CC BY
27
СОСТОЯНИЕ ПРОЦЕССОВ КЛЕТОЧНОГО ОБНОВЛЕНИЯ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДКА И ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ВАРИАНТАХ ГЕЛИКОБАКТЕРНОЙ ИНФЕКЦИИ
Г.Л. Игнатова *, АС. Сарсенбаева, С.Н. Теплова УГМАДО*, г. Челябинск УГМА, г. Челябинск
Исследованы процессы апоптоза н пролиферации клеток в слизистой оболочке желудка, позитивной и негативной активации лимфоцитов в системном кровотоке у больных с геликобактер-ассоциированным гастритом и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки.
Длительное время значение гибели клеток недооценивалось, однако в последнее время интерес к механизмам ее реализации значительно повысился, и эта проблема стала одной из наиболее интенсивно изучаемых областей медицины [6]. В физиологических условиях существует баланс процессов апоптоза и пролиферации в тканях, осуществляемый по принципу обратной связи [8]. Процессы апоптоза могут существенно меняться под влиянием инфекции Helicobacter pylori (Н. pylori). Механизмы, посредством которых Н. pylori осуществляют модификацию апоптоза до конца не изучены [1]. Группа исследователей пришла к заключению, что Н. pylori обладает способностью как непосредственно (за счет действия уреазы и липополисахарида), так и опосредованно (через индукцию цитокинов иммунного генеза) влиять на клеточное обновление [7]. В патологии подавление апоптоза удлиняет продолжительность жизни клеток, из-за чего увеличивается возможность возникновения в них вторичных дополнительных изменений, метаплазии, малигниза-ции [2, 5]. Усиление клеточной гибели компенсируется параллельным ростом пролиферативной активности тканевых клеток, на которые могут оказывать влияние иммуноциты. При высокой экспрессии маркеров пролиферации отмечается выраженная инфильтрация слизистой оболочки желудка (СОЖ) лимфоцитами, что отражает их участие в регуляции клеточного обновления и репарации тканей [3]. Механизм взаимодействия Н. pylori с иммунокомпетентными клетками и влияние на клеточное обновление в желудке еще недостаточно изучен и представляет большой интерес для исследователей [6].
Цель исследования
Изучение состояния процессов клеточного обновления в слизистой оболочке желудка и лимфоцитов крови при вариантах геликобактерной инфекции.
Материал и методы
Обследовано 118 больных с клинически манифестной инфекцией Н. pylori в период обострения, из них с хроническим неатрофическим гастритом (ХГН) - 27, с хроническим атрофическим
гастритом (ХГА) - 24, с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки неосложненного течения (ЯБН) - 32, с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, осложненной кровотечением (ЯБО) -35 больных. Наличие Н. pylori верифицировалось 4 методами: гистологическим, уреазным, иммуно-ферментным, полимеразно-цепной реакцией (ПЦР). Оценку морфологических изменений СОЖ проводили с помощью визуально-аналоговой шкалы. Для идентификации эпителиальных клеток слизистой оболочки (СО) антрального отдела желудка методом иммуногистохимического анализа в серийных гистологических парафиновых срезах использовали поликлональные антитела на белок р53, Ki 67, универсальный набор «ИММУМАРК» производства «МР Biomedicals», ICN и RTU К 67 производства «Novo Castra laboratories». Индекс апоптоза (р53) определялся как процент положительно окрашенных эпителиоцитов в 10 случайно выбранных полях зрения (1000 клеток). В препаратах при 400-кратном увеличении микроскопа определяли индекс пролиферации (ядерная метка Ki 67) как долю (в %) положительно окрашенных ядер эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в 5 случайно выбранных полях зрения (500 клеток). Иммунологическое исследование включало: CD-типирование лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих маркеры позитивной (CD25) и негативной активации (CD95). Морфологическую оценку апоптоза лимфоцитов осуществляли с помощью суправитальной окраски клеток ядерным красителем Hoechst 33342 («Boehringer Mannheim»), выявляющим апопготиче-скую фрагментацию ядер. Определение цитоплазматического продукта гена bcl-2 с антиапоптогенными свойствами проводили на проточном цитофлуори-метре EPICS XL. Достоверность различий оценивали параметрическими и непараметрическими методами. Для оценки силы и направленности взаимосвязи между количественными признаками проводилось вычисление рангового коэффициента корреляции Спирмена.
Результаты и их обсуждение При ЯБО инфекция Н. pylori гистологическим методом выявлена в 90,4% случаев, в группе
ЯБН - 95,3 %, при ХГН в - 98 %, при ХГА - в 85 %. В структуре степени обсемененности СОЖ Н. pylori при ЯБО достоверно преобладали случаи с высокой степенью обсемененности Н. pylori - 71,6 %, при ЯБН умеренной степени обсемененности Н. pylori -73,5 %, при ХГН - слабой степени - 55 %, при ХГА -высокой степени - 46 %. Средний балл степени обсемененности Н. pylori при ЯБО 2,80 ± 0,07; ЯБН 2,10 ± 0,01; (р < 0,05) ХГН 1,87 ± 0,09; ХГА 1,92 ±0,11 (р > 0,05). В 92 % ЯБО вирулентные штаммы были Vac А - позитивными (vacuolating-associated cytotoxin) (р < 0,01), из них 76 % были с генотипом sl/s2. В группе больных с ЯБН вирулентные штаммы были представлены в 75 % VacA
геном (генотип m2) с исходно незначительной токсической активностью [3]. В 67 % определялся смешанный генотип по аллелям VacA гена и генов CagA (cytotoxin-associated gene), IceA (induced by contact with epithelium) и был представлен следующими вариантами: sl/s2, sl/s2 + ml + m2, sl/s2 + m2, sl/s2 + cagA, sl/s2 + iceA2, ml + cagA + iceA2. При ХГН и ХГА изучаемые вирулентные штаммы не определялись. Средний балл воспаления СО в антральном отделе составил при ЯБО 2,50 ± 0,03; ЯБН 1,70 ± 0,15 (р < 0,05); ХГН 2,15 ±
0,07; ХГА 2,2 ± 0,12 (р > 0,05). Результаты имму-ногистохимического анализа эпителиоцитов СОЖ приведены в табл. 1.
Таблица 1
Количество эпителиоцитов в СОЖ, экспрессирующих р53 и Ki 67
Показатели ХГН п = 5 ХГА п = 5 ЯБН п = 5 ЯБО п= 5 Контрольная группа п = 5
р53 в поверхностном эпителии, % 4,12 ± 0,17** 6,76 ±1,25* 8,60 ±0,04*** 5,70 ± 0,76 **•• 3,12 ± 0,23
р53 в ямочном эпителии, % 5,41 ± 1,34 7,71 ± 1,17** 6,40 ±1,22* 4,70 ±0,36* 3,51 ±0,15
И 67 в поверхностном эпителии, % 13,37 ± 0,32 16,34 ± 1,04* 14,67 ± 1,42 13,75 ±3,09 12,54 ± 1,54
Ю 67 в ямочном эпителии, % 14,91 ± 1,45 14,99 ± 1,5 14,16 ±2,20 15,73 ±2,06 12,01 ±0,97
*-р<0,05; **—р < 0,01; ***-р< 0,001 -статистическая значимость различий с данными контрольной группы;
• - р < 0,05; •• -р < 0,01; ••• - р < 0,001 - статистическая значимость различий между ХГН - ХГА и ЯБН - ЯБО.
Практически во всех группах больных получено достоверное увеличение индекса апоптоза в поверхностном и ямочном эпителии в сравнении с контрольной группой (в 1,3-2,7 раза). При ХГН и ХГА показатели экспрессии р53 не имели достоверных отличий, при ЯБО отмечен достоверно низкий индекс апоптоза в сравнении с ЯБН (р < 0,01). Индекс пролиферации не отличался от показателей в контрольной группе, лишь при ХГА в сравнении с ХГН выявлена повышенная пролиферативная активность в поверхностном эпителии (16,34 ± 1,04 %). Как правило, темпы пролиферации эпителиоцитов коррелируют с выраженностью воспаления. Наибольшим стимулирующим влиянием на пролиферацию по данным В.А. Исакова обладает штамм Н. pylori CagA + VacA + подтипа si а, в то время как апоптоз уменьшается, это дает значительно больше шансов выжить эпи-телиоцитам с поврежденной ДНК [3]. В нашем исследовании получена отрицательная корреляционная зависимость между генотипом VacA и показателями Ki67 (г =-0,7; р < 0,01), что может свидетельствовать о подавлении пролиферативной активности при геликобактерном воздействии. По данным В.А. Исакова, И.В. Домарадского вопрос о том, зависит ли стимуляция пролиферации от типа штамма Н. pylori или нет, пока остается без окончательного ответа [4]. При проведении корреляционного анализа между показателями индекса апоп-
тоза и пролиферации получена положительная корреляционная связь у больных с ЯБН в показателях ямочного эпителия (г = 0,9), в остальных группах больных наблюдалась разобщенность в процессах клеточного обновления. Данные о состоянии иммунных клеток, признаках их позитивной и негативной активации, процессах апоптоза иммуноцитов приведены в табл. 2.
Изучение общего содержания лейкоцитов и лимфоцитов в системном кровотоке выявило достоверно повышенный уровень лейкоцитов при ХГА, ЯБО и снижение общего количества лимфоцитов при ЯБО, что является стандартной реакцией клеток крови на повреждение в связи с перераспределением лимфоцитов, миграцией в очаг воспаления.
Уровень естественных киллеров (СБ16) был достоверно повышен в сравнении с контролем во всех группах больных. У больных с ЯБО выявлено снижение числа СБ25 клеток в системном кровотоке (р < 0,05), что отражает уменьшение числа клеток, экспрессирующих рецепторы позитивной активации (к интерлейкину - 2). Во всех группах наблюдалось достоверное снижение количества клеток, экспрессирующих рецепторы готовности к апоптозу. Максимальный дисбаланс с преобладанием процессов позитивной и негативной активации лимфоцитов установлен при ЯБО, о чем свидетельствует рост соотношения
Игнатова Г.Л., Сарсенбаева А.С., Теплова С.Н.
Состояние процессов клеточного обновления в слизистой оболочке желудка...
СБ25/СБ95. При ЯБО и ХГА отмечено снижение числа лимфоцитов, экспрессирующих антиапоп-тогенный белок Вс1-2, снижен индекс реализации апоптоза лимфоцитов, который рассчитывается как процент клеток с морфологическими признаками фрагментации ядра от общего числа СБ95 -позитивных клеток. Индекс реализации апоптоза в кровотоке был минимальным у больных с ЯБО
Соотношение числа клеток с маркерами процессов позитивной / негативной активации во всех группах было больше единицы, тогда как в контрольной группе показатель составил 0,7, что отражает превалирование при Н. pylori инфекции процессов позитивной активации лимфоцитов над негативной и формирование клеточного иммунного ответа на инфекцию (табл. 2). У больных с ХГН при корреляционном анализе выявлены прямые взаимосвязи между уровнем CD25, CD95 и bcl-2 fa = 0,97 и г2 = 0,90), что не было характерно для группы больных с язвенной болезнью. При ЯБО установлена отрицательная (г =-0,8) корреляционная связь между численностью NK (натуральные киллеры) клеток, CD25 в крови, с одной стороны, и числом р53 позитивных клеток поверхностного эпителия - с другой. Выявленные связи отражают участие NK и CD25 в понижающей регуляции уровня апоптоза эпителиоцитов.
Выводы
1.При клинических вариантах геликобакгер-ной инфекции (хронический неатрофический, атрофический гастрит, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки неосложненного и осложненного течения) выявлено усиление процессов апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке антрального отдела желудка в 1,3-2,7 в сравнении с контролем и не наблюдалось адекватной пролифера-
(р < 0,05). Таким образом, при ХГН и ЯБН наблюдается рост числа естественных киллеров и сниженная готовность клеток к апоптозу. При ЯБО определялись самые низкие в циркуляции количества естественных киллеров и лимфоцитов с маркерами готовности к апоптозу, низким был индекс реализации апоптоза в сравнении с другими больными.
тивной активности эпителиоцитов в ответ на повреждение.
2. Число натуральных киллеров в кровотоке при обострении Helicobacter pylori-ассоции-рованных заболеваниях гастродуоденальной зоны существенно увеличивается, минимальный рост числа этих клеток отмечен при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки осложненного течения.
3. При хроническом гастрите с явлениями атрофии и осложненном течении язвенной болезни наряду с подъемом численности CD25 клеток, снижением лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы готовности к апоптозу, и уменьшением апоптотиче-ской гибели клеток наблюдалось превалирование процессов позитивной активации лимфоцитов над негативными.
Литература
1. Аруин Л.И. Апоптоз в механизме поражений желудка, обусловленных влиянием Helicobacter pylori // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1999. - N° 2. -С. 26-30.
2. Белушкина Н.Н., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза // Архив патологии. - 2001. -№ 1. — С. 51—60.
3. Исаков В.А. Молекулярно-генетические основы патогенности Helicobacter pylor // Рос.
Таблица 2
Характеристика лимфоцитов-маркеров апоптоза при вариантах геликобактерной инфекции
Показатели Контрольная группа (п = 30) ХГН (п = 19) ХГА (п = 20) ЯБН (п = 23) ЯБО (п = 20)
Лейкоциты, (х 109) /л 4,80 ± 0,12 5,80 ±0,40 6,17 ± 0,46* 5,70 ± 0,29 7,90 ± 1,37*
Лимфоциты, % 28,70 ± 0,76 30,60 ± 1,30 31,57 ± 1,04* 26,80 ±0,85 23,40 ± 1,90*
CD 16, абс. 0,20 ± 0,03 0,30 ±0,02* 0,32 ± 0,04* 0,30 ±0,01 0,20 ± 0,03
CD 16, % 11,50 ±1,41 18,40 ± 1,10** 16,57 ±0,01** 20,10 ±0,81* 17,10 ± 0,90**
CD25, абс. 0,30 ± 0,03 0,30 ± 0,04 0,31 ±0,03 0,30 ± 0,03 0,20 ± 0,03*
CD 25, % 15,20 ±0,09 16,70 ± 1,96 17,16 ±1,25 18,20 ±1,43* 11,80 ± 1,67*»
CD95, абс. 0,50 ± 0,05 0,20 ± 0,04* 0,23 ± 0,04*** 0,20 ± 0,04* 0,10 ±0,03*
CD 95, % 23,04 ± 0,40 14,70 ±2,28* 11,43 ±1,57*** 13,80 ±1,79* 6,80 ±1,23**
ИРА, % 5,90 ± 0,48 3,00 ± 0,32* 3,22 ± 0,37*** 4,40 ± 0,47 2,90 ± 0,46* ••
CD25/CD95 0,7 1,2 1,5 1,2 1,5
Вс1-2, % 18,3 5,23** 36,5**»»» 38,5* 10,8*
ИРА - индекс реализации апоптоза; * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 - статистическая значимость различий с данными контрольной группы; • - р < 0,05; - р < 0,01; ••• - р < 0,001 - статистиче-
ская значимость различий между ХГН-ХГА и ЯБН-ЯБО.
журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. — 2002.-№6.-С. 82-86.
4. Исаков В.А., Домарадский И. В. Хе-ликобактериоз. - М: ИД Медпрактика, 2003 - 412 с.
5. Пушников Е. Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). - М.: Медицина. —2001. -192 с.
6. Процессы апоптоза и пролиферации при патологии желудочно-кишечного тракта и печени /В.Т. Ивашкин, Т.Л. Лапина, О.Ю. Бондаренко и
др. // Рос. зкурн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2002. -№ 6. - С. 38-43.
7. Шептулин А.А., Марданова О.А. Обсуждение проблемы инфекции Helicobacter pylori в ходе Европейской гастроэнтерологической недели // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2004. -М2. - С. 88-92.
8. Bellamy Ch. О С. р53 and apoptosis // Brit. Med. Bull. -1997. - Vol. 53. -P. 466-477.
