CC BY
20
Summary
VARIANTS OF INTERACTION BETWEEN AGGRESSIVE AND DEFENSIVE FACTORS IN PATIENTS WITH ACID-RELATED DISEASES Mosiychuk L.N.
In the article there were revealed the function of a stomach in patients with the duodenal ulcer (DU) and gastroesophageal reflux diseases (GERD) as well as in case of their combination. There were determined the most characteral variants of interaction between aggressive and defensive factors of gastric mucosa. In most of patients with DU there was the decrease of defensive factors and the increase of aggressive factors. In patients with GERD more characteristic was compensatory increase of content of the gastromucoprotein and the fucosa in case of action of aggressive factors. The received data are necessary for taking into consideration for therapeutic strategy of acid-related diseases.
Institute GastroEnterology of Ukrainian AMS, Dnepropetrovsk.
Матеріал надійшов до редакції 26,01,06,
© Чорнобай A.B., Кайдашев І.П.
УДК 616-006:615.277.3:616-097 - 618.146-006.6-085
СТАН АП0ПТ03У ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРІЙНОЇ КРОВІ ХВОРИХ НА ЗЛОЯКІСНІ НОВОУТВОРЕННЯ ПРЯМОЇ КИШКИ, ШИЙКИ МАТКИ ТА ЯЄЧНИКІВ В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД ОБСЯГУ ОТРИМАНОГО ЛІКУВАННЯ
Чорнобай A.B., Кайдашев І.П.
Українська медична стоматологічна академія., м. Полтава
Изучено состояние апоптоза лимфоцитов крови больных РПК, РШМ и РЯ по методике аннексии V - пропидиум йодид с помощью проточной лазерной цитофлуорометрии, а также зависимость уровня апоптических процессов от примененного лечения. Установлено, что у пациентов со злокачественными новообразованиями, локализаций которые изучались изначально высокий уровень апоптоза лимфоцитов, который в 6 или 12 раз превышает такой у здоровых людей. При использовании химиотерапевтических методов лечения достоверно определяется уменьшение уровня апоптоза лимфоцитов во всех фазах, что особенно проявляется при использовании ЭПХТ.
Ключевые слова: апоптоз лимфоцитов, рак прямой Вступ
Апоптоз (програмована клітинна смерть) забезпечує елімінацію з організму застарілих та змінених клітин і спостерігається в ембріогенезі, для підтримки нормального гомеостазу в організмі, при регенерації, запаленні й злоякісному рості. Апоптоз лімфоцитів, викликаний дисфункцією мітохондрій, є одним з факторів вікового зниження ативності імунітету або імуно-старіння [2,3]. На важливу роль при процесі апоптоза внутрішньотканинних і міжтканинних взаємодій вказує й той факт, що апоптичні тільця які утворюються при апоптозі піддаються фагоцитозу не тільки й не обов'язково спеціалізованими макрофагами, але й сусідніми з ними клітинами епітеліального або сполучнотканинного походження [2,3]. Причиною розвитку апоптоза може бути прямий вплив на геном клітини (віруси) або непрямий вплив через нейромедіатори, медіатори запалення, ішемію й т.д. Така поліетіологічність апоп-тозу зв'язує його з багатьма патологічними станами, такими як травма, ішемія, інфекції. У неушкодженій клітині процес апоптоза перебуває під постійним генетичним контролем. Це пов'язане з тим, що програмована клітинна загибель є необхідним процесом клітинної заміни в ембріогенезі, а в дорослої особини
- механізмом природної елімінації клітин. На генетичному рівні зміни, що супроводжують апоптоз, прояв-
кишки, рак шеики матки, рак яичников.
ляються експресією особливих генів і трансляцією відповідних білків. Відомо, принаймні, кілька генів, відповідальних за розвиток апоптоза. Серед них є як індуїсгори - Рає/Аро-І (С095), р53, так і інгібітори апоптоза - ЬсІ-2, ЬсІ-х, Ьах [3,4,5,6 ]. Активація виконавців апоптоза являє собою результат розгалуженого ланцюга біохімічних реакцій, зміст яких в остаточному підсумку полягає у фрагментації ДНК і клітинній смерті. Кількість розривів у ДНК, необхідна для ініціації нез во ротної клітинної смерті є невеликою. Вважається, що 40 двохланцюгових розривів ДНК на клітину, тобто приблизно один розрив на хромосому, є летальним [2,3].
Особливе місце в дослідженнях взаємодії пухли-на-організм займає здатність пухлин не тільки виходити із-під імунологічного контролю організму, але й активно пригнічувати захисну імунну реакцію, тим самим забезпечуючи собі імунологічну привілейованість. Імунологічна привілейованість пухлин утворюється, зокрема, завдяки здатності пухлинних клітин викликати апоптичну загибель лімфоцитів [4,5,6]. Розробка терапевтичного впливу на апоптоз у даний момент перебуває на початковому етапі, але уже зараз з'являються можливості впливу на різні етапи механізму розвитку апоптоза.
Мета роботи - вивчити рівень апоптозу лімфоцитів крові хворих на злоякісні новоутворення прямої киш-
ки, шийки матки та яєчників в залежності від обсягу отриманого лікування.
Матеріали і методи
В дослідження було включено 81 пацієнта, які отримували лікування в Полтавському обласному клінічному онкодиспансері з приводу раку прямої кишки (РПК) - 27 хворих (12 жінок та 15 чоловіків) віком від 47 до 65 р., раку шийки матки (РШМ) - 25 (віком від 29 до 64 р.), та раку яєчників (РЯ) - 29 хворих (віком від 48 до 61 р.). Всі досліджувані хворі мали поширені стадії новоутворень (Т2-4) і отримали комбіноване та комплексне лікування.Стадії поширення процесу (за критерієм Т) представлені в таблиці 1.
Таблиця 1
Стадії поширення пухлинного процеси
Локалізація Стадії поширення хвороби (за критерієм Т)
Т2 ТЗ Т4
Рак прямої кишки 3 15 9
Рак шийки матки 15 12 -
Рак яєчників 7 22 -
Хворі на РПК, як перший етап лікування, отримали неоад’ювантне лікування внутрішньовенну поліхіміо-терапію (в/в ПХТ) - 7 пацієнтів та ендолімфатичну (ЕПХТ) - 7 пацієнтів, а також променеву терапію (ПТ), яка виконувалась у режимах дрібнофракційного опромінювання (2 Гр) - 6 хворих (СОД 20 - 25 Гр) та великими фракціями (5-7 Гр) - 7 хворих (СОД 38 -42 Гр). Через 3 - 21 день після закінчення лікування, в залежності відлікувальної програми, всім пацієнтам виконані хірургічні втручання. Хворі на РШМ були ро-поділені на дві групи. Одна група хворих (14 пацієнток) на першому етапі лікування отримали курси в/в ПХТ (7) та ЕПХТ (7). Інша група (11 пацієнток) отримували тільки поєднану променеву терапію: внутрішньо-порожнинно (СОД 50 Гр) та дистанційно (СОД 40 - 45 Гр). В свою чергу хворі на рак яєчника теж були розділені на дві групи: 14 хворих, які отримали ЕПХТ та 15 хворих, що отримали в/в ПХТ. Незалежно від методики уведення цитостатиків (внутрішньовенно чи ендолімфатично) всім хворим використана ідентична схема поліхіміотерапії - МРР (метотрексат, цисплатін, 5-фторурацил) у стандартних дозах [9]. Розподіл досліджуваних пацієнтів в залежності від методики лікування репрезентований у таблиці 2.
Таблиця 2.
Розподіл хворих в залежності
Для дослідження процесів апоптозу у пацієнтів і донорів проводили забір крові в об’ємі 3 мл з обов’язковим додаванням 0,01 мл гепарину, після встановлення діагнозу (верифікації процесу) до початку та після лікувальних заходів, що проводились у
випадку поліхіміо- та променевої терапії доїї початку та після закінчення. А при застосуванні поєднаної променевої терапії - після закінчення внутрішньопо-рожнинного курсу опромінення. Дослідження проводились за наявності дозволу Комісії з етичних питань УМСАта інформованої згоди пацієнтів.
Для порівняння рівня апоптозу лімфоцитів хворих визначали рівень апоптозу лімфоцитів крові здорових донорів. Група донорів складалась з 11 осіб обох статей (6 жінок та 5 чоловіків) віком 23 - 54 роки. На момент забору крові досліджувані були обов’язково натщесерце.
Для визначення процесів апоптозу лімфоцитів використовували методики, які основані на проточній лазерній цитометрії (ПЛЦ). Переваги використаного нами методу пов’язані з можливістю дослідження метаболізму окремо взятої клітини, а також з відносною простотою, швидкістю та точністю методу методу ПЛЦ [7,8]. Розвиток апоптозу визначали за допомогою аннексину V (AnV) який зв’язується з фосфатидилсе-рином, що з’являється на поверхні клітин залучених в апаптоз, а також за допомогою флюорисцентного барвника пропідіуму йодиду (РІ) [10,11]. Для дослідження експресії AnV зв’язаного з фосфатидилсерином, що з’являється на поверхні клітин залучених в апоп-тоз, суспензію лімфоцитів периферичної крові попередньо відмивали 0,5 мл Hepes буфера (ЮтМ Hepes/ NaOH, pH 7,4, 150тМ NaCI, 5тМ KCl, 1,8тМ CaCI, 1тМ MgCh) шляхом центрифугування при 1,5 тис об/хвилину протягом 5 хвилин. До ресуспендованих клітин (10) додавали 5мкл AnV-FITC („Caltag”, США) та і н кубу вал и протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Для аналізу на цитофлюориметрі до проби додавали 0,5 мл HEPES буфера. Для визначення процесів апоптозу використовували РІ, до суспензії лімфоцитів за 10 хвилин до кінця інкубації з AnV додавали 10 мкл РІ. Рівень апоптозу лейкоцитів (лімфоцитів) визначали, аналізуючи проби на проточному цитофлюориметрі ЕРІХ LX-MCL (Beckman Coulter, США) використовуючи програму System II™ Software. Для збудження флуорисценції використовували аргоновий лазер з довжиною хвилі 488 нм. Додатково до флюорисцентних параметрів проводили реєстрацію прямого та бокового світорозсіювання клітин, що дозволяло виключати з аналізу конгломерати клітин та їх уламки. Підрахунок клітин проводили протягом 300 сек, при цьому кількість проаналізованих клітин в пробі складала від 15 до 20 тис. В залежності від фаз процесу апоптозу лімфоцитів, AnV, що зв’язувався з клітиною вказував на початок апоптозу, а наявність зв’язаного AnV+PI - визначала розвинутий апоптичний процес. Кількість клітин, що вступили у ту чи іншу фазу апоптоза визначали у відсотках. Результати оброблені статистично (STATISTICA).
Результати та обговорення
Результати отримані при вивчені апоптозу у пацієнтів з новоутвореннями прямої кишки, шийки матки та яєчників, в залежності від методів терапевтичного впливу на пухлинний осередок, представленні в таблицях 3- 5.
Аналізуючи рівень апоптозу лімфоцитів хворих на РПК (табл. 1) до лікувальних заходів та після і порівнюючи його з показниками виявленими у донорів визначається підвищення початкового рівня апоптозу
від застосованих методик лікування.
Отримане лікування Локалізація
РПК РШМ РЯ
ЕПХТ + хірург 7
В/В ПХТ+хірург 7
В/В ПХТ 7 15
ЕПХТ 7 14
Опромінення інтенсивне (5-6 ГР) +хірург 7
Опромінення дрібнофракційне (2 Гр) +хірург 6
Поєднана променева терапія (внутрішньопорожнинна та дистанційна) 11
(Ап\/+) у 6,7 раза, а рівень кінцевої фази апоптозу (Ап У+РҐ) - у 9 раз. При дослідженні рівня апоптозу лімфоцитів в залежності від лікувальних заходів виявлено зменшення відсотку апоптозу лімфоцитів у всіх пацієнтів, що досліджувались. Найбільше зниження відсотку клітин, що мали апоптичні ознаки візначено при використанні ЕПХТ та в/в ПХТ як початкової фази (20,75±4,35 проти 9,22±2,12, р<0,05), так і кінечної фази (0,53±0,15 проти 0,02± 0,01, р<0,05 ). Значно менше рівень апоптозу знижався підчас променевої терапії: початковий (Ап\/+) - (20,75±4,35 проти
16,67±2,15, р>0,05), статистична різниця не доведена. Кінцевий (Ап У+РҐ) рівень апоптозу (при застосуванні великофракційного опромінення) зменшувався не так відчутно - (0,53±0,15 проти 0,33±0,15, р>0,05). а при застосуванні дрібнофракційного режиму опромінення рівень апоптозу навіть збільшувався (0,53±0,15 проти 1,29± 0,25, р<0,05) .
Таблиця З
Рівень апоптозу лімфоцитів хворих на рак прямої
Примітка. Тут та в табл. 4 та 5 - р<0,05 - порівняння показників апоптозу до та після лікування.
(* р<0,05)
Вивчаючи рівень апоптозу лімфоцитів у хворих на РЯ (табл. 4) теж можна відзначити високий рівень цього показника до лікування в порівнянні з донорами (вищий у 7,8 -14,3 рази).
Таблиця 4
Рівень експресії апоптозу лімфоцитів хворих на рак яєчників залежності від методів лікування (М
.______________________.______________________________±<г)
Період Визначення Рівень апоптозу лімфоцитів (%)
Експресія апоптозу
An V(п=7) An V+PI (п=7)
До лікування 25,20±3,55 1,23±0,25
Після лікування: ЕПХТ 4,81 ± 1,12 * 0,23±0,07 *
ПХТ в/в 5,78± 1,02 * 0,78±0,15 *
Донори 3,04±0,08 0,09±0,03
При застосуванні таких лікувальних заходів, як ЕПХТ та в/в ПХТ, відзначається значне зменшення (у
4.7 рази) рівня початкового (Ап\/+) апоптозу лімфоцитів та у 5,6 рази кінцевого (Ап \/+РҐ). Зменшення останнього при застосуванні ЕПХТ (0,23±0,07), в порівнянні з цим же показником при в/в ПХТ (0,78±0,15) більш відчутне, статистична різниця (р<0,05 ) доведена.
Розглядаючи стан апоптозу лімфоцитів у хворих на РШМ (табл. 5) так як і при інших локалізаціях злоякісних новоутворень, що вивчались відзначався високий рівень і початкового (Ап\/+) і кінцевого (Ап \/+РҐ) апоптозу (вищий від донорського відповідно у
6.8 та 12 разів). Зміни апоптотичних процесів викли-
кані лікувальним впливом були наступні: відмічалось чітке, статистично доведене зменшення апоптозу лімфоцитів при застосуванні ЕПХТ та в/в ПХТ: до лікування початковий рівень (Ап\/) 20,67±3,56, після лікування 7,65±0,85, р<0,05, а також (Ап\/+РҐ) - до 1,82±0,14, після - 0,09±0,03, р<0,05). При використанні поєднаної променевої терапії навпаки рівень апоптозу лімфоцитів значно підвищувався (Ап\/ до 33,32±4,14, а АпУ+РҐ до 2,47±0,58, р<0,05).
Таблиця 5
Рівень апоптозу лімфоцитів хворих на рак шийки
За даними [1], просл ід жується залежність частоти апоптозу від режиму фракціювання, де показано, що відсоток клітин, що вступили у апоптоз вище при дрібному фракціюванні (1-2 Гр), ніж при середніх та високих дозах (5-12 Гр). Цей факт підтверджується і нашими дослідженнями: у хворих на РПК, які отримували дрібнофракційне опромінювання рівень апоптозу лімфоцитів складав - (16,67±2,15)%, а при опроміненні великими фракціями - (12,03±2,25)%. Збільшення експресії апоптозу після променевої терапії можна пояснити так званою реакцією найближчих ефеїсгів опромінення [1], якою є тимчасова затримка клітинного поділу (радіаційна затримка мітозів). Радіаційна затримка мітозів стосується тільки першого поділу клітин після опромінення і відрізняється від повного пригнічення мітозу, внаслідок впливу великих доз опромінення, коли клітина повністю втрачає здатність до поділу, відновленням поділу через 48 - 72 години. Найвищий рівень апоптозу лімфоцитів (33,32±4,14)% у хворих на рак шийки матки можна пояснити тим ще й тим фактом, що визначення екср-песії апоптозу виконувалось в момент, коли хворі отримували внутрішньопорожнинне контактне опромінення великими фракціями (5 Гр) одночасно з дріб-нофракційною (2 Гр) великопольною дистанційною гама-терапією.
Висновки
1.У хворих на РПК, РШМ, РЯ відмічається високий рівень (як початкова експресія (AnV+) так і кінцева (AnV - РҐ)) апоптозу лімфоцитів, який перевищує показники здорових людей у 6 - 12 разів.
2.При застосуванні хіміотерапевтичного впливу на пухлинний осередок (незалежно від локалізації пухлини) відбувається зменшення рівня апоптозу лімфоцитів, особливо при застосуванні методики ЕПХТ.
3.Ендолімфатичне уведення цитостатиків при вираженій протипухлинній дії значно менше, ніж інші терапевтичні заходи (внутрішньовенна хіміотерапія та опромінення) викликає пошкодження здорових тканин організму, зокрема циркулюючих лімфоцитів.
Література
1. Акимов A.A., Иванов С.Д., Хансон К.П. Апоптоз и лучевая терапия злокачественных новообразований. Во-проссы онкологии. - 2003. - №3. - С.261 - 267.
кишки в залежністі від методів лікування (М ±a)
Період Визначення Рівень апоптозу лімфоцитів (%)
Експресія апоптозу
An V+ (п=7) Ап V+РҐ (п=7)
До лікування 20,75±4,35 0,53±0,15
Після лікування: Нео-ад’ювантна ЕПХТ 9,22±2,12 * 0,02±0,01 *
Неоад’ювантна ПХТ в/в 9,85±3,65 * 0,06±0,02 *
Променева терапія, великими фракціями (5-7 Гр) 12,03±2,25 * 0,33±0,15
Променева терапія, дрібнофракційний курс (2 Гр) 16,67±2,15 1,29±0,35 *
Донори 3,04±0,08 0,09±0,03
матки в залежністі від методів лікування (М ± а)
Період Визначення Рівень апоптозу лімфоцитів (%)
Експресія апоптозу
An V(п=7) An V+PI (п=7)
До лікування 20,67±3,56 1,29±0,17
Після лікування: ЕПХТ 7,65±0,85 * 0,06±0,02 *
ПХТ в/в 9,44± 1,49 * 0,07±0,01 *
Поєднана Променева терапія 33,32±4,14 * 2,47±0,58 *
Донори 3,04±0,08 0,09±0,03
2. Арулин Л.И. Апоптоз при патологических процессах в органах пищеварения // Клиническая медицина. - 2002.
- №2. - С.5-10. 8.
3. Белушкина.Н.Н., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза //Архив патологии. - Т.63, №1. -С.51-60.
4. Григорьева Т.Ю., Никонова М.Ф., Ярилин А.А. Различ- 9.
ная чувствительность к индукции апоптоза Т-лимфоцитов субкласов CD+4 и CD+8 // Иммунология. -2002.-№4.-С.200-205. Ю.
5. Никонова М.Ф.,Литвина М.М., Варфоломеева М.И.
Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию // Иммунология. -1999. - №2. - С.20-23. 11.
6. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Роль генов р53
и bel -2 в апоптозе и лекарственной резистентности опухолей // Вопроссы онкологии. - 2000. - Т.46, №2. - 12
С.121-128.
7. Проточная лазерная цитометрия в оценке иммунной системы человека / Б.В.Пинегин, А.А.Ярилин,
Summary
APOPTOSIS OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH MALIGNANCIES OF RECTI, UTERI CERVICS AND OVARII AND ITS DEPENDENCE ON THE TREATMENT Chornobay A., Kaidashev I.
Key words :WBC apoptosls, rectal cancer, cervical cancer, ovarian cancer
Apoptosis of peripheral blood lymphocytes was studied by flow cytometry with annexin V-propidium iodide test.
Patients with malignancies had the apoptosis increased wich was in 6-12 times higher than in healthy individuals. The
treatment of patients decreased the level of lymphocyte apoptosis, especially, by the using of the endolymphatic chemotherapy.
Ukrainian Ministry of the Health Public Service, Ukrainian Medical Stomatological Academia,
Shevchenko Str., 23, Poltava, 36024
Матеріал надійшов до редакції 21.12.05.
Д.В.Мазуров и др. //Журн. Микробиология. - 2002. -№6. - С.105-106.
Регуляція активності мембран та процесів апоптозу лімфоїдних клітин тканинними пептидами / Боброва Н.О., Весніна Л.Е., Кайдашев І.П., та ін; під редакцією Кайдашева І.П. - Полтава: Полімет, 2004. -214с. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. / Под ред. Переводчиковой Н.И. - М: Практич.
Мед.-2005.-693с.
Annexin V for flow cytometric detetcion of phosphatidylser-ine expression on В cells undergoing apoptosis / G.Koopman, G.Kuijten // Blood. - 1994/- Vol.84. - P.
1415.
A novel assy for apoptosis - flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptosis cells using fluorescein labelled Annexin V /
Vermes, C. Hannen // J. Immunol. Meth. - 1995. -Vol.184.-P. 39-51/
