CC BY
25УДК: 617-089
Шулепов А. В.1, Юркевич Ю. В.1, Шперлинг И. А.1, Шперлинг Н. В.1, Айзенштадт А. А.2
СОСТОЯНИЕ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КОМПРЕССИОННОЙ ТРАВМЕ ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ В ПОВРЕЖДЕННЫЕ ТКАНИ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
1 ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» МО РФ, 195030, ул. Лесопарковая д.4, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация;
2 ООО «Покровский банк стволовых клеток», 199106, Большой пр. В.О., 85, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Для корреспонденции: Шулепов Александр Васильевич, младший научный сотрудник ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» МО РФ, E-mail: [email protected]
For correspondence: Alexandr V. Shulepov, junior researcher of Federal State Budgetary Establishment "State Scientific Research Test Institute of the military medicine" of the Ministry of defence of the Russian Federation. E-mail: soash@ mail.ru
РЕЗЮМЕ
На модели продолжительной статической компрессии мягких тканей нижней конечности у крыс с помощью метода лазерной доплеровской микрофлоуметрии исследована регионарная пересадка в область сдавления скелетных мышц культивированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека в среде геля низкомолекулярной гиалуроновой кислоты. Установлено снижение выраженности микроциркуляторных нарушений в зоне компрессии мягких тканей, улучшение кислородного питания тканей, снижение выраженности окислительных процессов в поврежденной мышечной ткани.
Ключевые слова: компрессионная травма, микроциркуляция, перфузия, траневая оксигенация, лазерная допплеровская флоуметрия, скелетная мышца, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки человека, гиалуроновая кислота.
SUMMARY
MICROCIRCULATION CONDITION AFTER APPLICATION OF PREPARATION BASED ON HUMAN MESENCHYMAL STROMAL CELLS INTO DAMAGED TISSUES DURING EXPERIMENTAL COMPRESSION TRAUMA
Shulepov A.V., Yurkevich Yu.V., Shperling I.A., Shperling N.V., Aizenshtadt A.A.
Basing on a model of continuous static compression of soft tissues of rat hindlimb using laser doppler microflow-metry method, we have studied effectiveness of regional transplantation of human adipose tissue mesenchymal stem cells in low molecular hyaluronic acid gel environment. Research shows decrease of microcirculatory disorders intensity in soft tissues compression area and improvement of oxygen supply in damaged muscular tissue.
Key words: crush-syndrome; microcirculation; perfusion, tissue oxygenation, laser Doppler flowmetry, skeletal muscle, mesenchymal stem cells, hyaluronic acid.
Проблема ранней коррекции посткомпрессионных расстройств микроциркуляции области повреждения при синдроме длительного сдавления мягких тканей носит фундаментальный характер [1]. Посттравматическая регенерация скелетных мышц является многогранным процессом, требующим пространственной и временной координации, прежде всего, механизмов мио- и ангиогенеза [2]. Реваскуляризация регенерирующих скелетных мышц на микро-циркуляторном уровне опосредуется экспрессией ангиогенных ростовых факторов, что открывает новые терапевтические возможности
[3]. В последние годы перспективные направления в этой области связаны с разработкой технологии клеточной терапии [4]. Доказан вклад мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) в процесс посттравматической регенерации и реваскуляризации поврежденных скелетных мышц [5]. Известно, что ММСК присутствуют в организме в качестве тканевого резерва, участвуя в физиологической и репа-ративной регенерации путем дифференциров-ки в различные типы клеток мезенхимально-го происхождения и выработки паракринных факторов, которые способствуют повышению
выживаемости поврежденных клеток и активации резидентных предшественников [6]. Наибольшее значение в процессах регенерации придается паракринной активности ММСК [7]. В частности, ряд ростовых факторов, продуцируемых ММСК, играют ключевую роль в репаративном миогенезе путем активации миосателлитоцитов и ускоренного образования функционирующей сосудистой сети [8, 9].
В этой связи практический интерес представляют паракринные потенции ММСК в аспекте комплексной оценки состояния микроциркуляции в области компрессионно-ишемиче-ского повреждения мягких тканей. Настоящее исследование посвящено экспериментальному изучению микроциркуляторных нарушений мягких тканей в постишемический период тяжелой компрессионной травмы и определении возможности их коррекции пересадкой ММСК человека в область повреждения.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования выполнено на 180 половозрелых белых беспородных крысах самцах, массой 300 - 340 гр., полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская область, Россия). Возраст крыс составлял 3,5-4 месяца. Животные находились в виварии при постоянной температуре со свободным доступом к пище и воде, проходили в течение 14 дней карантин с ежедневным осмотром. Все опыты на животных выполнены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1989). Исследование одобрено Комитетом по этике ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» МО РФ.
Перед проведением эксперимента животных наркотизировали внутримышечным введением смеси кетамина и ксилазина из расчета 60 мг/ кг и 10 мг/кг веса тела соответственно каждого препарата [10]. Механической компрессии подвергалась правая задняя конечность на уровне голени в течение 7 ч с силой сдавления 10-12 кг/ см2. Воспроизводимость модели достигалась использованием специально изготовленных металлических тисков, а также измерением силы сдавления с помощью электронного измерительного устройства. Контрлатеральная конечность компрессии не подвергалась. Наблюдение за животными осуществляли в течение 30 суток после воздействия. В предварительных экспериментах летальность животных в течение первых 7 суток посткомпрессионного периода достигала 20-30%, что позволяет квалифицировать травму
как тяжелую с развитием выраженных местных и системных реперфузионных нарушений [11].
Все животные, подвергнутые компрессионной травме, были разделены на 3 группы по 60 животных: I группа (контроль I) животные с компрессионной травмой, которым в зону поврежденных мягких тканей вводили изотонический раствор хлорида натрия.
II группа (контроль II) травмированные животные, которым в зону поврежденных мягких тканей в качестве клеточного носителя вводили раствор геля гиалуроновой кислоты (Hyalift 3,5% «Aestetic Dermal S.L.», Испания). Концентрация геля гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 250 кДа) в рабочем растворе составляла 1,75%, что обеспечивало необходимую текучесть и продолжительное удержание клеточной суспензии в поврежденных мягких тканях.
III группа (основная) - травмированные животные, которым в зону поврежденных мягких тканей выполнялась регионарная пересадка суспензии культивированных ММСК жировой ткани человека в составе геля гиалуроновой кислоты. Содержание ММСК составляло 3*106 клеток/мл геля.
Донорами жировой ткани выступали пациенты, которым с информированного согласия во время планового хирургического вмешательства проводилась эксплантация фрагментов подкожной жировой клетчатки. Полученные в результате обработки коллагеназой клетки отмывали, клеточный осадок ресуспендировали в полной культуральной среде альфа МЕМ/Advanced Stem Cell Media (HyClone, Германия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Германия). Клетки культивировали в монослое при 370С в атмосфере 5% СО2 [12]. Культуры, удовлетворяющие критериям контроля качества (по результатам иммунофенотипирования, ка-риотипирования, отсутствию микробной контаминации), подвергали субкультивированию. Суспензию ММСК, полученную после обработки культуральных флаконов, готовили на изотоническом солевом растворе в концентрации 6x106 клеток/мл. Гель гиалуроновой кислоты вносили в клеточную суспензию на изотоническом солевом растворе в соотношении 1:1. Клеточную суспензию ММСК (1,5x106 клеток) и препараты контрольных групп вводили в область компрессии внутримышечно веерным обкалыванием в суммарном объеме 0,5 мл однократно через 3 часа после снятия тисков.
Наблюдение за животными проводили через 7, 14 и 28 суток после прекращения сдавления конечности, что соответствовало переходным срокам начального, промежуточного и позднего посткомпрессионного периодов [13].
Состояние микроциркуляции в зоне компрессии определяли с помощью многофункционального диагностического комплекса «ЛАКК-М» (НПП «Лазма», Россия). Датчик прибора устанавливали на задней поверхности мышц голени после небольшого разреза кожи в проекции их наибольшего выпячивания. Экспозиция каждого определения составляла 5 минут. Глубина зондирования объема ткани 1,5 - 2 мм [14].
Измерения параметров микроциркуляции осуществляли путем совмещения методов лазерной доплеровской микрофлоуметрии (ЛДФ), оптической тканевой оксиметрии (ОТО) и лазерной флуоресцентной спектроскопии (ЛФС). С помощью ЛДФ оценивали интенсивность микрогемоциркуляции по показателям постоянной (ПМ) и переменной (о) составляющей перфузии в перфузионных единицах (пф.ед.). Методом ОТО определяли показатель относительного объема фракции эритроцитов (Уг, %), уровень сатурации кислорода в системе микрогемоциркуляции по величине показателя среднего относительного насыщения кислородом микроциркуляторного русла биоткани (802,%), индекса перфузионной сатурации кислорода (8ш, усл. ед.) в микрокровотоке, величины общего потребления кислорода тканями на единицу объема циркулирующей крови (и, усл. ед.) [15]. Методом ЛФС изучали спектры флуоресценции восстановленной формы никотина-мидадениндинуклеотида (НАДН) и окисленной формы флавинадениндинуклеотида (ФАД). Для оценки утилизации кислорода использовали флуоресцентный показатель потребления кислорода коферментов, участвующих в дыхательной цепи, который обратно пропорционален редокс-отношению: ФПК = Анад-н/Афад [16].
Статистическая обработка
Результаты оценивали относительно исходного периода (до нанесения травмы), а также показателей, фиксированных в аналогичной зоне неповрежденной конечности. Полученные данные обработаны с помощью общепринятых статистических методов исследования с использованием вариационно-статистического метода, где рассчитывались средняя арифметическая (М), стандартная ошибка среднего (±ш), уровень достоверности по ^критерию Стьюдента, критерию Ман-на-Уитти. Использовался пакет прикладных программ 81а118Иеа 10. Критическим принят уровень статистической значимости р<0,05.
Результаты. Состояние скелетных мышц в ранний посткомпрессионный период характеризовалось существенным угнетением микроциркуляции в зоне сдавления во всех исследуемых группах (табл. 1). Спустя 7 суток
после декомпрессии конечности показатель перфузии (ПМ) в поврежденных тканях животных, которым после воздействия регионарно вводили изотонический солевой раствор (контрольная группа I) был снижен на 55% (р<0,05) по отношению к исходному периоду (до нанесения травмы), свидетельствуя о развитии перфузионных нарушений. Степень снижения постоянной составляющей перфузии в микроциркуляторном русле травмированных животных, которым в зону сдавления вводили гель гиалуроновой кислоты без клеток (контрольная группа II), а также гель с суспензией ММСК была менее выраженной и составляла 43-44% (р<0,05) от исходного уровня, на 24-27% (р<0,05) превышая показатель перфузии по сравнению с контрольной группой I.
Через 14 суток после декомпрессии во всех исследуемых группах наблюдался прирост показателя перфузии. Тем не менее, среднее значение постоянной составляющей перфузии (ПМ) оставалось достоверно сниженным по сравнению с исходным периодом на 29-42% (р<0,05). Различий показателя перфузии между группами животных, которым вводили гель гиалуроновой кислоты без клеточного компонента и с суспензией ММСК не отмечалось.
Такие различия регистрировались в поздний посткомпрессионный период. К исходу 28 суток наблюдения средние значения ПМ в поврежденной мышечной ткани животных, которым проводили регионарное обкалывание суспензией ММСК в составе геля гиа-луроновой кислоты, на 30-32% (р<0,05) был выше, чем в контрольных группах и приближался к исходному показателю микроциркуляции до нанесения компрессионной травмы.
Аналогичная динамика установлена при оценке переменной составляющей перфузии. Среднее квадратическое отклонение амплитуды колебаний кровотока через 7 суток после декомпрессии конечности животных контрольной группы I было существенно сниженным (на 49%, р<0,05) по сравнению с показателем флакса мышечного кровотока у животных до компрессии, отражая резкое угнетение механизмов активного контроля микроциркуляции. Показатель переменной составляющей перфузии в зоне компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс, которым регионарно вводили гель гиалуроновой кислоты без клеток (контрольная группа II) на 37% (р<0,05) превышал значения контрольной группы I, оставаясь на 30% (р<0,05) ниже показателя до нанесения травмы. Использование суспензии ММСК в составе биогеля после декомпрессии конечности не вносило изменений на данном
сроке исследования в уровень флакса, установленный при введении одного клеточного носителя. Через 14 суток после декомпрессии переменная составляющая перфузии во всех
группах проявляла тенденцию к росту, однако различий между группами животных, которым в поврежденную зону вводили гель гиалуроновой кислоты с ММСК и без них не наблюдалось.
Таблица 1
Показатели постоянной (ПМ), переменной (о) составляющих перфузии, относительного объема фракции эритроцитов (Уг) в зоне компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при регионарной инфильтрации ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты (М±т)
Группы исследования Срок наблюдения после окончания компрессии (сутки) ПМ, пф.ед. о, пф.ед. Vr, %
До нанесения травмы 14,9±1,4 1,62±0,12 16,8±1,8
(n= 18)
Изотонический раствор натрия хлорида (контроль I) 7 6,7±0,31 0,83±0,091 30,1±1,41
(n= 16)
14 8,7±0,51 1,08±0,081 33,8±2,21
(n= 14)
28 9,3±0,41 1,21±0,061 28,1±2,11
(n= 14)
Гель гиалуроновой кислоты (контроль II) 7 8,3±0,41-2 1,14±0,071-2 31,4±1,21
(n= 17)
14 10,3±0,91 1,26±0,0912 29,9±1,51
(n= 15)
28 9,7±1,01 1,27±0,061 27,4±1,91
(n= 15)
Супензия ММСК в геле гиалуроновой кислоты 7 8,5±0,31-2 1,20±0,11 30,6±1,61
(n= 17)
14 10,6±1,41 1,33±0,15 24,7±1,61-2-3
(n= 15)
28 12,8±1,12'3 1,58±0,092'3 21,6±1,71-2-3
(n= 15)
Примечание: n- количество животных; 1р<0,05 - различия с показателями до нанесения травмы; 2р<0,05 - различия с группой, получавшей изотонический раствор натрия хлорида; 3р<0,05 - различия с группой, получавшей гель гиалуроновой кислоты без ММСК.
Прирост показателя переменной составляющей перфузии о в микроциркуляторном русле травмированных животных, которым производили пересадку ММСК в область повреждения, была существенно выше по сравнению с контрольными группами в поздний посткомпрессионный период. К исходу 28-х суток пересадка ММСК в составе клеточного носителя обеспечивала относительно группы животных, которым вводили биогель, не содержащий клеточный компонент, значимое повышение состояния сосудистого тонуса и активацию ме-
ханизмов регуляции кровотока в микроцирку-ляторном русле (на 25%, р<0,05), практически достигая значений о, отмеченного у животных перед нанесением компрессионной травмы.
Перфузионные характеристики микроциркуляции коррелировали с динамикой относительного объема фракции эритроцитов (Уг), оцениваемого по процентному содержанию гемоглобина в тестируемом объеме биоткани. Показатель фракционного объемного кровенаполнения русла в зоне компрессионного повреждения мягких тканей у животных кон-
трольной группы, которым вводили изотонический солевой раствор в 1,7-1,8 раза (р<0,05) превышал значения до нанесения травмы во все исследуемые периоды после декомпрессии. Регионарная пересадка в поврежденные мягкие ткани суспензии ММСК на гелевом носителе уже к исходу 14 суток после декомпрессии тканей позволяла на 17% (р<0,05) снизить относительный объем фракции эритроцитов по сравнению с показателем в контрольной группе животных, получавших гель гиалуроновой кислоты без клеток. Спустя 28 суток после декомпрессии эти различия достигали 22% (р<0,05), свидетельствуя о достоверном вкладе ММСК в развитие восстановительных процессов в микроциркуляторном русле на уровне кровотока в позднем посткомпрессионном периоде.
Реакция системы микроциркуляции на пересадку ММСК в геле гиалуроновой кислоты отчетливо проявлялась при анализе состояния кислородного снабжения поврежденных тканей (табл. 2). Через 7 суток после воздействия у животных контрольной I группы, которым в зону компрессионного повреждения мягких тканей вводили изотонический раствор натрия хлорида, показатель сатурации микрокровотока (802) превышал исходные значения на 58% (р<0,05), что отражает значительное ухудшение кислородного питания тканей в условиях нарушенного кровообращения, приводящее к накоплению в крови нереализованного тканями кислорода. В контрольной II группе травмированных животных, которым вводили гель гиалуроновой кислоты, превышение уровня сатурации кислородом микрокровотока в ранний период декомпрессии было менее выраженным и составляло 36% (р<0,05) от исходных значений, что на 14% (р<0,05) ниже, чем у контрольных животных I группы. Аналогичный уровень сатурации микрокровотока регистрировался в период 7-14 суток исследования также в основной группе животных, которым производили пересадку ММСК в гелевом носителе, что свидетельствует о благоприятных тканевых эффектах гиалуроновой кислоты на протяжении первых двух периодов декомпрессии. Различия сатурации кислородом микрокровотока в области повреждения мягких тканей при регионарной пересадке клеточным трансплантом на основе ММСК наблюдались спустя 28 суток после компрессионной травмы и составляли 15% (р<0,05) относительно контрольных групп.
Наиболее выраженные сдвиги выявлялись при оценке перфузионной сатурации кислорода в микрокровотоке (8ш), отражающей отношение насыщенности кислородом тканей и состояния микроциркуляции, а также удельного по-
требления кислорода тканью (и) в качестве критерия общего потребления кислорода на единицу объема циркулирующей крови. Анализ этих расчетных показателей позволил установить, что ранний период после декомпрессии характеризуется значительным (в 3,5 раза, р<0,05) усилением перфузионной сатурации по сравнению с периодом до нанесения травмы. Индекс удельного потребления кислорода тканью при этом снижался в 4,9 раза (р<0,05). Также более выраженным оказался сдвиг ослабления по отношению к контролю I перфузионной сатурации в группах травмированных животных, которым регионарно вводили гель гиалуроновой кислоты с клеточным компонентом и без него (на 30%, р<0,05), с последующим (в поздний период декомпрессии) более ускоренным снижением до исходных значений данного показателя у животных, которым вводили в гелевой среде суспензию ММСК. Такие сдвиги сопровождались во все периоды исследования устойчивым повышением к исходным значениям удельного потребления кислорода травмированными тканями. Различия между группами животных, которым вводили регионарно ММСК в составе геля гиа-луроновой кислоты и один клеточный носитель к концу наблюдения достигали 76% (р<0,05).
Результаты оптической тканевой оксиме-трии согласуются с динамикой амплитудных характеристик излучения флуоресценции восстановленного НАД и окисленной формы ФАД в зоне компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при регионарной инфильтрации ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты (Табл. 3). Во все исследуемые сроки после воздействия у животных контрольной группы I наблюдалось существенное снижение амплитуды флуоресценции восстановленного кофермента НАД (на 28-33%, р<0,05) по сравнению с амплитудой в интактной мышце при одновременном значительном накоплении (в 1,9-2,4 раза, р<0,05) окисленной формы ФАД. Как следствие, флуоресцентный показатель потребления кислорода тканями (ФПК) в данной контрольной группе значимо снижался (на 61-72%, р<0,05), свидетельствуя о слабой утилизации тканями кислорода и преобладании процессов анаэробного окисления.
Внутримышечное регионарное введение геля гиалуроновой кислоты не содержащего ММСК (контрольная группа II) на всех этапах посткомпрессионных нарушений препятствовало снижению амплитуды флуоресценции НАД-Н и росту окисленной формы ФАД в травмированных тканях, однако эти различия по сравнению с показателями у животных контрольной группы I были недостоверными.
Таблица 2
Показатели сатурации микрокровотока (S02), перфузионной сатурации кислорода в микрокровотоке (Sm), удельного потребления кислорода тканями (U) в зоне компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при регионарной инфильтрации ММСК в составе геля гиалуроновой кислоты
(M±m)
Группы исследования Срок наблюдения после декомпрессии (сутки) S02, % Sm, усл. ед U, усл. ед.
До нанесения травмы 52,5±1,8 3,52±0,54 2,82±0,31
(n= 18)
Изотонический раствор натрия хлорида 7 82,9±2,4! 12,3±0,8! 0,57±0,06!
(n= 16)
14 77,9±1,9! 8,95±0,9! 0,6510,05!
(n= 14)
28 71,2±1,61 7,6±0,7! 1,02±0,081
(n= 14)
Гель гиалуроновой кислоты 7 71,4±1,81-2 8,6±0,71-2 0,91±0,081-2
(n= 17)
14 68,3±1,912 6,6±0,41-2 1,06±0,111-2
(n= 15)
28 72,1±2,21-2 7,4±0,71 1,02±0,141
(n= 15)
Супензия ММСК в геле гиалуроновой кислоты 7 72,3±1,61-2 8,5±0,81-2 0,90±0,112
(n= 17)
14 63,3±1,91-2 5,9±0,51-2 1,48±0,141-2-3
(n= 15)
28 61,2±2,41А3 4,8±0,52'3 1,80±0,1512'3
(n= 15)
Примечание: Обозначения те же, что и в табл. 1.
При пересадке в поврежденные сдавлением мягкие ткани гелевой формы гиалуроновой кислоты, содержащей ММСК, уже в промежуточный период после декомпрессии (через 14 суток) регистрировалась стабилизация флуоресценции восстановленного НАД соответствующая исходному уровню до нанесения травмы с последующим (к исходу 28 суток) ростом амплитуды на 32% (р<0,05) по отношению к показателю у животных, которым вводили биогель без суспензии культивированных клеток. Одновременно при регионарной инфильтрации клеточным препаратом во все сроки исследования значительно менее выраженным (на 22-24%, р<0,05) наблюдалось повышение интенсивности флуоресценции (накопление) окисленной формы ФАД в травмированных тканях животных по сравнению с использованием одного геля
гиалуроновой кислоты в качестве контроля. Совокупным отражением наблюдаемых изменений явилась оценка флуоресцентного показателя потребления кислорода ферментов дыхательной цепи в области компрессионной травмы, свидетельствующая о способности культивированных ММСК обеспечивать в составе геля гиалуроновой кислоты динамическое восстановление потребления кислорода поврежденными механическим сдавлением тканями. По мере увеличения времени восстановления (от 7 до 28 суток) у травмированных животных с регионарной пересадкой клеточного трансплантата флуоресцентный показатель потребления кислорода значительно (в 1,4-1,7 раза, р<0,05) превышал показатель у контрольных животных с внутримышечной обработкой поврежденных тканей гелем гиа-луроновой кислоты, не содержащим ММСК.
Таблица 3
Амплитуда излучения флуоресценции восстановленного НАД и окисленной формы ФАД в зоне компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при регионарной инфильтрации ММСК в
составе геля гиалуроновой кислоты (M±m)
Группы исследования Срок наблюдения после декомпрессии (сутки) АНАДН, усл. ед. АФАД, усл. ед. ФПК, усл. ед.
До нанесения травмы 0,96±0,09 0,45±0,07 2,13±0,10
(n= 18)
Изотонический раствор натрия хлорида 7 0,64±0,09* 1,09±0,06* 0,59±0,04*
(n= 16)
14 0,66±0,10* 0,96±0,08* 0,69±0,08*
(n= 14)
28 0,69±0,08* 0,84±0,09* 0,82±0,06*
(n= 14)
Гель гиалуроновой кислоты 7 0,70±0,081 0,92±0,081 0,76±0,081
(n= 17)
14 0,87±0,09 0,83±0,081 1,05±0,091-2
(n= 15)
28 0,89±0,07 0,67±0,061 1,32±0,071-2
(n= 15)
Супензия ММСК в геле гиалуроновой кислоты 7 0,75±0,071 0,71±0,061>2'3 1,06±0,071'2'3
(n= 17)
14 0,96±0,112 0,63±0,051-2-3 1,52±0,081'2'3
(n= 15)
28 1,18±0,092'3 0,52±0,042'3 2,26± 0,072'3
(n= 15)
Примечание: Обозначения те же, что и в табл. 1.
ОБСУЖДЕНИЕ
Проблема ранней коррекции расстройств микроциркуляции в области компрессионного повреждения мягких тканей при синдроме длительного сдавления тяжелой степени сохраняет актуальность. Регенерация мышц после травмы опосредуется через восстановление микроциркуляции [17]. Имеются доказательства вклада стволовых клеток в процессы регенерации и ан-гиогенеза в поврежденной скелетной мышечной ткани [18]. Накапливаются данные о том, что в основе регенеративного эффекта ММСК лежат два механизма: дифференцировка МСК после их рекрутирования в место повреждения и их паракринное влияние [19]. В последние годы именно паракринным механизмам придается все большее значение в реализации регенеративных эффектов ММСК [20]. Тем не менее, возможные направления мио- и ангиогенеза
при массивном повреждении скелетных мышц с позиций паракринной функции ММСК в условиях их регионарного применения остаются открытыми. Пересадка культивированных ММСК человека непосредственно в место повреждения мягких тканей экспериментальным животным может оказаться адекватной ксеногенной моделью изучения паракринных эффектов, в том числе активации ангиогенеза и оценки участия стволовых клеток в регенеративном процессе без in situ клеточной дифференцировки. Проведённое нами исследование состояния микро-гемоциркуляции при экспериментальном моделировании на крысах компрессионной травмы тяжелой степени показало, что начальный, промежуточный и поздний этапы посткомпрессионного периода характеризуются значительным снижением кровоснабжения поврежденных мягких тканей, включая различной степени
расстройства капиллярного кровотока. Регионарная внутримышечная пересадка животным в зону повреждения мягких тканей культивированных ММСК человека в геле гиалуроновой кислоты сопровождалась нарастающим восстановлением микроциркуляции, повышала эффективность кислородного обмена в ишеми-зированной мышечной ткани, препятствовала прогрессированию окислительных процессов в условиях реперфузии. К исходу 28 суток после окончания компрессии показатели лазерной до-плеровской микрофлоуметрии, оптической тканевой оксиметрии и лазерной флуоресцентной спектроскопии достоверно отличались от значений у животных контрольной группы, которым вводили гель гиалуроновой кислоты без клеток. Таким образом, есть основания полагать, что ММСК человека в ксеногенной системе сохраняют жизнеспособность при регионарной пересадке и обладают паракринным регенеративным эффектом на уровне микроциркуляции.
Отдельного рассмотрения заслуживает анализ функционирования локально имплантированных ММСК в условиях окислительного стресса, присущему реперфузионному синдрому при тяжелой компрессионной травме. Известно, что эффективность клеточной терапии в данном случае будет зависить от устойчивости клеток к повреждающим воздействиям, в том числе, окислительному стрессу, развитие которого наблюдается в очагах поражения [21, 22]. Можно предположить, что наблюдаемое в рамках эксперимента снижение выраженности микроциркуляторных нарушений в ишемизи-рованных тканях связано с ранним (спустя 3 часа после декомпрессии) введением ММСК в зону повреждения, что позволило реализовать жизнеспособным культивированным клеткам паракринный эффект до развития реперфузии. Действительно, жизнеспособность ММСК может оставаться на высоком уровне при культивировании в разных по содержанию О2 условиях [23]. Имеются данные, свидетельствующие о высокой устойчивости ММСК к условиям анок-сии [24]. Также нельзя исключать способности ММСК перестраивать скорость метаболических процессов при изменении содержания кислорода в окружающей среде [25]. В ответе стволовых клеток на окислительный стресс важную роль играют транскрипционные факторы, в частности фактор, индуцируемый гипоксией (hypoxia-inducible factor - HIF) [26]. Экспрессия HTF-1a является регулятором генов, вовлеченных в процессы дифференцировки и ангиогенеза [27].
Разработка препаратов на основе культивированных клеток закономерно ставит вопрос о выборе клеточных носителей [28]. Из
доступных и достаточно изученных гидрогелей наибольший интерес вызывает низкомолекулярная гиалуроновая кислота [29]. Показано, что имплантация культивированных ММСК человека совместно с гелем гиалуроно-вой кислоты в зону дефекта сосцевидного отростка височной кости значительно ускоряла у морских свинок регенерацию костной ткани. Включение в деминерализованный костный матрикс ММСК без геля гиалуроновой кислоты не приводило к полному новообразованию кости [30]. Следовательно, эффективный осте-огенез с использованием ксеногенных ММСК достигался имплантацией клеток на основе гидрогеля гиалуроновой кислоты. Кроме того, регенерация костного дефекта в этих условиях не сопровождалась развитием местных воспалительных реакций на пересадку генетически чужеродных клеток. В наших экспериментах на модели компрессионной травмы мягких тканей нижней конечности у крыс имплантация в область повреждения геля низкомолекулярной нестабилизированной гиалуроновой кислоты без клеточного компонента позволяла уже в ранние сроки после декомпрессии улучшить перфузионные характеристики микроциркуляции, положительно влиять на трофику и окислительный метаболизм скелетной мышечной ткани, что значительно расширяет показания ее к применению не только в эстетической медицине, но и в практике хирургии повреждений.
ВЫВОДЫ
1. Компрессионное повреждение мягких тканей тяжелой степени сопровождается развитием микроциркуляторных расстройств, характеризующихся синхронным снижением перфузии, ослаблением флакса тонусформирующих звеньев модуляции микрокровотока, прогрессирующим падением утилизации кислорода поврежденными тканями, угнетением активности окислительно-восстановительных процессов на клеточном уровне. Наиболее выраженные нарушения микрогемоциркуляции в мягких тканях сдавленных конечностей формируются в ранний посткомпрессионный период (в первые 7 суток) с нестойким улучшением показателей в последующие периоды декомпрессии.
2. Внутримышечная инфильтрация зоны компрессионного повреждения мягких тканей гелем гиалуроновой кислоты в качестве клеточного носителя позволяет улучшить показатели микроциркуляции, кислородного обмена и окислительных процессов, что свидетельствует о корригирующем эффекте по сравнению с физиологическим раствором равного объема. Частичное восстановление микроциркуляции, показа-
телей сатурации кислорода и аэробного окисления регистрировалось на протяжении раннего и промежуточного периодов после декомпрессии.
3. Регионарная внутримышечная пересадка экспериментальным животным в область ишемического повреждения конечности культивированных ММСК человека в составе геля гиалуроновой кислоты сопровождается динамическим ростом постоянной и переменной составляющих перфузии, показателей потребления кислорода тканями, снижением выраженности окислительных процессов в поврежденной мышечной ткани. Положительные изменения микроциркуляции до величин, близких к исходным, на фоне компенсации энергетического метаболизма наблюдаются в промежуточный и, особенно, поздний (к исходу 28 суток) периоды декомпрессии.
4. Сочетанное регионарное применение ММСК и геля низкомолекулярной гиа-луроновой кислоты оказывает синергичное и продолжительное действие на восстановительные процессы в системе микрогемо-циркуляции поврежденной компрессионной травмой мышечной ткани, снижая степень тяжести реперфузионных повреждений.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Османова, А. А. Динамика микроциркуляторного русла при компрессионной травме мягких тканей конечностей и коррекции инфузией перфторана (экспериментальное исследование): Дис. ... канд. мед. наук. Махачкала; 2010. Доступно по http://qoo.by/Doy. Ссылка активна на 21.10.2016.
2. Flann K. L., Rathbone C. R., Cole L. C., Liu X., Allen R. E., Rhoads R. P. Hypoxia simultaneously alters satellite cell-mediated angiogenesis and hepatocyte growth factor expression. J. Cell Physiol. 2014;229(5):572-9. doi: 10.1002/ jcp.24479.
3. Шевелева О. Н., Рамазанова С. Г. Влияние ме-зенхимных стромальных клеток на восстановление мышечной ткани после повреждения. II Национальный Конгресс по регенеративной медицине; Декабрь 3-5, 2015; Москва. Доступно по http://www.mediexpo.ru/fileadmin/ user_upload/content/pdf/thesis/thesis_nkrm2015.pdf. Ссылка активна на 21.10.2016.
4. Winkler T., von Roth P., Matziolis G,, Mehta M., Perka C., Duda G. Dose-response relationship of mesenchymal stem cell transplantation and functional regeneration after severe skeletal muscle injury in rats. Tissue Eng. 2009;15(3):487-92. doi:10.1089/ten.tea.2007.0426.
5. Quintero A. J., Wright V. J., Fu F. H., Huard J. Stem cells for the treatment of skeletal muscle injury. Clin. Sports Med. 2009;28(1):1-11. doi: 10.1155/2012/282348.
6. Buravkova L., Andreeva E., Gogvadze V. et al. Mesenchymal stem cells and hypoxia: where are we? Mitochondrion. 2014;19:105-112.
7. Андреева Е. Р., Буравкова Л. Б. Паракринная активность мультипотентных мезенхимальных стро-мальных клеток и ее особенности в условиях гипоксии Физиология человека. 2013;39(3):104-113. doi: 10.7868/ S0131164613030041
8. Парфенова Е. В., Ткачук В. А. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы. Кардиологический вестник. 2007;2(2):5-15.
9. Merritt E. K., Cannon M. V., Hammers D. W., Le L. N., Gokhale R. Repair of Traumatic Skeletal Muscle Injury with Bone-Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Seeded on Extracellular Matrix. Tissue engineering. 2010;16(9):2871-81. doi: 10.1089/ten.
10. Shi, M. Acceleration of skeletal muscle regeneration in a rat skeletal muscle injury model by local injection of human peripheral blood-derived CD133-positive cells. Stem. Cells. 2009;27;949-960. doi: 10.1002/stem.4.
11. Ардашева Е. И. Применение перфторана с целью профилактики осложнений и лечения компрессионной травмы мягких тканей конечностей (экспериментально - клиническое исследование): автореферат дис. ... канд. мед. наук. Кемерово; 2002. Доступно по https:// clck.ru/AD2QR. Ссылка активна на 21.10.2016.
12. Zuk, P. A. Multilineage cells from human adipose tissue for cell-bassed therapies. Tissue engineering. 2001;7(2):211-228. doi: 10.1089/107632701300062859.
13. Нечаев Э. А., Ревской А. К., Савицкий Г. Г. Синдром длительного сдавления: Руководство для врачей. М.: Медицина; 1993.
14. Козлов В. И., Азизов Г. А., Гурова О. А. Лазерная допплеровская флоуметрия в оценке состояния и расстройств микроциркуляции крови. Методическое пособие для врачей. - М.; 2012.
15. Николаев, С. Г. Практикум по клинической электромиографии. Иваново; 2003.
16. Оптическая биомедицинская диагностика. В 2 т. М.: Физматлит; 2007.
17. Чемидронов С. Н. Регенераторные процессы в модулях микроциркуляторного кровеносного русла скелетных мышц после травмы и свободной пластики измельченной мышечной тканью в эксперименте (экспериментально-морфологическое исследование) Авто-реф. дисс. ... канд. мед. наук. Самара; 2008. Доступно по https://clck.ru/AD2U7. Ссылка активна на 21.10.2016.
18. Kawiak J, Brzoska E, Grabowska I, Hoser G. Contribution of stem cells to skeletal muscle regeneration. Folia Histochem Cytobiol. 2006;44(2):75-9.
19. Домарацкая Е. И., Шевелева О. Н., Рамазанова С. Г. Участие мезенхимных стромальных клеток в регенерации мышечной ткани // II Национальный Конгресс по регенеративной медицине; Декабрь 3-5, 2015; Москва. Доступно по http://www.mediexpo.ru/fileadmin/user_ upload/content/pdf/thesis/thesis_nkrm2015.pdf. Ссылка активна на 21.10.2016.
20. Wei X., Yang X., Han Z. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Pharmacologica Sinica. 2013;34(6):747-754. doi: 10.1038/aps.2013.50.
21. Nakagami H., Maeda K., Morishita R. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 2005; 25(12):2242-2547. doi: 10.1161/01. ATV.0000190701.92007.6d.
22. Vanden H. T., Becker L. B., Shao Z. H. Preconditioning in cardiomyocytes protects by attenuating oxidant stress at reperfusion. Circ. Res. 2000;86(5): 541-8. doi: 10.1161/01.RES.86.5.541.
23. Mathew S. A., Rajendran S., Gupta P. K. Modulation of physical environment makes placental mesenchymal stromal cells suitable for therapy. Cell Biol. Int. 2013;37(11): 1197-1204. doi: 10.1002/cbin.10154.
24. Рылова Ю. В., Буравкова Л. Б. Устойчивость муль-типотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани к аноксии in vitro. Цитология. 2014;56(12):881-9.
25. Лобанова М. В. Особенности реализации окислительного стресса в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках при различном содержании кислорода: автореферат дис. ... канд. биол. наук. Москва. 2015. Доступно по http://www.imbp.ru/webpages/WIN1251/ Science/DisserSov/Lobanova2015/Lobanova-dis.pdf. Ссылка активна на 21.10.2016.
26. Majmundar A. J, Lee D. S, Skuli N., Mesquita R. C., Kim M. N., Yodh A. G., Nguyen-McCarty M., Li B., Simon M. C. HIF modulation of Wnt signaling regulates skeletal myogenesis in vivo. Development. 2015;142(14):2405-2412. doi: 10.1242/dev. 123026.
27. Yu Y., Zhou Y, Cheng T, Lu X, Yu K, Zhou Y, Hong J, Chen Y. Hypoxia enhances tenocyte differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells by inducing hypoxia-inducible factor-1a in a co-culture system. Cell Prolif. 2016;49(2):173-84. doi: 10.1111/cpr.12250.
28. Смолянинов А. Б., Юркевич Ю. В., Хрупина А. С. и др. Использование полимера гидроксиэтилцеллюло-зы в качестве носителя для аллогенных фибробластов при лечении последствий термических ожогов. Вестник Северо-Западного Государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. 2013;5(4):7-12.
29. Москвин С. В., Антипов Е. В., Зарубина Е. Г., Рязанова Е. А. Низкоинтенсивное лазерное излучение и лазерофорез гиалуроновой кислоты как методы коррекции возрастных изменений кожи: дальнейшее расширение доказательной базы. Влияние на микроциркуляцию. Косметика и медицина. 2011;1: 48-52.
30. Jang C. H., Park H., Cho Y. B., Song C. H. Mastoid obliteration using a hyaluronic acid gel to deliver a mesenchymal stem cells-loaded demineralized bone matrix: an experimental study. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2008;72(11):1627-32. doi: 10.1016/j.ijporl.2008.07.017
REFERENCES
1. Osmanova A. A. Dinamika mikrocirkuljatornogo rusla pri kompressionnoj travme mjagkih tkanej konechnostej i korrekcii infuziej perftorana (jeksperimental'noe issledovanie) [dissertation]. Mahachkala; 2010. Available to http://qoo.by/Doy. Accessed October 21, 2016. (In Russian).
2. Flann K. L., Rathbone C. R., Cole L. C., Liu X., Allen R. E., Rhoads R. P. Hypoxia simultaneously alters satellite cell-mediated angiogenesis and hepatocyte growth factor expression. J. Cell Physiol. 2014;229(5):572-9. doi: 10.1002/ jcp.24479.
3. Sheveleva O. N., Ramazanova S. G. Vlijanie mezenhimnyh stromal'nyh kletok na vosstanovlenie myshechnoj tkani posle povrezhdenija. II Nacional'nyj Kongress po regenerativnoj medicine; December 3-5, 2015; Moscow. Available to http://www.mediexpo.ru/fileadmin/ user_upload/content/pdf/thesis/thesis_nkrm2015.pdf. Accessed 21.10.2016. (In Russian).
4. Winkler T., von Roth P., Matziolis G,, Mehta M., Perka C., Duda G. Dose-response relationship of mesenchymal stem cell transplantation and functional regeneration after severe skeletal muscle injury in rats. Tissue Eng. 2009;15(3):487-92. doi:10.1089/ten.tea.2007.0426.
5. Quintero A. J., Wright V. J., Fu F. H., Huard J. Stem cells for the treatment of skeletal muscle injury. Clin. Sports Med. 2009;28(1):1-11. doi: 10.1155/2012/282348.
6. Buravkova L., Andreeva E., Gogvadze V. et al. Mesenchymal stem cells and hypoxia: where are we? Mitochondrion. 2014;19:105-112.
7. Andreeva E. R., Buravkova L. B. Parakrinnaja aktivnost' mul'tipotentnyh mezenhimal'nyh stromal'nyh kletok i ee osobennosti v uslovijah gipoksii. Fiziologija cheloveka. 2013;39(3):104-113. doi: 10.7868/S0131164613030041. (In Russian).
8. Parfenova E. V., Tkachuk V. A. Therapeutic angiogenesis: advances, problems, prospects. 2007;2(2):5-15. (In Russian).
9. Merritt E. K., Cannon M. V., Hammers D. W., Le L. N., Gokhale R. Repair of Traumatic Skeletal Muscle Injury with Bone-Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Seeded on Extracellular Matrix. Tissue engineering. 2010;16(9):2871-81. doi: 10.1089/ten.
10. Shi, M. Acceleration of skeletal muscle regeneration in a rat skeletal muscle injury model by local injection of human peripheral blood-derived CD133-positive cells. Stem. Cells. 2009;27;949-960. doi: 10.1002/stem.4.
11. Ardasheva E. I. Primenenie perftorana s cel'ju profilaktiki oslozhnenij i lechenija kompressionnoj travmy mjagkih tkanej konechnostej (jeksperimental'no -klinicheskoe issledovanie): [dissertation]. Kemerovo; 2002. Available to https://clck.ru/AD2QR. Accessed October 21, 2016. (In Russian).
12. Zuk, P. A. Multilineage cells from human adipose tissue for cell-bassed therapies. Tissue engineering. 2001;7(2):211-228. doi: 10.1089/107632701300062859.
13. Nechaev Je. A., Revskoj A. K., Savickij G. G. Sindrom dlitel'nogo sdavlenija: Rukovodstvo dlja vrachej. M.: Medicina; 1993. (In Russian).
14. Kozlov V. I., Azizov G. A., Gurova O. A. Lazernaja dopplerovskaja floumetrija v ocenke sostojanija i rasstrojstv mikrocirkuljacii krovi. Metodicheskoe posobie dlja vrachej. -M.; 2012. (In Russian).
15. Nikolaev, S. G. Praktikum po klinicheskoj jelektromiografii. Ivanovo; 2003. (In Russian).
16. Opticheskaja biomedicinskaja diagnostika. V 2 t. M.: Fizmatlit; 2007. (In Russian).
17. Chemidronov S. N. Regeneratornye processy v moduljah mikrocirkuljatornogo krovenosnogo rusla skeletnyh myshc posle travmy i svobodnoj plastiki izmel'chennoj myshechnoj tkan'ju v jeksperimente (jeksperimental'no-morfologicheskoe issledovanie) [dissertation]. Samara; 2008. Available to https://clck.ru/AD2U7. Accessed October 21, 2016. (In Russian).
18. Kawiak J, Brzöska E, Grabowska I, Hoser G. Contribution of stem cells to skeletal muscle regeneration. Folia Histochem Cytobiol. 2006;44(2):75-9.
19. Domarackaja E. I., Sheveleva O. N., Ramazanova S. G. Uchastie mezenhimnyh stromal'nyh kletok v regeneracii myshechnoj tkani // II Nacional'nyj Kongress po regenerativnoj medicine; December 3-5, 2015; Moscow. Available to http://www.mediexpo.ru/fileadmin/user_ upload/content/pdf/thesis/thesis_nkrm2015.pdf. Accessed 21.10.2016. (In Russian).
20. Wei X., Yang X., Han Z. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Pharmacologica Sinica. 2013;34(6):747-754. doi: 10.1038/aps.2013.50.
21. Nakagami H., Maeda K., Morishita R. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 2005; 25(12):2242-2547. doi: 10.1161/01. ATV.0000190701.92007.6d.
22. Vanden H. T., Becker L. B., Shao Z. H. Preconditioning in cardiomyocytes protects by attenuating oxidant stress at reperfusion. Circ. Res. 2000;86(5): 541-8. doi: 10.1161/01.RES.86.5.541.
23. Mathew S. A., Rajendran S., Gupta P. K. Modulation of physical environment makes placental mesenchymal stromal cells suitable for therapy. Cell Biol. Int. 2013;37(11): 1197-1204. doi: 10.1002/cbin.10154.
24. Rylova J. V., Buravkova L. B. Steadiness of multipotent mesenchymal stromal cells from adipose tissue to anoxia in vitro. Citologija. 2014;56(12):881-9. (In Russian).
25. Lobanova M. V. Osobennosti realizacii okislitel'nogo stressa v mul'tipotentnyh mezenhimal'nyh stromal'nyh kletkah pri razlichnom soderzhanii kisloroda: [dissertation]. Moscow; 2015. Available to http://www.imbp.ru/webpages/ WIN1251/Science/DisserSov/Lobanova2015/Lobanova-dis. pdf. Accessed October 21, 2016. (In Russian).
26. Majmundar A. J, Lee D. S, Skuli N., Mesquita R. C., Kim M. N., Yodh A. G., Nguyen-McCarty M., Li B., Simon M. C. HIF modulation of Wnt signaling regulates skeletal myogenesis in vivo. Development. 2015;142(14):2405-2412. doi: 10.1242/dev. 123026.
27. Yu Y., Zhou Y, Cheng T, Lu X, Yu K, Zhou Y, Hong J, Chen Y. Hypoxia enhances tenocyte differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells by inducing hypoxia-inducible factor-1a in a co-culture system. Cell Prolif. 2016;49(2):173-84. doi: 10.1111/cpr.12250.
28. Smolyaninov A. B., Khrupina A. S., Yurkevich Yu. V., Pirozhkov I. A., Supilnikova O. V., Krylov K. M., Krylov P. K., Kozulin I. D. Use of hydroxyethylcellulose polymer as a carrier for allogeneic fibroblasts in thermal burns treatment. Vestnik Severo-Zapadnogo Gosudarstvennogo medicinskogo universiteta im. I.I. Mechnikova. 2013;5(4):7-12.
29. Moskvin S. V., Antipov E. V., Zarubina E. G., Rjazanova E. A. Nizkointensivnoe lazernoe izluchenie i lazeroforez gialuronovoj kisloty kak metody korrekcii vozrastnyh izmenenij kozhi: dal'nejshee rasshirenie dokazatel'noj bazy. Vlijanie na mikrocirkuljaciju. Kosmetika i medicina. 2011;1: 48-52.
30. Jang C. H., Park H., Cho Y. B., Song C. H. Mastoid obliteration using a hyaluronic acid gel to deliver a mesenchymal stem cells-loaded demineralized bone matrix: an experimental study. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2008;72(11):1627-32. doi: 10.1016/j.ijporl.2008.07.017
