CC BY
21УДК 597.554.3: 577.17
Н.И.Силкина, В.Р.Микряков
СОСТОЯНИЕ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И АНТИРАДИКАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ТКАНЕЙ РЫБ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФЕНОЛА И НАФТАЛИНА
Институт биологии внутренних вод им. И.Д.Папанина РАН, п. Борок Ярославской обл.
Представлены экспериментальные данные, полученные в результате оценки состояния процессов перекисного окисления липидов и антирадикальной системы в тканях печени, почек и селезенки карасей при экспозиции рыб в воде, содержащей фенол и нафталин. Показано, что длительное пребывание рыб в воде, содержащей токсические вещества в низких концентрациях, проявилось активацией процессов перекисного окисления липидов, истощением антиоксидантных возможностей организма рыб, изменением окислительно-восстановительного баланса.
Ключевые слова: фенол, нафталин, карась, перекисное окисление липидов, антиокислительная активность.
Введение. Важнейшими составляющими метаболических процессов и гомеостаза биологического организма являются окислительные и антиоксидантные системы. Соотношение этих процессов в организме рыб изучено очень слабо, хотя известно, что при напряженной деятельности организма (миграция, нерест) и ряде неспецифичных для рыб воздействиях наблюдается усиление окислительных процессов, в результате чего накапливаются продукты переокисления липидов, выступающие в роли первичного медиатора стресса [2, 3, 6]. Самые разнообразные экологические факторы не вызывают каких-то несвойственных для организма рыб новых процессов, а активируют цепные реакции окисления, протекающие в клетках при нормальных физиологических условиях с малой скоростью [5, 9]. Негативные воздействия приводят к изменению состояния и функциональной активности мембран клетки, тесно связанных с балансом про- и антиоксидантных систем клетки [8]. Нарушения структуры и состава ли-пидного бислоя мембран, вызванные активизацией свободнорадикального окисления, влияют на изменение функционирования мембраны клеток, и, следовательно, систем, органов, тканей и организма рыб в целом. Устойчивость мембран к свободнорадикальному окислению зависит от состояния антиоксидантной системы. Несмотря на ряд работ, раскрывающих негативные последствия воздействия некоторых ксенобиотиков на рыб, не все аспекты данной проблемы еще хорошо освещены. До сих пор не ясен характер воздействия низких концентраций загрязнителей на особенности перекисно-го окисления липидов и активность антирадикальной защиты в органах и тканях рыб в условиях токсического стресса. При этом такая информация актуальна и необходима для осуще-
ствления экологического мониторинга и для оценки состояния здоровья рыб.
Цель настоящей работы состояла в исследовании хронического действия сублетальных концентраций разных по химической природе токсических веществ — фенола и нафталина на показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиокислительную защиту (А3) в тканях карповых рыб.
Материал и методы исследования. Материалом для исследования служили годовики карася средней массой 93±8,5 г и длиной 17±6 см. Эксперименты проводили в плексиглассовых аквариумах объемом 150 л, где создавались условия постоянного газового и температурного режима воды. Средняя температура воды составляла 17— 19°С, содержание кислорода 4—5 мг/л, рН 7—7,4. В качестве загрязнителей использовали фенол и нафталин, концентрации которых составили 3 и 10 мг/л, что соответствовало по действующему веществу 0,1 от установленной 96-час ^50. Растворы токсикантов готовили непосредственно перед добавлением в аквариум на дистиллированной воде и заменяли ежедневно. Опытных рыб содержали в растворах токсических веществ, а контрольных — в аналогичных условиях в чистой воде. Кормили рыб сухим гранулированным кормом 1 раз в сутки, исходя из массы тела и температуры воды по принятым в прудовом рыбоводстве нормам согласно инструкции по проведению токсикологических опытов. Отбор проб проводили через 1, 4, 7 и 21 сутки от начала опыта. Число проанализированных рыб в каждой точке составляло 10 особей. Об интенсивности ПОЛ в тканях рыб судили по накоплению малонового диальдегида (МДА) — одного из конечных продуктов перекисного окисления. Концентрацию МДА определяли на основе учета количества продуктов перекисного окисления
липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой и дающих с ней окрашенный комплекс [1]. Общую антиокислительную активность биологического материала (ОАА), отражающую содержание антиоксидантов, устанавливали по кинетике окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола кислородом воздуха в присутствии и отсутствии тканевых экстрактов [12]. Данные обработаны методом вариационной статистики с использованием пакета прикладных данных «81а11811са».
Результаты и обсуждение. Анализ результатов свидетельствует, что за период эксперимента во всех вариантах опыта гибели рыб не наблюдалось, не менялось их поведение, при вскрытии отмечалось хорошее наполнение кишечника пищей, патологических изменений внутренних органов не зафиксировано. Можно утверждать, что введение использованных токсикантов в воду в указанной дозе не вызвало у рыб визуальных внешних и внутренних проявлений признаков отравления.
В то же время, в результате исследований установлено, что длительное пребывание рыб в воде с низкими концентрациями использованных загрязнителей приводило к изменению интенсивности протекания биохимических процессов в организме рыб. При экспозиции рыб в воде, содержащей фенол и нафталин, уровень МДА во всех исследованных тканях через 1 сутки воздействия токсикантом не изменялся, но затем в последующие сроки наблюдения этот показатель стал повышаться (табл. 1). При загрязнении воды фенолом наблюдали увеличение содержания МДА в 1,2 раза по сравнению с контролем толь-
ко в почке на 4 сутки, но на 7 сутки показатель стал выше контроля в печени опытных рыб в 2,1 раза, в почках — в 1,39 раза, селезенке — 1,2 раза; на 21 сутки экспозиции уровень МДА оставался повышенным во всех исследованных тканях в 1,8—2 раза. При содержании рыб в воде с нафталином на 4 сутки произошло увеличение содержания МДА в 1,3 раза в почках и в селезенке; на 7 сутки — в селезенке показатель остался на прежнем повышенном уровне, а в почках еще более увеличился, превысив норму в 1,65 раза; к концу экспозиции содержание МДА было выше контроля в селезенке в 3,1 раза, в почках — в 2,2 раза, в печени — в 1,7 раза. Воздействие нафталина на рыб по сравнению с фенолом к концу опыта отразилось более сильным усилением перекисных процессов в почках и селезенке, а в печени опытных рыб больший эффект наблюдали при воздействии фенола. Накопление в тканях продуктов ПОЛ служит показателем активации процессов свободнорадикального окисления [5]. Повышенное содержание продуктов переокисления липидов в тканях опытных рыб показывает, что длительное воздействие токсикантов в низких концентрациях приводит к усилению ПОЛ, нарушению регуляции процессов ПОЛ и развитию состояния, получившего название «перекисный стресс». ПОЛ, отражая накопление промежуточных и конечных метаболитов и физиологически активных интермедиаторов, свидетельствует об ответной защитной реакции организма на физиолого-биохимическом уровне на действие стрессорных неспецифичных для организма факторов [7, 13, 15, 16]. Развитие ПОЛ катализируется в основном разны-
Таблица 1
Содержание малонового диальдегида (нмоль/г ткани) в тканях карасей при экспозиции рыб в воде,
содержащей фенол и нафталин, (М±m)
Токсикант Срок исследования, сут
1 4 7 21
Печень
Контроль 3,74+0,22 4,07+0,27 3,98+0,38 4,09+0,19
Фенол 3,69+0,51 4,99+0,46 8,45+0,55* 7,98+0,29*
Нафталин 3,39+0,29 4,68+0,36 4,28+0,41 6,99+0,33*
Почки
Контроль 6,36+0,42 6,88+0,31 6,2U0,22 6,74+0,37
Фенол 7,08+0,67 8,26+0,29* 8,69+0,34* 12,11+0,41*
Нафталин 6,59+0,45 9,22+0,42* 10,29+0,38* 15,03+0,32
Селезенка
Контроль 3,08+0,33 2,96+0,21 2,89+0,32 2,99+0,36
Фенол 2,98+0,23 2,85+0,41 3,47+0,21* 5,99+0,34*
Нафталин 3,05+0,34 3,89+0,56* 3,85+0,38* 9,27+0,33*
Примечание. * — достоверно относительно контроля при р < 0,05
Таблица 2
Общая антиокислительная активность (л- мл-1 ■ мин-1) в тканях карасей при экспозиции в воде,
содержащей фенол и нафталин, (М±т)
Токсикант Срок исследования, сут
1 4 7 21
Печень
Контроль 13,71+0,67 13,23+0,54 13,49+0,69 13,64+0,55
Фенол 13,58+0,72 13,01+0,71 11,04+0,28* 15,83+0,31*
Нафталин 14,12+0,59 10,77+0,46* 14,83+0,28 16,72+0,31*
Почки
Контроль 8,64+0,39 8,56+0,42 8,52+0,39 8,59+0,44
Фенол 8,02+0,23* 8,38+0,38 6,24+0,35* 6,48+0,47*
Нафталин 7,57+0,41* 7,34+0,23* 7,18+0,43* 9,22+0,39*
Селезенка
Контроль 6,34+0,23 6,48+0,31 6,39+0,19 6,44+0,24
Фенол 6,31+0,38 6,37+0,43 5,22+0,35* 6,35+0,33
Нафталин 6,09+0,28 5,39+0,27* 5,35+0,36* 7,34+0,32*
Примечание. * — достоверно относительно контроля при р < 0,05
ми формами активного кислорода: супероксидным и гидроксильным радикалами, синглетным кислородом, пероксидами. Причиной интенсификации ПОЛ может быть также как снижение активности антиоксидантных ферментов (глу-татионпероксидазы, глутатионтрансферазы, су-пероксиддисмутазы и др.), разрушающих перекиси или предупреждающих их образование, так и усиление активности неферментных соединений, ответственных за образование перекисей и низкомолекулярных соединений, образующих при взаимодействии с радикалами малоактивные вещества (а-токоферола, р-каротина, глута-тиона крови и др).
Усиление перекисьобразовательных процессов у опытных рыб, свидетельствующее о нарушении окислительно-восстановительного баланса, сопровождалось изменением интегрального показателя ОАА (табл. 2). При содержании рыб в растворах фенола и нафталина изменение ОАА в печени носило фазовый характер: вначале показатель не менялся, затем снижался в среднем на 18%, а к концу опыта показатель ОАА в феноле превысил норму на 11,6%, в нафталине — на 12,2%. Почки рыб на пребывание в воде с фенолом отреагировали снижением интегрального показателя относительно контроля на 18,8% уже с 1-х суток, на 4 сутки ОАА пришла в норму, на 21 сутки наблюдения показатель стал на 24,6% ниже нормы. При экспозиции карасей в растворе нафталина в почках опытных рыб наблюдали пониженный уровень показателя на 1, 4 и 7 сутки, но к концу эксперимента ОАА превысила контроль на 7,3%. В селезенке рыб воздействие
фенола на 1 и 4 сутки не повлияло на показатель ОАА, на 7 сутки произошло снижение на 18,3%, а на 21 сутки показатель соответствовал контролю. В селезенке показатель ОАА в нафталине на 4 и 7 сутки был ниже контроля, а на 21 сутки превысил таковой на 13,9%. Снижение ОАА показывает, что содержание антиоксидантов увеличивается и, наоборот, при повышении показателя уровень антиоксидантов падает. Нафталин по сравнению с фенолом оказал более сильное воздействие на антирадикальную защиту тканей рыб. Достоверное изменение интегрального показателя антиокислительной активности у опытных рыб свидетельствует о колебании в процессе пребывания рыб в токсикантах уровня веществ, обладающих свойствами антиоксидантов, как в тканях, так и в организме рыб. В целом выявленная картина колебаний ОАА характеризует нарушение равновесия в системе ПОЛ-А3 в сторону активации окислительного стресса.
Перекисный окислительный стресс — это процесс, состоящий из фазы активизации функции ферментов антирадикальной защиты (в результате накопления органических гидроперекисей) и фазы угнетения активности антиперекисных ферментов, обусловленную прямым повреждением молекул ферментов свободными радикалами [15], истощением запасов восстановленного глутатиона [2, 7, 14] и накоплением продуктов пероксидации в тканях. В нашем исследовании отмечалась фазная динамика изменения общей антиокислительной активности и соответственно уровня антиоксидантов. Характерное изменение активности антиперекисной защиты мож-
но проследить, например, в печени при нафталиновом загрязнении. В целом, в более поздние сроки исследования в тканях рыб, подвергнутых воздействию токсическими веществами, на фоне снижения веществ антиоксидантной защиты произошло накопления продуктов ПОЛ, что может рассматриваться как переход перекисного стресса в конечную, декомпенсированную стадию. При внесении в среду обитания рыб фенола и нафталина в клетках их тканей возникают нарушения энергообеспечивающих процессов, связанных с изменением уровня доставки кислорода в ткани.
Неоднозначная картина результатов, полученных в нашем исследовании в тканях почек, печени и селезенки, свидетельствует о разном функциональном значении таковых, являющихся иммунокомпетентными и гемопоэ-тическими органами рыб. Наиболее сильные отклонения от контроля исследованных параметров получены нами в тканях почек. Почки у рыб выполняют разнообразные функции: иммунологические и экскреторные. В почках происходит лимфо- и миэлопоэз, они богаты клетками лимфоидно-миэлоидной ткани ретикуло-эндотелиальной системы [10, 11], которые ответственны за реализацию функций распознавания «чужого», разрушение антигена, синтеза антител и образование различных типов лейкоцитов: лимфоцитов, нейтрофилов, макрофагов и т.д. Нейтрофилам и макрофагам принадлежит важная роль в индуцировании окислительного стресса и разрушении тканей собственного организма при стрессе [4]. Мочевыделитель-ная функция почек тесно связана с состоянием клеточной мембраны, контролируемой анти-оксидантной системой. Печень — один из важнейших полифункциональных органов рыб, роль которого очень важна во многих процессах жизнедеятельности. Печень представляет собой массивную железу, являющуюся одновременно экзокринной и эндокринной железой. Как эндокринная, она секретирует в плазму крови сахара, альбумины, факторы свертывания крови, участвует в регуляции уровня липидов в крови; как экзокринная — по системе желчных протоков выделяет желчь в пищеварительный тракт. Печень участвует в разрушении и нейтрализации чужеродных веществ, синтезе медиаторов иммунного ответа, очищения крови от иммунных комплексов, токсичных соединений и т.д. Селезенка рыб — это железа, связанная с кровообращением, в которой происходит образование эритроцитов и лейкоцитов.
Заключение. Выявленные закономерности и фазовый характер происходящих изменений окислительно-восстановительного баланса в
тканях, сопровождающийся усилением свобод-норадикальных и перекисных процессов и снижением антиоксидантной защиты, являются типичными для реакции рыб на стресс и отражают развитие общего адаптационного синдрома. Из материалов исследований следует, что мишенью повреждающего действия токсикантов являются молекулярные механизмы детоксикации образования свободных радикалов, инициирующих активацию окислительного стресса. Изменения в системе окислительного гомеостаза у рыб под воздействием токсикантов позволяют думать о снижении адаптационного потенциала организма рыб.
Список литературы
1. Андрева Л.И., Кожемякин Н.А., Кишкун А.А. //Лаб. дело, 1988. — № 11. — С. 41-43.
2. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г и др. Перекисное окисление и стресс. — СПб.: Наука, 1992. — 148 с.
3. Барабой В.А. //Журн. эволюц. биохимии и фи-зиол., 1995. — Т. 31. — № 1. — С. 14-20.
4. Барсуков А.А, Годков М.А. и др. // Успехи совр. биологии, 2004. — Т. 124. — 36. — С. 542-544.
5. Владимиров Ю.А., Арчаков А.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. — М.: Наука, 1972. — 252 с.
6. Грубинко В.В., Леус. Ю.В. // Гидробиол. журн., 2001. — Т. 37. — № 1. — С. 64-78.
7. Гуляева Н.В., Лузина Н.Л., Левшина И.П. и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1988. — Т. 106. — № 12. — С. 660-663.
8. Леус Ю.В., Арсан В.О., Грубинко В.В. //ДОП. Нац. АН Украши, 1998. — № 7. — С. 150-159.
9. Малыжева Т.Д. //Экологическая физиология и биохимия рыб. Тез. докл. IXВсерос. конф. — Ярославль, 2000. — Т. 2. — С. 44-45.
10. Микряков В.Р. Закономерности формирования приобретенного иммунитета у рыб. — Рыбинск, 1991. — 154 с.
11. Микряков В.Р., Балабанова Л.В и др. Реакция иммунной системы рыб на загрязнение воды токсикантами и закисление среды. — М.: Наука. 2001. — 126 с.
12. Семенов В.Л., Ярош A.M. // Укр. биохим. журн., 1985. — Т. 57. — № 3. — С. 50-52.
13. Di Giulio R.T., Washburn P.C., Wenning R.J. et al. // Environ. Toxicol. And Chem., 1989. — V. 8. — P. 1103-1123.
14. Fiho W.D.//Braz. J. Med. andBiol. Res., 1996. — V. 29. — № 12. — P. 1735-1742.
15. Flohe L. //Free Rad. Biol., 1982. — V. 5. — P. 223-254.
16. Winston G.W. // Compar. biochem. And Physiol, 1991. — V 100. — № 1-2. — P. 173-176.
Материал поступил в редакцию 11.07.05.
N.I.Silkina, V.R.Mikryakov
LIPIDE PEROXIDATION PROCESSES AND ANTI-RADICAL SYSTEM IN FISH TISSUES EXPOSED
TO PHENOL AND NAPHTHALENE
I.D. Papanin Institute of Inland Waters Biology, Russian Academy of Sciences, Borok, Yaroslav Region
Data are reported on assessment of the state of lipid peroxidation processes and of anti-radical system in tissues of liver, kidneys and spleen of crucians exposed to phenol and naphthalene in water. Long stay of fishes in water with a low concentration of toxic substances led to the activation of lipide peroxidation processes, exhaustion of anti-oxidation potential of fish organisms, changes in oxidation-reduction balance.
УДК [615.31:547.321]:615.451.35
Г.А.Ливанов, С.П.Нечипоренко, А.Н.Лодягин, С.Е.Колбасов
РАЗРАБОТКА АЭРОЗОЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ПЕРФТОРУГЛЕРОДОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ ПОРАЖЕНИЙ ЛЕГКИХ РАЗДРАЖАЮЩИМИ ВЕЩЕСТВАМИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
ГУ Институт токсикологии Минздравсоцразвития, С.-Петербург
Представлены экспериментальные материалы по изучению эффективности ингаляционного применения новой рецептуры на основе перфторуглеродов при токсическом отеке легких. Показано, что рецептура обладает эде-мопротективной активностью.
Ключевые слова: перфторан, педифен, сальбутамол, токсический отек легких.
Введение. Проблема лечения токсического отека легких остается весьма актуальной. Это связано с тем, что при массовых отравлениях такими широко распространенными в промышленности соединениями, как хлор, аммиак, окислы азота, ряд кислот развитие токсического отека легких определяет тяжесть и прогноз интоксикации.
В настоящее время наиболее перспективным в пульмонологии является применение лекарственных препаратов в ингаляционной форме, позволяющей доставлять препарат непосредственно к органу-мишени и исключить многие побочные эффекты, связанные с резорбцией. Поэтому на основании литературных данных о фармакологических эффектах компонентов возможного препарата была составлена экспериментальная рецептура: перфторуглерод (перфто-ран) — для повышения доступности рецепторов, улучшения транспорта кислорода и повышения активности легочных сурфактантов, педифен — для улучшения проходимости бронхов, в качестве местноанестезирующего и антибактериального средства, сальбутамол — в качестве бронхоли-тика и средства, улучшающего микроциркуляцию в легких и активатора легочных сурфактан-тов.
Изучение специфической фармакологической активности нового препарата целесообраз-
но было проводить на доступных и воспроизводимых моделях заболеваний легких.
Материалы и методы исследования. В качестве моделей токсического отека легких были выбраны ингаляционные воздействия аммиаком и хлором на крыс, диоксидом азота на мышей.
С целью обеспечения доставки лекарственного средства непосредственно к органу-мишени смесь перфторана с педифеном и сальбутамо-лом вводили ингаляционно.
Перфторан известен как препарат, предназначенный для применения в качестве плазмоза-мещающего средства с газотранспортной функцией (ВФС 42-2576-95 от 13.02.1996 г.). Известно также, что перфторан может быть использован внутривенно для лечения отека, вызванного черепно-мозговой травмой [3]. Сведения об ингаляционном использовании перфторана для лечения химических поражений легких отсутствуют, в то время, как известно об ингаляционном применении перфторуглеродов при других видах патологических процессов [1, 2, 4].
Педифен — ^^диэтил-5,5-дифенил-2-пен-тиламина гидрохлорид, является н-холинобло-катором с местноанестезирующими, антиокси-дантными и антимикробными свойствами. Известно, что холинолитики используются для купирования бронхообтурационного синдрома при ХПЛ веществами раздражающего типа действия.
