CC BY
14УДК 597.554.3: 577.17
Влияние низких концентраций ионов меди на иммунобиохимические показатели молоди карпа CYPRINUS CARPIO
Н.И. Силкина, Д.В. Микряков, В.Р. Микряков
Институт биологии внутренних вод им И.Д.Папанина РАН, Борок, Ярославская обл.
П
риводятся данные исследовании влияния низких концентрации (0.02 и 0.002 мг/л) СиБ04 на функцию гуморального иммунитета, перекисное окисление липидов и антиокислительную активность тканеи молоди карпа. Показана зависимость изменения исследуемых
признаков от концентрации загрязнителя и времени пребывания рыб в растворе токсиканта.
Ключевые слова: ионы меди, рыба, гуморальный иммунитет, липиды,печень,прооксидантно-антиоксидантная система.
Введение. Одним из самых токсичных, широко распространенным и опасным для гидроби-онтов веществом в ряду тяжелых металлов является медь [4, 9]. Поступление соединении меди в водоемы происходит из почвы, с атмосферными осадками и сточными водами. Основное загрязнение медью - антропогенного происхождения. Токсическое деИ-ствие меди обусловлено, в основном, ионами Си2+. Токсичность меди возрастает при снижении жесткости воды, температуры, содержания кислорода в воде и уменьшается при появлении гу-миновых кислот, аминокислот и взвешенных веществ [2, 4, 17]. В то же время медь - незаменимыи микроэлемент в биохимических процессах организма животных, что обуславливает ее участие в обмене веществ, окислительно-восстановительных процессах, синтезе гемоглобина, повышении адаптивнои устоичивости и сопротивляемости организма к вредным воздеиствиям факторов внешнеИ среды [6, 10].
Влияние высоких концентрации меди на гидробионтов выражается нарушениями метаболических процессов, изменением проницаемости клеточных мембран, ингибированием окислительного фосфорилирования и синтеза нуклеиновых кислот и белков и др. [2, 4, 9, 17]. Сведения о влиянии низких концентрации меди на иммуно-биохимическое состояние организма молоди
рыб немногочисленны [6, 7]. Между тем, знание этого вопроса позволит понять механизм действия инонов меди на биохимические процессы и иммунологический статус рыб.
Цель настоящей работы -изучение влияния сублетальных (низких) концентраций ионов меди на иммуно-биохимические показатели рыб.
Материал и методы исследования. Исследования проводили на молоди карпа Cyprinus carpió с начальной массой от 25 г. Рыб содержали в принудительно аэрируемых 150 л аквариумах при температуре воды 17-18оС в условиях оптимального кислородного режима и рН. Опытных рыб содержали в прудовой воде, содержащей ионы меди, а контрольных - в чистой воде. Экспериментальных рыб помещали в емкости с двумя разными разведениях соли меди (сульфата меди - CuSO4): конечные концентрации по действующему веществу - иону Cu2+ - составляли 0.02 и 0.002 мг/л, что соответствовало 1/10 и 1/100 от установленной 96-час CL50. Затравку готовили непосредственно перед добавлением в аквариум, растворы сульфата меди меняли ежедневно. Пробы брали у 30-40 особей через каждые 15 дней.
Реакцию иммунной системы изучали по данным анализа показателя гуморального иммунитета - бактериостатической активности сыворотки крови (БАСК),
применяя нефелометрическии метод, адаптированныи нами для рыб [8]. В качестве тест-бактерии использовали бактериальную культуру ЛегошопаБ Иуёгорййа (штамм 71).
Гепатосоматический индекс рассчитывали по процентному отношению исследуемого органа к массе рыбы по формуле: Х = А/В х 100, где: Х - индекс органа, %; А - масса органа, г; В -масса рыбы, г.
Липиды из гомогенатов тка-неи печени экстрагировали и определяли общепринятым способом по Фолчу [16]. Об уровне процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по накоплению малонового диаль-дегида (МДА) - одного из конечных продуктов перекисного окисления. Концентрацию МДА определяли на основе учета количества продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой и дающих с ней окрашенный комплекс [1]. Содержание МДА вычисляли с учетом коэффициента молярной экстинкции МДА (1.56 х 105 М-1 с-1) и выражали в наномолях на 1 г ткани. Исходно в животных тканях содержание малонового диальдегида крайне незначительно, и 98% его образуется в процессе взаимодействия тиобарбитуровой кислоты при разрушении гидроперекисей липидов. Содержание продуктов, реагирующих с тиобарби-туровой кислотой, вычисляли
по формуле Х = Е х 85.47, где: Х - содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, выраженное в количестве малонового диальдеги-да (мкмоль/л); Е - оптическая плотность при 535 нм.
Интенсивность процессов антиокислительной защиты (АЗ) устанавливали по кинетике окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола кислородом воздуха в присутствии тканевого экстракта печени по общепринятой методике, описанной Семеновым и Яро-шем [11]. Гомогенат получали путем растирания ткани печени с физиологическим раствором в соотношении 1 : 1. Константу ин-гибирования окисления субстрата, являющуюся показателем антиокислительной активности органа, определяли относительно контроля по формуле: К1 = Ккон - Коп/С, где: Ккон и Коп -константы скоростей окисления субстрата соответственно в контроле и в опыте, С - концентрация биологического материала в кювете. Повышение показателя КО свидетельствует о снижении в исследуемой ткани содержания антиоксидантов [9].
Результаты исследований подвергали статистической обработке при помощи стандартного пакета программ (приложение
81аЙ8Йса) с использованием 1;-теста.
Результаты и обсуждение.
За период эксперимента не отмечено изменений в поведении рыб и патологий во внутренних органах, молодь активно питалась. При этом результаты опыта указывают на отклонение от контрольного уровня показателей БАСК, гепатосоматиче-ского индекса, интенсивности процессов ПОЛ и содержания структур АЗ в печени (табл.1, 2). Более выраженная реакция организма рыб на загрязнение отмечена при большей концентрации ионов меди в воде и на более поздних сроках эксперимента.
У молоди карпа, находящейся в воде с ионами меди, отмечены отличия от таковых особей, обитающих в чистой воде, по показателям гуморального иммунитета (табл.1). На 30 сут эксперимента, несмотря на отсутствие отличий между контрольными и опытными рыбами по уровню БАСК, доля иммунодефицит-ных по БАСК особей в группах опытных рыб была достоверно выше. Дальнейшее содержание рыб в загрязненной воде привело к резкому снижению их защитных свойств: показатель БАСК в опытах на 45 и на 60 сут существенно понизился и также увеличился процент иммуноде-
фицитных особей. Выявленные изменения иммунологических показателей свидетельствуют о высокой чувствительности гуморального звена иммунной системы рыб к воздействию ионов меди даже в низких концентрациях.
Важным доказательством негативного влияния изученного токсиканта на рыб является состояние печени - одного из важнейших полифункциональных органов (табл.2). В печени происходят основные процессы трансформации липидов. У карповых рыб печень принимает активное участие в пищеварительных процессах, выработке ововителлина, обмене веществ, реализуя синтез и деградацию гликогена, белков, липидов, а также процессы их неогенеза, детоксикации, в реализации иммунологических реакций и другие [3, 8]. У рыб, подвергшихся воздействию меди, наблюдали достоверное увеличение соматического индекса по сравнению с контролем, особенно к концу опыта. Увеличение емкости печени в нашем опыте подтверждает мнение ряда исследователей о развитии в ней воспалительного процесса при воздействии некоторых стресс-факторов, в частности, такое явление на-
Таблица 1
Показатели гуморального иммунитета у молоди карпа при экспозиции в воде,
содержащей ионы меди
Показатель
Условия содержания
Срок отбора проб, сут
30
45
60
БАСК, %
контроль опыт 1 опыт 2
22 22 20
29 12* 14*
17
7* 7*
% от общего числа иммунодефицитных по БАСК особей
контроль опыт 1 опыт 2
4 10* 10*
5
29* 19*
9
41* 24*
Примечание: * - здесь и далее в табл.2 достоверно относительно контроля при Р<0.01.
Таблица 2
Физиолого-биохимические показатели печени молоди карпа при экспозиции в воде,
содержащей ионы меди
Показатель Условия содержания Срок отбора проб, сут
30 45 60
Индекс печени, о.е. контроль опыт 1 опыт 2 1.0±0.05 1.2±0.04 1.1±0.05 1.1±0.03 1.4±0.05* 1.2±0.05 1.3±0.05 1.7±0.05* 1.5±0.06*
Общие липиды, мг% контроль опыт 1 опыт 2 1405±55 2240±60* 1860±65* 1480±65 2410±50* 2090±65* 1435±55 2320±45* 1930±60*
Содержание малонового диальдегида, нмоль/г контроль опыт 1 опыт 2 6.557±0.19 9.51±0.39* 6.80±0.22 6.12±0.36 9.54±0.41* 9.43±0.38* 6.443±0.12 10.225±0.27* 9.04±0.43*
Кинетика окисления печени, л/мл*мин контроль опыт 1 опыт 2 12.331±0.21 15.22±0.36* 12.04±0.42 12.76±0.33 18.45±0.29* 17.78±0.44* 12.12±0.37 18.79±0.41* 17.98±0.38*
блюдается в природных условиях в районах повышенной антропогенной нагрузки [5].
В печени опытных рыб отмечено повышенное накопление общих липидов. Это, скорее всего, является ответной реакцией на стресс и имеет адаптивный или компенсаторный характер. Сходный характер изменения содержания липидов в печени зафиксирован нами у карпов при воздействии солями тяжелых металлов (ионами кадмия, меди), фенола, нафталина [13, 14], введении гормона стресса - кортизола [15], а также у лещей Abramis brama зараженных Ligula intestinalis [12].
Об интоксикации организма рыб свидетельствует изменение активности окислительных процессов в печени, о чем свидетельствует изменение показателей МДА и КО (табл. 2). Усиление процессов ПОЛ подтверждается накоплением МДА. Активация процессов ПОЛ является одним из ключевых звеньев неспеци-
фических механизмов реализации токсических эффектов, а состояние интенсификации цепных реакций ПОЛ, индуцируемых свободно-радикальными формами кислорода, при определенных воздействиях можно рассматривать как раннее проявление негативного токсического влияния на организм. Токсические продукты липо-пероксидации становятся причиной подавления функции антиоксидантных ферментов. Это подтверждается изменением интегрального показателя - КО. Повышенный уровень КО указывает на снижение содержания в организме опытных рыб структур, обладающих свойствами антиоксидантов и обеспечивающих эффективную детоксикацию токсичных продуктов ПОЛ.
Результаты опыта показывают, что хроническое воздействие медью приводит к нарушению регуляции переокисления ли-пидов и окислительному стрессу. Усиление процессов ПОЛ,
приводящих к дестабилизации и разрушению клеточных мембран, может быть одной из основных причин нарушения функциональной активности и деструктивных явлений в печени при отравлении организма медью. Важнейшим механизмом окислительного гомеостаза является про- и антиоксидант-ное равновесие, имеющее подвижный характер. Усиленный липидопереокислительный процесс нарушает оптимальный окислительно-восстановительный гомеостаз в организме опытных рыб и сдвигает баланс системы ПОЛ -м- АЗ в сторону интенсификации процессов ПОЛ. Аналогичные изменения равновесия в сторону прооксидантных форм наблюдали при воздействии солями тяжелых металлов (ионами кадмия, меди), фенола, нафталина [7, 13, 14, 17].
Заключение. Таким образом, хроническое воздействие низких концентраций ионов меди приводит к изменению иммуно-биохимического статуса орга-
низма. Отмечается зависимость исследованных параметров от концентрации загрязнителя и времени экспозиции. Негативное воздействие ионов меди выражается в подавлении ак-
тивности гуморального звена иммунной системы, дисбалансе прооксидантно-антиоксидантной системы, снижение функции де-токсицирующих систем организма рыб. Нарушение уровня
окислительно-восстановительного гомеостаза у опытных рыб сопровождается активацией окислительного стресса и снижением адаптационного потенциала организма.
1. Андреева Л.И., Кожемякин Н.А., Кишкун А.А. Модификация методов определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой //Лаб. дело, 1988. № 11. С.41-43.
2. Антонович Е.А., Подрушняк А.Е., Шуцкая Т.А. Токсичность меди и ее соединений. Сообщение первое. Обзор литературы // Современные проблемы токсикологии. 1999. № 3. С. 4-13.
3. Арцимович Н.Г., Настоящая Н.Н., Казанский Д.Б. и др. Печень как орган иммунобиологической системы гомеостаза // Успехи соврем. биол. 1992. Т. 112. № 1. С. 88-99.
4. Будников К.Г. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // Соросовский об-разоват. журн. Биология. 1998. Т. 7. № 5. С. 23-29.
5. Герман А.В., Козловская В.И. Гепатосоматический индекс и биохимический состав печени леща Abramis brama L. Шекснинского плеса Рыбинского водохранилища при разных уровнях накопления органических токсикантов // Вопросы ихтиологии. 2001. Т. 41. №2. С.249-252.
6. Зубкова Н.Н., Зубкова Е.И. и др. Роль и возможности применения микроэлементов при заводском воспроизводстве и выращивании
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
рыб // Вопросы рыбного хозяйства Беларуси. Сборник научных трудов. 2007. Вып.24. Минск: РУП «Институт рыбного хозяйства» С. 85- 88.
7. Леус Ю.В., Арсан В.О., Груби н ко В.В. Прооксидантно-антиоксидантный статус организма карпа при действии ионов меди, марганца, свинца и цинка // ДОП. Нац. АН Украши. 1998. № 7. С.155-159.
8. Микряков В.Р. Закономерности формирования приобретенного иммунитета у рыб. Рыбинск. 1991. 154 с.
9. Перевозников М.А., Богданова Е.А. Тяжелые металлы в пресноводных экосистемах. СПб.: ГосНИОРХ. 1999 . 228 с.
10. Ребров В.Г., Громова О.А. Витамины, макро- и микроэлементы. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2008. 260 с.
11. Семенов В.Л., Ярош А.М. Метод определения антиокислительной активности биологического материала // Укр. биохим. журн., 1985. Т.57. № 3. C. 50-52.
12. Силкина Н.И., Микряков В.Р. Влияние Lígula intestinalis на некоторые показатели липидного обмена селезенки хозяина - леща Abramis brama разного возраста // Паразитология. 2005. Т. 39. Вып. 4. С. 299-305.
13. Силкина Н.И., Микряков В.Р. Влияние сублетальных концентраций ионов кадмия на некоторые показатели липидного обмена рыб // Токсикол. вестн. 2006. № 1. С. 20-24.
14. Силкина Н.И., Микряков В.Р. Микряков Д.В. Влияние фенола и карбофоса на показатели ПОЛ в печени рыб // Принципы и способы сохранения биоразнообразия: мат. III всерос. науч. конф. / Мар. гос. ун-т. Йошкар-Ола; Пущино, 2008. С. 449-450.
15. Силкина Н.И., Микряков Д.В., Микряков В.Р. Изменение показателей липидного обмена в иммунокомпетентных органах карпа Cyprinus carpio под влиянием гормона стресса кортизона // Вопросы ихтиологии, 2007, Т. 47, № 6. С. 854-857.
16 Folch J., Lees M., Stenley G.N. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animals tissues // J. Biol. Chem. 1957. V. 226. № 3. P. 497-509.
17. Romeo M., Bennani N., еt al. Cadmium and copper display different responses to wards oxidative stress in the kidney of the sea bass Dicentrarchus labrax // Aqual. Toxicol. 2000. V.48. № 2-3. P. 185-194.
N.I. Silkina, D.V Mikryakov, V.R. Mikryakov
Effect of low concentrations of copper ions on immunobiochemical indices in the carp young ( Cyprinys Carpio)
I.D. Papanin Institute of Inland Waters Biology, Russian Academy of Sciences, Borok, Yaroslavl Region
The article presents the outcome of investigations of the effect of CuSO4 low concentrations ( 0.02 and 0.002 mg/l) on the function of humoral immunity, lipid peroxidation and anti-oxidant activity in carp young tissues. The dependence of changes in characteristics under investigation on concentrations of the pollutant and time of stay of fishes in the toxicant solution is shown.
Материал поступил в редакцию 03.06.09
