CC BY
61
оригинальные статьи УДК616.15-092.9-074:615.3.099:546.48
Е.В. Барышева
СОСТЯНИЕ ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ И КОРРЕКЦИИ ЭНДОТОКСИКОЗА
РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА
Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России, Кафедра общей и клинической патофизиологии.
Россия, г. Краснодар, ул. Седина, 4. Е-mail: [email protected]
Цель: оценить влияние воды с модифицированным изотопным D/H составом с пониженным содержанием дейтерия на прооксидантно-антиоксидантную систему и функциональную систему детоксикации при экспериментальном моделировании эндогенной интоксикации у лабораторных животных с различным первичным механизмом развития: продукционным, резорбционным, ретенционным.
Материалы и методы: были проведены эксперименты по формированию окислительного стресса с различным первичным механизмом развития (экспериментальный аллоксановый диабет), экспериментальное моделирование хронического абсцесса, хронический эндотоксикоз гепаторенального генеза, а также была изучена интенсивность реакций изотопного обмена (D/H) в плазме и тканях органов систем детоксикации.
Результаты и выводы: с помощью экспериментального моделирования у животных эндогенной интоксикации продемонстрированы различия в эффективности пищевого рациона, включающего воду с модифицированным изотопным составом с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm), при коррекции нарушений в работе прооксидантно-антиоксидантной и детоксицирующей систем в зависимости от первичного механизма развития эндотоксикоза.
Ключевые слова: эндотоксикоз, дейтерий, прооксидантно-антиоксидантная система.
Журнал фундаментальной медицины и биологии
E.V. Barisheva
STATUS OF THE PROOXIDANT-ANTIOXIDANT SYSTEM IN RATS DURING MODELING AND CORRECTION OF VARIOUS GENESIS
ENDOTOXEMIA
Kuban State Medical University, Department of General and Clinical Pathophysiology.
4 Sedina st., Krasnodar, Russia. Е-mail: [email protected]
Purpose: to evaluate the effect of water with a modified isotope D/H composition with depleted deuteriumonprooxidant-antioxidant system and detoxification system function in experimental modeling of endogenous intoxication in laboratory animals with different primary mechanism of development: a production, resorption, retention.
Materials and Methods: the experiments were conducted on the formation of oxidative stress with different primary mechanism for the development (experimental alloxan diabetes), experimental modeling of chronic abscess, chronic endotoxemiahepatorenal genesis and has been studied intensity of isotope exchange reactions (D/H) in plasma and tissues of detoxification systems.
Results and conclusions: Using experimental modeling endogenous toxicity in animals we demonstrated differences in dietary intake efficiency comprising water with modified isotopic composition (40 ppm), while correcting disturbances in antioxidant-prooxidant and detoxifying systems depending on the primary mechanism development of endotoxemia.
Keywords: endotoxemia, deuterium, prooxidant-antioxidant system..
Значительный вклад в развитие и прогресси-рование многих патологических состояний вносит повышение интенсивности свободнорадикального окисления (СРО), что может быть также связано с поступлением в организм различных экологически неблагоприятных факторов, в том числе ионов тяжелых металлов, содержание которых нередко повышено в промышленных регионах с развитой транспортной инфраструктурой. Усиленное образование свободных радикалов и реактивных молекул приводит к повреждению клеточных структур, и сопровождается повреждением нуклеиновых кислот, деформацией мембранных липопротеино-вых комплексов клеточных мембран, изменением физико-химических свойств и активности мембра-носвязанных ферментов, в частности ионных каналов, вызывая необратимые изменения в тканях и органах [1].
Одной из главных составляющих неспецифической защиты от свободнорадикального окисления является антиоксидантной система, представленная ферментным и низкомолекулярным звеньями и участвующая в поддержании физиологического баланса прооксидантных и антиоксидантных факторов в организме.
Усиление свободнорадикальных процессов в условиях патологии приводит к нарушению существующего в физиологических условиях баланса между антиоксидантными и прооксидантными системами с преобладанием прооксидантных факторов, которые начинают оказывать повреждающее действие на молекулярном и клеточном уровне, что сопровождается комплексом типовых патологических изменений в органах и тканях, называемых термином «окислительный стресс» [2]. Одновременно с развитием окислительного стресса в организме часто происходит усиление распада биологических субстратов, что приводит к накоплению эндотоксических субстанций и формированию синдрома эндогенной интоксикации (СЭИ).
Эндогенная интоксикация как стадийный процесс имеет определенные особенности в зависимости от инициирующего ее фактора на самых ранних стадиях своего развития, но по мере развития вторичной аутоагрессии приобретает универсальный характер [3].
Экспериментальное моделирование на животных СЭИ, позволяет выявить реакцию основных систем организма на накопление эндотоксических субстанций в биологических жидкостях, определить связанные с этим ведущие патобиохимические изменения в организме. Такой подход повышает эффективность разрабатываемых и применяемых в дальнейшем способов коррекции нарушений метаболизма при СЭИ, в том числе позволяет индивидуализировать лечебные и профилактические мероприятия в зависимости от первичного механизма развития СЭИ.
Одним из перспективных способов коррекции антиоксидантного потенциала организма является потребление воды с модифицированным изотопным D/H составом (ВМИС) с пониженным
содержанием дейтерия (ССД). Изотополог воды 1H216O, образованный лёгкими стабильными изотопами входящих в его состав элементов, содержание которого в природной воде составляет 99,73—99,76 мол.% (молекулярных процента). Как моноизотопная композиция, 1H216O является предельным случаем изотопной чистоты, которой в естественных условиях не существует. Для ее получения ведут тонкую многостадийную очистку природных вод или синтезируют из исходных элементов 1H2 и 16O. В тоже время природная вода представляет собой многокомпонентную смесь изотопологов, где на 106 молекул воды в среднем содержится 311 молекул 1HD16O. Весовые количества изотопологов в природной воде рассчитаны на основании данных прямого определения их содержания методом молекулярной спектроскопии. Концентрация молекул воды, содержащих тяжёлые изотопы водорода, в природной воде колеблется в пределах, зафиксированных в основном международном стандарте изотопного состава гидросферы — SMOW (StandardMeanOceanWater), который определен по изотопному составу глубинной воды Мирового океана и содержание дейтерия в такой воде составляет 155,76 ррт.ВМИС ССД в условиях формирования в организме окислительного стресса и СЭИ способна приводить к уменьшению интоксикации и повышению анти-оксидантного потенциала органов и тканей [4-7]. Введение в пищевой рацион больных с эндогенной интоксикацией ВМИС ССД может ускорять реакции изотопного обмена, стимулируя тем самым органы функциональной системы детоксикации (печень, почки) за счет влияния на термодинамические и термокинетические показатели макромолекул (прежде всего, белков, нуклеиновых кислот), изменяя скорость биохимических процессов в клетке[8].
Таким образом, изучение функциональной активности прооксидантно-антиоксидантной системы при формировании в организме эндогенной интоксикации с различным первичным механизмом развития (продукционным, резорбционным и ретенционным) позволит расширить представления о роли нарушений окислительного метаболизма в их патогенезе, а также сделает возможным изучение эффективности корригирующих мероприятий, осуществляемых с помощью реакций изотопного D/H обмена, при моделируемых патофизиологических состояниях.
Цель исследования — оценить влияние воды с модифицированным изотопным D/H составом с пониженным содержанием дейтерия на проокси-дантно-антиоксидантную систему и функциональную систему детоксикации при экспериментальном моделировании эндогенной интоксикации у лабораторных животных.Установить особенности изменения биохимических показателей, характеризующих уровень окислительного стресса, во время формирования эндогенной интоксикации с различным первичным механизмом развития: продукционным, резорбционным, ретенционным.
Материалы и методы
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с требованиями Приказа МЗ РФ № 267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики», требованиями Приказа МЗ СССР № 742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и №2 48 от 23.01.85г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».
Были проведены эксперименты по формированию окислительного стресса с различным первичным механизмом развития (экспериментальный аллоксановый диабет (продукционный), экспериментальное моделирование хронического абсцесса (резорбционный), хронический эндотоксикоз(ХЭТ) гепаторенального генеза(ретенционный), для определения влияния ВМИС ССД на показатели прооксидантно-анти-оксидантного баланса и биохимических показателей при ХЭТ и в норме, а также была определена (изучена) интенсивность реакций изотопного обмена ^/Н) в плазме и тканях органов систем детоксикации.
Эксперименты были выполнены на крысах-самцах линии Вистар в возрасте 4-6 месяцев (масса тела 240+50 г, колебание массы тела по группе +10 г). Все животные содержались в виварии при сходных условиях в отношении температуры, влажности, освещения, а также получали одинаковый пищевой рацион. Лабораторные крысы находились в виварии при температуре воздуха от +20 до +22 °С, влажности — не более 50%, в световом режиме — день-ночь. Животных размещали в одинаковых пластиковых клетках и содержали на стандартном рационе (крупа, мясо и овощи). Состояние крыс до начала эксперимента было в границах физиологической нормы: животные были активны, мышечный тонус в удовлетворительном состоянии; шерсть гладкая, блестящая; кожный покров чистый, эластичный; видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, без признаков воспалительных реакций; аппетит хороший; мочеиспускание и дефекация без нарушений.
Наблюдение за состоянием лабораторных животных проводилось в течение всего эксперимента. Ежедневно, примерно в одно и то же время, до кормления животных производился клинический осмотр, взвешивание животных и определение объема потребления ВМИСС ССД (в расчете на одну крысу), кроме того проводилось наблюдение за физической активностью животных, их аппетитом, характером кала.
Сохранность животных во всех экспериментах -100%.
При изучении влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на изотопный D/H состав и состояние прооксидантно-антиоксидантно-го баланса плазмы крови и лиофилизированных тканей внутренних органов функциональной си-
стемы детоксикации животные были разделены 2 группы. Первую группу составили крысы (n = 15), потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ppm), вторую группу составили крысы (n= 15), потребляющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия 40 ррт.Для оценки динамики изменения изотопного состава плазмы крови и лиофилизированных тканей внутренних органов функциональной системы детоксикации проводили определение этих показателей до начала эксперимента, а также через 15, 30 после изменения питьевого рациона, в связи с чем выполнялся забой 5 крыс в каждой группе в соответствующие сутки эксперимента согласно методике, изложенной в [9].
При изучении влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на изотопный D/H состав и состояние прооксидантно-антиоксидант-ного баланса плазмы крови и лиофилизирован-ных тканей внутренних органов функциональной системы детоксикации проводили сравнение показателей у животных в группах: 1 — крысы, потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ppm, контроль); и 2 — крысы, потребляющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (подгруппа 40 ppm) с аналогичными показателями в опытных группах с экспериментальным эндотоксикозом различного генеза, в связи с чем животные опытных групп были разделены на 6 групп:
группа 3 — крысы (n=15), потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ppm), у которых путем введения аллоксана (в дозе 17 мг/100 г внутрибрюшинно однократно) была создана модель экспериментального сахарного диабета (продукционный первичный механизм развития эндогенной интоксикации);
группа 4 — крысы (n=15), потребляющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm), у которых путем введения аллоксана (в дозе 17 мг/100 г внутрибрюшинно однократно) была создана модель экспериментального сахарного диабета (продукционный первичный механизм развития эндогенной интоксикации);
группа 5 — крысы (n=15), потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ppm), у которых путем введения в рану культуры патогенного штамма была создана модель экспериментального хронического абсцесса (резорб-ционный первичный механизм развития эндогенной интоксикации);
группа 6 — крысы (n=15), потребляющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm), у которых путем введения в рану культуры патогенного штамма была создана модель экспериментального хронического абсцесса (резорбционный первичный механизм развития эндогенной интоксикации);
группа 7 — крысы (п=15), потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ррт), у которых путем введения водного раствора хлорида кадмия была создана модель хронического эндотоксикоза гепаторенального генеза (печеночной и почечной недостаточности, соответствующие ретенционному первичному механизму развития эндогенной интоксикации);
группа 8 — крысы (п=15), потребляющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (40 ррт), у которых путем введения водного раствора хлорида кадмия была создана модель хронического эндо-токсикоза гепаторенального генеза (печеночной и почечной недостаточности, соответствующие ретенционному первичному механизму развития эндогенной интоксикации).
Забор крови и органов у животных в группах 3 и 4 производили на 30-й день после моделирования аллоксанового диабета. Забор крови и органов у животных в группах 5 и 6 производили на 15-й день после моделирования гнойной раны. Забор крови у животных в группах 7 и 8 проводили на 15-й день после начала эксперимента (промежуточный убой 14 животных) из каждой группы для определения биохимических показателей состояния органов функциональной системы детоксикации в группах 7 и 8. Через 21 день после моделирования эндотоксикоза оставшихся крыс в группах 7 и 8 оглушали и проводили измерение содержания дейтерия в плазме крови и органах системы детоксикации, а также оценивали состояние прооксидантно-анти-оксидантной системы и функциональной системы детоксикации.
При моделировании хронического абсцесса у крыс, использовали двухэтапную модель окислительного стресса. Первый этап представлял собой острую фазу окислительного стресса и моделировался путем создания межмышечного абсцесса в мягких тканях длинных мышц спины лабораторного животного с использованием имплантированного инородного тела. Второй этап отражал хроническую фазу окислительного стресса и моделировался гнойной раной, которая формировалась естественным образом при дренировании абсцесса и удалении инородного тела.
Основой модели окислительного стресса явилась известная модель раневого процесса, предложенная Л.А. Мамедовым, в модификации [10].
Моделирование эндогенной интоксикации гепа-торенального генеза осуществляли путем введения в пищевой рацион крыс раствора хлорида кадмия 200 мкг/100 г/сутки в течение 21 дня.
Воду с пониженным содержанием дейтерия получали на установке, разработанной в Кубанском государственном университете по методике [11] в модификации [12] с исходной концентрацией дейтерия в получаемой воде 40 ррт (по дейтерию). Минерализацию полученной воды, производили путем добавления минеральных солей для получения физиологически полноценного минерального состава (минерализация 314-382 мг/л: гидрокарбонаты 144-180 мг, сульфаты менее 1 мг, хлориды 60-76 мг, кальций: 6 мг, магний: 3 мг, натрий 50-
58 мг, калий 50-58 мг), который был идентичен у воды с содержанием дейтерия 40 ррти 150 ppm (по дейтерию).
Перед забором биосубстратов животных оглушали в камере для эвтаназии фирмы VetTech с помощью углекислого газа. После чего производили забор крови из желудочков сердца для исследований и выполняли патологоанатомическое вскрытие крыс с визуальным осмотром внутренних органов. После этого осуществляли изучение изотопного состава в плазме крови и лиофилизиро-ванных органах и определяли показатели проок-сидантно-антиоксидантного баланса (спонтанная и Н202-индуцированная хемилюминесценция, суммарная антиокислительная емкость крови, ТБК-реактивные продукты (малоновыйдиальдегид, диеновые конъюгаты), SH-группы) и функциональную систему детоксикации (молекулы средней и низкой массы, АСТ, АЛТ, альбумин, билирубин, креати-нин).
Количество свободных SH-групп определяли по методике [13], основанной на взаимодействии 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислоты с SH-группами, в результате чего образуется окрашенное соединение (тио-2-нитробензойная кислота). Полученный раствор тионитрофенильного аниона обладает специфическим поглощением при длине волны 412 нм, что позволяет определять количество SH-групп в гемолизате. Результаты выражали в мкмолях на грамм гемоглобина (мкмоль/ г Hb).
Определение базального количества ТБК-реактивных продуктов в эритроцитах проводили по методике [14], основанной на оценке уровня продуктов окислительной модификации, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), и последующем определении тиобарбитурового числа эритроцитов (ТБЧэр.), которое рассчитывали и выражали в оптических единицах.
Определение количества продуктов окислительной модификации в плазме проводили по методике
[15], основанной на оценке окисленно-модифици-рованных продуктов в плазме, по реакции с ТБК. Тиобарбитуровое число плазмы (ТБЧпл).
Определение количества молекул средней и низкой массы (МСиНМ) в эритроцитах и плазме проводили, после осаждения с помощью 28-% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугирования высокомолекулярных соединений, в следующем интервале длин волн: от 238 до 306 нм (с шагом длины волны 4 нм), с последующим расчетом площади полученной фигуры на основании методики
[16]. Количество МСиНМ эритроцитов и плазмы пропорциональное полученной площади, выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.).
Интенсивность процессов свободнорадикально-го окисления в плазме крови определяли с помощью способа [17].Полученные результаты выражали в виде площади (ХЛпл) и максимума вспышки (ВХЛмакс) хемилюминесценции, в условных единицах в сравнении с контролем (раствором люми-нола).Интенсивность СРО в тканях органов функциональной системы детоксикации определяли с помощью спонтанной хемилюминесценции (ХЛ) на хемилюминометре «Lum-5773» (Россия), с исполь-
зованием лицензионного программного обеспечения PowerGraph 3.3.
Определение суммарной антиоксидантной активности (САОА) плазмы крови с помощью ам-перометрического метода, заключается в измерении электрического тока, который возникает при окислении исследуемого субстрата (субстратов) на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале и сравнении полученного сигнала, регистрируемого при помощи амперометрическо-го детектора Яуза-АА-01, с калибровочным стандартом, измеренным в одинаковых условиях [18]. Полученные результаты выражали в мг/л раствора аскорбиновой кислоты.
Интегральную оценку выраженности эндоток-сикоза проводили на основании способа [19], основанного на суммарной оценке уровня МСиНМ и ТБЧ эритроцитов и плазмы, с определением индекса эндогенной интоксикации (ИЭИ).
Биохимическое исследование проб крови проводили на полностью автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе Abacusjuniorvet 2.7 (DiatronMesstechnikGmbH, Австрия), используя наборы реактивов компании Diatron. Биохимические исследования проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BioChem SA (USA), используя наборы реактивов HighTechnology (USA). В качестве лабораторно-биохимических показателей, отражающих токсическое поражение печени и почек, в плазме крови крыс определяли следующие показатели: креати-нин, билирубин общий, аспартатаминотрансфераза (АсАт), аланинаминотрансфераза (АлАт), альбумин, мочевину, глюкозу.
Результаты
В результате эксперимента при использовании в питьевом рационе лабораторных животных ВМИС ССД 40 рртустановлено достоверное снижение содержания дейтерия в биологических жидкостях и тканях организма. При использовании воды с содержанием дейтерия 40 ppm в течение15 дней наблюдалось снижение содержания дейтерия в плазме крови у крыс в группе 2 (M+m, p — дано в сравнении с показателями данной группы в начале эксперимента), до 107,6+0,6 ррт (p<0,05), т.е. на 29,8%, а на 30 день эксперимента уровень дейтерия составил 100,9+0,4 ррт (p<0,05), т.е. на 34,1 %.
При употреблении животными воды с содержанием дейтерия 40 ppm определялось снижение уровня дейтерия через 15 дней в лиофилизиро-ванной ткани сердца на 6,9%, через 30 дней - на 12,3%, в лиофилизированной ткани печени на 5,2% и 6,1% соответственно, в лиофилизированной ткани почек уровень дейтерия снизился на 10,2% через 15 дней и 13,6% через 30 дней.
Данные изменения свидетельствуют об интенсивных реакциях изотопного обмена между жидкими средами организма и биологическими молекулами в тканях. При этом в тканях наблюдается более высокий уровень дейтерия (в среднем на 11- 14%), чем в плазме, что связано с небольшой скоростью
реакций обмена изотопов водорода в физиологических условиях. Кроме того, на изотопный обмен в тканях более существенное влияние оказывает потребляемая пища, чем вода [20].
При моделировании аллоксанового диабета у крыс наблюдали повышение уровня глюкозы в 2,2 раза, сопровождающееся возрастанием активности ферментов, характеризующих цитолитические процессы (АСТ, АЛТ), увеличением концентраций креатинина, билирубина и мочевины (табл. 1). При этом по данным хемилюминесценции было выявлено достоверное усиление интенсивности процессов свободнорадикального окисления в крови (на 73,2%, р<0,05) и внутренних органах: сердце (на 58,4%), печени (на 32,9%), почке (на 9,3%).
На фоне столь выраженных метаболических нарушений выявлен значительный дисбаланс функционирования прооксидантно-антиоксидантной системы у крыс в группе 3, который характеризовался повышением: количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в плазме крови на 81,2%; базального количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в эритроцитах на 35,7%; количества продуктов окислительной модификации ^е2+-индуцированных) в эритроцитах на 64,0%, что превышало аналогичные показатели в группе 4 (табл. 1), получающей воду с пониженным содержанием дейтерия. В группе 4 аналогичные показатели, отражающие выраженность процессов пероксидации, были меньше, чем в группе 3 на 11,3% (количество продуктов окислительной модификации в плазме), 7,0% и 7,2% (базальное и Fe2+-индуцированное количество продуктов окислительной модификации соответственно в эритроцитах).
При этом было выявлено повышение интенсивности хемилюминесценции плазмы крови: максимума вспышки на 73,2% и 52,6% в группах 2 и 3 соответственно в сравнении с контрольной группой, тогда как суммарный показатель низкомолекулярного звена антиоксидантной системы плазмы, измеренный с помощью амперометрического метода, был снижен на 33,5% и 25,7% в группах 3 и 4 соответственно, что указывает на более существенный дисбаланс соотношения прооксидант-ных и антиоксидантных факторов у животных с аллоксановым диабетом, получавших воду 150 ррт (по дейтерию), в сравнении с крысами, потребляющими воду 40 ррт. Количество тиоловых групп у крыс с моделью аллоксанового диабета также было снижено на 32,1% и 29,3% в группах 3 и 4 соответственно, что подтверждает нарушение регенерации низкомолекулярных антиоксидантных факторов у крыс в этих группах в условиях окислительного стресса, обусловленного развитием аллоксаново-го диабета. Это также характеризовалось резким увеличением интегрального показателя КОМБэр до 15,51 ОЕА в группе 3, тогда как у крыс, получающих воду с пониженным содержанием дейтерия, этот показатель был на 15,2% ниже, что указывает на определенный протективный эффект снижения концентрации дейтерия при аллоксановом диабете.
Таблица 1
Биохимические показатели прооксидантно-антиоксидантной системы и функциональной системы детоксикации при экспериментальном сахарном диабете
Показатель Группа 1 Группа 3 Группа 4
АСТ, ед. акт 163,20+11,65 192,49+8,67* 182,71+9,60*
АЛТ, ед акт. 45,03+2,89 106,92+4,73* 97,64+3,28*
Альбумин, г/л 32,51+1,79 32,38+1,62 33,59+2,12
Билирубин, мкмоль/л 5,78+0,27 8,34+0,30* 8,29+0,17*
Креатинин, мкмоль/л 44,81+1,43 64,21+2,27* 62,81+0,93*
Мочевина, ммоль/л 6,89+0,34 9,08+0,41* 8,73+0,45*
Глюкоза, ммоль/л 5,84+0,25 12,91+0,63* 10,42+0,38*#
ТБЧпл., е.о.п. 0,260+0,012 0,471+0,023* 0,418+0,019*#
ТБЧэр, е.о.п. 0,501+0,027 0,680+,037* 0,632+0,034*
ТБЧэр.-инд., е.о.п. 0,608+0,033 0,997+0,053* 0,925+0,051*
ХЛ, печень 0,283+0,004 0,376+0,010* 0,379+0,013*
ХЛ, почка 0,419+0,005 0,458+0,009* 0,422+0,005#
ХЛ, сердце 0,221+0,003 0,350+0,007* 0,297+0,004*#
ВХЛмакс, усл. ед. 1,993+0,065 3,452+0,113* 3,041+0,106*#
ХЛпл, усл. ед. 2,597+0,086 5,176+0,171* 4,584+0,150*#
САОА, мг/л 1,030+0,034 0,685+0,022* 0,765+0,024*#
SH-гр., мкмоль/ г НЬ 0,287+0,006 0,195+0,008* 0,203+0,004*
МСиНМэр., е.о.п. 4,035+0,215 5,792+0,382* 5,286+0,349*
МСиНМпл., е.о.п. 2,917+0,076 4,843+0,126* 4,614+0,120*
ИЭИ, % ГК 0,19+5,08 129,34+14,45* 94,25+12,27*
КОМБэр, ОЕА 0,08+0,71 15,51+1,09* 13,16+1,01*
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с показателями группы 1 (контрольная); # - р<0,05 по сравнению с показателями 3-й группы.
Интегральный показатель функционирования низкомолекулярного звена прооксидантно-антиок-сидантной системы (коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов) в группе 3 был на 17,9% выше, чем у крыс в группе 4, что подтверждает перспективность использования воды с пониженным содержанием дейтерия при комплексной коррекции нарушений в работе анти-оксидантной системы, наблюдающихся при развитии диабета. При этом наблюдалось уменьшение индекса эндогенной интоксикации в группе 4 на 27,1% в сравнении с показателями группы 3, что указывает на повышение функциональной активности органов детоксицирующей системы у крыс, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия.При этом интегральный показатель ИЭИ в группе 3 возрастал на 129,3% ГК, тогда как у крыс, получающих воду с пониженным содержанием дейтерия, его значения были на 35% ГК ниже, что указывает на увеличение функциональной активности детоксицирующей системы при введении в пищевой рацион воды с пониженным содержанием дейтерия.
Таким образом, полученные данные, характеризующие состояние прооксидантно-антиокси-дантной системы свидетельствуют о значимой роли дисбаланса в ее работе при развитии метаболических нарушений у крыс с аллоксановым диабетом, в том числе и при формировании патологических изменений в органах детоксикации. При этом отмечено корригирующее влияния воды с понижен-
ным содержанием дейтерия (40 ррт) на состояние как прооксидантно-антиоксидантной, так и детоксицирующей систем у крыс с аллоксановым диабетом, что позволяет рекомендовать применение реакций изотопного обмена при комплексной коррекции нарушений метаболизма, связанных с недостаточностью инсулина. В целом применение в комплексном лечении воды с пониженным содержанием дейтерия позволило уменьшить выраженность нарушений в работе антиоксидантной системы и снизить интенсивность процессов сво-боднорадикального окисления в крови и тканях внутренних органов, что сопровождалось менее значимым накоплением эндотоксических субстанций в плазме крови.
Было изучено влияние ВМИС ССД 40 ррт на уровень изотопного обмена в биологических жидкостях и тканях и на состояние АОС у крыс при формировании у них хронического абсцесса (ре-зорбционный механизм ХЭТ). Наиболее выраженное снижение уровня дейтерия в плазме наблюдалось у животных 6 группы, которое было ниже на 37,3% и 38,9% показателей 1 и 5 группы.
В данном эксперименте наблюдалось увеличение образования свободных радикалов и преобладание прооксидантных факторов над компонентами АОС. Известно, что изменение интенсивности индуцированной хемилюминесценции очень чутко реагирует на наличие АФК и продуктов СРО. Так у крыс в группе 5 с ХЭТ резорбционного генеза наблюдалось увеличение ХЛ по сравнению с ин-
тактными животными. Уровень ХЛ печени был увеличен на 23,3%, почек на 7,4%, сердца на 7,2%. Наиболее существенные изменения в печени говорят об ее активном участии в обезвреживании токсических субстанций, образующихся при гнойно-воспалительных процессах, в результате этого в гепатоцитахприсходит увеличение образования АФК и формирование ОС на тканевом и органном уровнях. При этом в группе 6 у животных, принимавших ВМИС ССД, значения ХЛ были достоверно ниже, так уровень ХЛ печени был увеличен только на 10%, а ВХЛ и ПХЛ на 36,6% и 60,7 % соответственно. Более низкий уровень проокси-дантных показателей у животных 6 группы можно объяснить более продуктивной работой тканевых компонентов эндогенной АОС, или более слабой токсической нагрузкой на их системы неспецифической защиты, в результате более быстрого обезвреживания в печени эндогенных токсических субстанций.
Значения ВХЛ и ПХЛ плазмы крови крыс в группе 5 были повышены на 53,4% и 84,5% соответственно. Более значимые изменения в плазме связаны с интегрирующей функцией крови как биологической жидкости. Преобладание проокси-дантных факторов также подтверждалось увеличением ТБЧ плазмы на 50,4 % у животных 5 группы и на 31 % в 6 группе, ТБЧ эритроцитов на 33% и 19 %, индуцированного ТБЧ эритроцитов на 52% и 46 % соответственно. То есть наблюдалось увели-
чение образования и накопления промежуточных и конечных продуктов окислительной модификации биомолекул во внеклеточной среде, кроме того, был значительно повышен уровень пероксидации клеточного звена (табл. 2).
Перегрузка АОС продуктами СРО и ПОЛ проявлялась в значительном снижении АОА у крыс в группе 5 (на 23,8%), при этом в группе 6 снижение АОА было менее выражено (на 8,7%). Также наблюдалось снижение SH-групп, являющихся ключевым показателем неферментативной АОС, на 14,6% в 5 группе и на 13,9% в 6 группе (табл. 2).
В результате развития острого патологического процесса наблюдается увеличение МСиНМ на эритроцитах (на 35,7% в 5 группе и 20,6% в 6 группе), то есть происходит увеличение сорбционной емкости и снижение проницаемости мембран глико-каликса, также наблюдается умеренное повышение МСиНМ в плазме (на 13,9% и на 10,3%) соответственно, то есть образование токсических компонентов превышает их элиминацию из организма. Такие изменения говорят о снижении потенциала эндогенной АОС, особенно ее низкомолекулярного звена, что может привести к развитию осложнений, а также различных повторных патологических процессов.
Также при использовании ВМИС ССД наблюдаются меньшие уровни билирубина (на 10,7%), креатинина (на 18,3%), мочевины (на 14,8%).
Таблица 2
Биохимические показатели прооксидантно-антиоксидантной системы и функциональной системы детоксикации при резорбционном первичном механизме эндотоксикоза
Показатель Группа 1 Группа 5 Группа 6
АСТ, ед. акт 163,20+11,65 174,51+12,45* 175,83+9,58
АЛТ, ед акт. 45,03+2,89 61,94+3,97* 65,41+4,19*
Альбумин, г/л 32,51+1,79 33,82+1,86 30,26+1,67
Билирубин, мкмоль/л 5,78+0,27 6,65+0,31 5,94+0,28
Креатинин, мкмоль/л 44,81+1,43 49,37+1,58* 40,33+1,29#
Мочевина, ммоль/л 6,89+0,34 7,52+0,37 6,41+0,32#
Глюкоза, ммоль/л 5,84+0,25 5,61+0,24 5,57+0,20
ТБЧпл., е.о.п. 0,260+0,012 0,391+0,023* 0,343+0,016*#
ТБЧэр, е.о.п. 0,501+0,027 0,669+0,042* 0,597+0,032*
ТБЧэр.-инд., е.о.п. 0,608+0,033 0,915+0,049* 0,880+0,047*
ХЛ, печень 0,283+0,004 0,349+0,008* 0,314+0,007*#
ХЛ, почка 0,419+0,005 0,450+0,011* 0,408+0,009#
ХЛ, сердце 0,221+0,003 0,237+0,008* 0,224+0,010
ВХЛмакс, усл. ед. 1,993+0,065 3,058+0,097* 2,716+0,089*#
ХЛпл, усл. ед. 2,597+0,086 4,792+0,158* 4,174+0,141*#
САОА, мг/л 1,030+0,034 0,784+0,021* 0,940+0,030*#
SH-гр., мкмоль/ г НЬ 0,287+0,006 0,239+0,010* 0,241+0,009*
МСиНМэр., е.о.п. 4,035+0,215 5,476+0,362* 4,869+0,321*
МСиНМпл., е.о.п. 2,917+0,076 3,324+0,087* 3,018+0,079#
ИЭИ, % ГК 0,19+5,08 90,59+12,35* 57,22+10,26*
КОМБэр, ОЕА 0,08+0,71 7,70+1,03* 6,88+0,97*
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с показателями группы 1 (контрольная); # - р<0,05 по сравнению с показателями 5-й группы.
В целом применение ВМИС ССД приводит к уменьшению интегральных показателей в большей степени ИЭИ (на 36,8%), который был повышен в группе 5 на 90,59 % ГК. При этом КОМБэр также снижался в группе 6, в сравнении с группой 5, на 10,6%, что подчеркивает тесную взаимосвязь про-оксидантно-антиоксидантного и детоксицирующе-го звеньев системы неспецифической защиты.
При проведении эксперимента у животных 7 и 8 групп отмечался резко выраженный специфический запах кожи, при отсутствии воспалительных признаков. Данный запах был обусловлен усиленным выделением продуктов метаболизма через кожу при данной патологии. При этом у животных контрольной группы, употреблявших ВМИС ССД подобного запаха не отмечалось. Кроме того, определялось угнетение в поведенческих реакциях с 10- 14 суток, более выраженное у животных в 7 группе. По данным биохимического анализа крови на 15 сутки установлено развитие токсического повреждения органов функциональной системы детоксикации за счет введения в пищевой рацион хлорида кадмия у животных 7-й и 8-й групп. Выявлено значительное нарушение функции печени, что проявлялось в группе 7 повышением АЛТ на 176,7% и АСТ на 105,2% (р<0,05 в сравнении с контролем), в то же время у лабораторных животных в группе 8 подъем в крови цитолитических ферментов был менее выраженным: АЛТ на 55,2% (р<0,05 в сравнении с группой 7) и АСТ на 67,7%, что говорит о возникновении мембранопротектив-ного эффекта при введении в пищевой рацион воды с пониженным содержанием дейтерия (табл. 3).
Кроме того, у крыс в обеих опытных группах наблюдалось нарушение углеводного обмена: повышение уровня глюкозы в плазме крови составило 36,2% в 7-й группе и 41,3% в восьмой группе (р<0,05 в сравнении с контролем), что связано в том числе и с нарушением образования гликогена в клетках печени при ее токсическом поражении солями кадмия. Нефротоксическое действие Cd2+ сопровождалось снижением скорости клубочко-вой фильтрации, что подтверждалось повышением в плазме крови крыс из опытных групп уровня креатинина на 72,4% в седьмой группе (р<0,05) и 17,9% в восьмой группе. Менее выраженные изменения креатинина у животных 8-й группы можно объяснить умеренным диуретическим эффектом, наблюдающимся при использовании в пищевом рационе воды с резко сниженным содержанием дейтерия (40 ррт), который обусловлен адаптационными механизмами, направленными, по-видимому, на уменьшение градиента тяжелых изотопов водорода в крови и тканях организма в соответствии с законом постоянства изотопного состава. При этом не было выявлено статистически значимого отличия в содержании мочевины в крови крыс из обеих опытных групп, что можно объяснить нарушением образования последней из аммиака в ге-патоцитах, в связи с токсическим ингибированием их ферментных систем, обеспечивающих реакции цитрулинового цикла, последнее, вероятно, приводит к развитию гипераммонемии, оказывающей в свою очередь дополнительное повреждающее воз-
действие на нервную и сердечно-сосудистую системы. Содержание общего белка и альбуминов в крови всех обследованных животных значимо не отличалось (p>0,05), что возможно обусловлено большей резистентностью к воздействию указанных выше суточных концентраций Cd2+ белок-синтезирующего аппарата гепатоцитов в сравнении с липопротеиновыми комплексами плазмалеммы, а также клинически несущественной протеинурией при умеренно выраженной нефропатии.
При патологоанатомическом исследовании крыс в группах 7 и 8 на 15 сутки эксперимента наблюдалась выраженная гепатомегалия, печень была дряблой консистенции, красного цвета, поверхность разреза мутная; также определялось увеличение почек.
При анализе показателей АОС, был выявлен значительный дисбаланс в сторону преобладания прооксидантных факторов. В результате токсического воздействия на организм накопившихся патологических субстратов наблюдалось развитие окислительного стресса и усиление мембраноде-структивных процессов, что проявлялось повышением ТБЧ плазмы на 78% у животных 7 группы и на 43% в 8 группе, ТБЧ эритроцитов на 31,8% и на 24% соответственно, а также увеличением индуцированного ТБЧ эритроцитов на 77% в 7 группе и 52,8% в 8 группе. Значительно повышен был и уровень СРО, в печени значение ХЛ были выше на 39% в 7 группе и на 12% в 8 группе, по сравнению с контролем, в сердце данные показатели превышали контрольный уровень на 83% и 20% соответственноо, а в почках на 10,5% и 21,5%. Об усилении интенсификации реакций СРО говорит и повышение ПХЛ на 99,2% у животных 7 группы и на 69,7% в 8 группе, и ВХЛ на 50% и 36,6% соответственно(табл. 3).
Снижение функциональной активности СНЗ подтверждалось уменьшением АОА на 33% и 14,4% и количества тиоловых групп на 43,5% в 7 группе и 35,8% в 8 группе.
Кроме того, установлено, что наибольшее корригирующее влияние ВМИС ССД отмечено для нарушений в работе прооксидантно-антиоксидант-ной системы (КОМБэр в группе 8 был на 26,6% ниже, чем в группе 7), что превосходило показатели корригирующего воздействия ВМИС ССД при эндотоксикозе с продукционным и резорбционным первичным механизмом развития. Также достаточно выраженным было влияние питьевого рациона с концентрацией дейтерия 40 ppm и на показатели функциональной системы детоксикации. При это выявлено уменьшение ИЭИ в группе 8 на 32,8% в сравнении с группой 7.
Для изучения механизмов корригирующего влияния ВМИС ССД были исследованы показатели изотопного обмена у животных с эндотоксико-зом гепаторенального генеза, показали, что в 8-й группе происходит усиление D/H обмена в крови и тканях, сопровождающееся уменьшением содержания дейтерия, наиболее существенное снижение которого выявлено в плазме крови — на 35,6% (p<0,05 в сравнении с контролем), менее выраженные, но достоверные изменения отмечены в
Таблица 3
Биохимические показатели прооксидантно-антиоксидантной системы и функциональной системы детоксикации при эндотоксикозе гепаторенального генеза
Показатель Группа 1 Группа 7 Группа 8
АСТ, ед. акт 163,20+11,65 334,89+10,88* 273,72+19,56*#
АЛТ, ед акт. 45,03+2,89 124,54+5,56* 67,58+4,32*#
Альбумин, г/л 32,51+1,79 31,12+2,18 28,73+1,58
Билирубин, мкмоль/л 5,78+0,27 12,94+0,37* 10,41+0,48*#
Креатинин, мкмоль/л 44,81+1,43 77,20+3,42* 52,79+1,69*#
Мочевина, ммоль/л 6,89+0,34 7,61+0,58 5,76+0,27*#
Глюкоза, ммоль/л 5,84+0,25 7,91+0,47* 8,23+0,36*
ТБЧпл., е.о.п. 0,260+0,012 0,463+0,021* 0,372+0,018*#
ТБЧэр, е.о.п. 0,501+0,027 0,659+0,030* 0,620+0,034*
ТБЧэр.-инд., е.о.п. 0,608+0,033 1,064+0,058* 0,917+0,049*#
ХЛ, печень 0,283+0,004 0,395+0,021* 0,314+0,005*#
ХЛ, почка 0,419+0,005 0,463+0,013* 0,510+0,007*#
ХЛ, сердце 0,221+0,003 0,406+0,017* 0,267+0,003*#
ВХЛмакс, усл. ед. 1,993+0,065 2,990+0,092* 2,724+0,08*#
ХЛпл, усл. ед. 2,597+0,086 5,173+0,189* 4,409+0,145*#
САОА, мг/л 1,030+0,034 0,684+0,025* 0,881+0,029*#
SH-гр., мкмоль/ г Hb 0,287+0,006 0,162+0,003* 0,184+0,005*#
МСиНМэр., е.о.п. 4,035+0,215 5,852+0,146* 5,496+0,363*
МСиНМпл., е.о.п. 2,917+0,076 4,308+0,170* 3,755+0,098*#
ИЭИ, % ГК 0,19+5,08 131,10+7,07* 88,16+12,18*#
КОМБэр, ОЕА 0,08+0,71 21,65+1,16* 15,90+1,02*#
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с показателями группы 1 (контрольная); # - р<0,05 по сравнению с показателями 7-й группы.
лиофилизированных тканях почки — на 15,3% (р<0,05), печени — на 8,7% (р<0,05) и сердца — на 8,5% (р<0,05). Подобные изменения изотопного состава тканей могут стимулировать метаболические процессы на клеточном уровне за счет замещения дейтерия на протий в активных и алло-стерических центрах ферментов и соответственно уменьшать энергию активации субстрат-ферментных комплексов в катализируемых ими реакциях, в том числе участвующих в реализации неспецифической защиты, а также приводить к ускорению процессов транскрипции в условиях изменения энергетического потенциала гидратной оболочки нуклеиновых кислот при замещении HDO на Н2О, повышая адаптационные возможности организма. В целом происходящие изменения изотопного состава в крови и тканях у крыс 8 группы приводили к уменьшению интенсивности СРО в крови на 11,2% и гомогенатах сердца и печени на 38,1% и 20,5% соответственно (р<0,05 в сравнении с группой 1), что указывает на усиление функциональной активности системы неспецифической защиты при введении в пищевой рацион ВМИС ССД. В тоже время в гомогенатах почек у крыс 8-й группы показатель ХЛ оставался более высоким в сравнении
с данными в 7-й группе, такие результаты можно объяснить накоплением в крови последних в условиях сформированной нефропатии эндогенных токсических субстанций пептидной природы, способных ингибировать свечение. Следует отметить, что в тканях печени и сердца, отличающихся высокой метаболической активностью, повышение потенциала системы неспецифической защиты за счет реакций изотопного обмена позволило снизить повреждающее действие свободных радикалов на клеточные структуры.
Таким образом, в заключении следует отметить, что с помощью интегральных показателей продемонстрирована более существенное влияние реакций изотопного обмена на состояние функциональной системы детоксикации при резорб-ционном первичном механизме развития эндо-токсикоза (ИЭИ снижался на 36,8%), тогда как наиболее значимая коррекция нарушений в работе прооксидантно-антиоксидантной системы с помощью ВМИС ССД отмечена при эндотоксикозе ге-пато-ренального генеза (КОМБэр уменьшался на 26,6%). Менее существенное влияния ВМИС ССД отмечено при коррекции нарушений прооксидант-но-антиоксидантной системы у крыс с моделирова-
нием эндотоксикоза с продукционным первичным механизмом развития (снижение КОМБэр в группе 4 на 15,2%, в сравнении с группой 3). При этом интегральный показатель состояния функциональной системы детоксикации уменьшался в группе 4 в сравнении с группой 3 на 27,1%, что также с пониженным содержанием дейтерия наименее значимую коррекцию нарушений детоксицирующего звена системы неспецифической защиты с помощью питьевого рациона с пониженной концентрацией дейтерия у крыс при моделировании аллокса-нового диабета.
Выводы
Впервые с помощью экспериментального моделирования у животных эндогенной интоксикации
продемонстрированы различия в эффективности пищевого рациона, включающего воду с модифицированным изотопным составом с пониженным содержанием дейтерия (40 ррт), при коррекции нарушений в работе прооксидантно-антиоксидант-ной и детоксицирующей систем в зависимости от первичного механизма развития эндотоксикоза. С помощью интегральных показателей продемонстрировано более существенное влияние реакций изотопного обмена на состояние функциональной системы детоксикации при резорбционном первичном механизме развития эндотоксикоза (ИЭИ снижался на 36,8%), тогда как наиболее значимая коррекция нарушений в работе прооксидантно-антиоксидантной системы с помощью ВМИС ССД отмечена при эндотоксикозегепаторенального ге-неза (КОМБэр уменьшался на 26,6%).
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и азота: значение для диагностики профилактики и терапии // Биохимия. - 2004. - Т.69. - Вып. 1. - С. 5-7.
2. Гомазков О.А. Окислительный стресс на молекулярном, клеточном и органном уровнях //Биохимия. - 2003. - Т.68. -Вып. 7. - С.1005-1006.
3. Ерюхин И.А., Шашков Б.В. Эндотоксикоз в хирургической практике -СПб.:Логос, 1995 - 304 с.
4. Барышева Е.В., Каде А.Х., Басов А.А., Арцыбашева О.М. Изучение эффективности метаболической коррекции свобод-норадикального окисления с помощью реакций изотопного обмена в организме лабораторных животных при интоксикации, вызванной введением в пищевой рацион хлорида кадмия // Вестник новых медицинских технологий. - 2014.-№ 3. - Т. 21.- С. 58-62.
5. Барышев М. Г., Басов А. А., Копытов Г. Ф. и др. Изучение влияния низкочастотного электромагнитного поля на процессы свободнорадикального окисления // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. - 2014. - №1. - С. 12-17.
6. Басов А.А., Барышев М.Г., Быков И.М. и др. Воздействие воды с модифицированным изотопным составом на интенсивность свободнорадикальных процессов в эксперименте на лабораторных животных // Аллергология и иммунология. - 2012. - Т. 13. - №4. - С. 314-320.
7. Барышев М.Г., Джимак С.С., Долгов М.А. и др. Применение воды с модифицированным изотопным составом и pH в мясной промышленности // Известия вузов Пищевая технология. - 2012. - № 2-3. - С.42-44.
8. Лисицын А.Б., Барышев М.Г., Басов А.А. и др. Воздействие воды со сниженным содержанием дейтерия на организм лабораторных животных при различном функциональном состоянии неспецифических защитных систем // Биофизика. -2014. - № 4. - Т. 59. - С. 757-765.
9. Джимак С.С., Барышев М.Г., Басов А.А., Тимаков А.А. Влияние воды со сниженным содержанием дейтерия на изотопный состав лиофилизированных тканей и морфофункцио-нальные показатели организма у крыс из разных поколений // Биофизика. - 2014. - Т. 59. - Вып. 4. - С. 749-756.
10. Патент РФ № 2455703, 11.01.2011.
11. Патент РФ № 2438765, 25.05.2010.
12. Барышев М.Г., Болотин С.Н., Джимак С.С. Способы получения воды с пониженным содержанием дейтерия // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. - 2013. - №1. - С. 13-17.
13. Robyt, J.F., Ackerman R.J., Chittenden C.G. Reactionofproteindisulfide groups with Ellman's reagent: a case study of the number of sulfhydryl and disulfide groups in Aspergillusoryzaea-amylase, papain and lysozyme // Arch. Biochem. Biophys. - 1971. - V. 147. - P. 262-269.
14. Орехович B.H. Современные методы в биохимии. - M.: Медицина, 1977. - 293 c.
15. Ушкалова В.Н., Иоанидис Н.В., Кадочникова Г. Д., Деева З.М. Контроль перекисного окисления липидов. - Новосибирск: изд-во Новосиб. ун-та, 1993. - 182 с.
16. Оболенский С.В.,МалаховаМ.Я., Ершов А.Л. Диагностика стадий эндогенной интоксикации и дифференцированное применение методов эфферентной терапии // Вестн. хирургии. - 1991. - № 3. - С. 95-100.
17. Басов А.А., Павлюченко И.И., Плаксин А.М., Федосов С.Р. Использование аналогово-цифрового преобразователя в составе системы сбора и обработки информации с хемилю-минитестером LT-1 // Вестн. новых мед. технологий. - 2003. -Т. 10. - № 4 - С. 67-68.
18. Яшин, А.Я. Инжекционно-проточная система с ампероме-трическим детектором для селективного определения анти-оксидантов в пищевых продуктах и напитках // Рос. хим. журнал. - 2008. - Т. LII.- № 2. - С. 130-135.
19. Павлюченко И.И., Дынько Ю.В., Басов A.A., Федосов C.P. Интегральные показатели эндогенной интоксикации и окислительного стресса у больных с почечной недостаточностью // Нефрология и диализ. - 2003. - Т .5. - № 1. -Прил. 1. - С. 28-32.
20. Басов А.А., Быков И.М., Барышев М.Г. и др. Концентрация дейтерия в пищевых продуктах и влияние воды с модифицированным изотопным составом на показатели свободно-радикального окисления и содержание тяжелых изотопов водорода у экспериментальных животных // Вопросы питания. - 2014. - Т. 83.- № 5.- С. 43-50.
