146 с., ил.
6. Трифонов К.И., Девисилов В.А. Физико-химические процессы в техносфере. - М.: ФОРУМ - ИН-ФРА-М, 2010. - 236 с., ил.
7. Методические указания по созданию гражданских организаций гражданской обороны. - М.: МЧС России, ВНИИ ГОЧС, 2000.
