Состав популяции штаммов возбудителя дифтерии, циркулирующих в России Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016

И.А. Чагина', О.Ю.Борисова1-2, Л.И.Кафарская2, С.САфанасьев1, В.А.Алешкин1, Ю.В.Несвижский, М.С.Афанасьев3, А.ВМешкин1, Е.В.Юсуф4, Т.И.Москвина5, Л.И.Пономарева6, АВ.Караулов3

состав популяции штаммов возбудителя дифтерии, цирку-

лирующих в России .

'Московский НИИ эйи^к&юиюЛ^Ви ^п^иа^с^^СиКО'ГЙи им! Г.Н.Габрйчевского, 2Рссийский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, 3Первый московский государственный медицинсиш университет им. И.М.Сеченова, Москва; 4 Центр гигиены и эпидемиологии в Ханты-Мансийском автономном округе Югре, Ханты-Мансийск; 5Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области, Челябинск; 6Центр гигиены и эпидемиологии й республике Удмуртия, Ижевск

Цель. Характеристика клонального состава популяции штаммов Corynebacterium diphtheriae в России с помощью MLST, а также оценка возможности использования этого метода при проведении мониторинга штаммов возбудителя дифтерийной инфекции. Материалы и методы. Изучены штаммы C.diphtheriae, выделенные в России в 1957 — 2015 гг. и присланные в референс-центр по дифтерии и коклюшу МНИИЭМ им. Г.Н.Габрического. Генотипирование С. diphtheriae с помощью MLST проводили на основе секвенирования фрагментов генов «домашнего хозяйства». Идентификацию ST осуществляли согласно PubMLST. Результаты. На территории России идентифицированы штаммы С. diphtheriae 36 сиквенс-типов (ST)—27 ранее известных и 9 новых, выявленных нами впервые. Доминирующими были 2 сиквенс-типа ST25 и ST8 (22% и 18%). Показана взаимосвязь между фенотипическими свойствами (токсигенность и биовар) и принадлежностью штаммов C.diphtheriae к определенному сиквенс-типу — токсигенные и не-токсигенные штаммы C.diphtheriae различных биоваров характеризовались определенными сиквенс-типами. Показаны изменения клонального состава популяции C.diphtheriae в динамике эпидемического процесса дифтерийной инфекции. Заключение. Использование MJICT позволило охарактеризовать клональный состав популяции штаммов C.diphtheriae в России и показало перспективность применения этого метода для характеристики популяции возбудителя дифтерии, выявления эпидемически значимых штаммов и расшифровки очагов дифтерийной инфекции.

Журн. микробиол., 2016, №5, С. 50—60 ;

Ключевые слова: Coiynebacteriuni diphtheriae,1 уультилокусное секвенирование ДНК

IA.Chagina1, O.Yu.Borisova12, Li;kafarskaya2, S.S.Afanasiev*, V.A.Aleshkin1,Yu.V.Nesvizhsky;M:S^anasiev3,A.V.Aleshkin1, E.V.Yusuf, T.I.Moskvina5, L.I.Ptinomareva6, A.V.Karaulov3

composition of population of diphtheria causative agent strains in russia

'Gabrichevsky Moscow Research institute of Epidemiology and Microbiology, 2Pirogov Russian National Research Medical University, 3Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow; 4Centre for Hygiene and Epidemiology in Khanty-Mansi Autonomous District Yugra, Khanty-Mansiysk; 5Centre for Hygiene and Epidemiology in Chelyabinsk Region, Chelyabinsk; 6Centre for Hygiene and Epidemiology in the Udmurt Republic, Izhevsk, Russia

Aim. Characteristics of clonal composition of Corynebacterium diphtheriae strain population in Russia using MLST, as well as evaluation of a possibility of using of this method during execution of monitoring of diphtheria infection causative agent strains. Materials and methods. C. diphtheriae strains, isolated in Russia in 1957 — 2015 and sent to Gabrichevsky MRIEM reference centre for diphtheria and pertussis, were studied. Genotyping of C. diphtheriae using MLST was carried out based on sequencing of «housekeeping» gene fragments. ST identification was carried

out according to PubMLST. Results. C. diphtheriae strains of 36 sequence-types (ST) were identified on the territory of Russia — 27 previously known and 9 novel, detected for the first time. 2 sequence types ST25 and ST8 (22% and 18%) dominated. Inter-relation between phenotype properties (toxigenicity and biovar) and membership of C. diphtheriae strains in certain sequence-types was shown — toxigenic and non-toxigenic C. diphtheriae strains of various biovars were characterized by certain sequence-types. Changes ofclonal composition of C.diphtheriae population in dynamics of epidemic process of diphtheriainfection were^hown. Coficlusion. Use of MLST allowed to characterized clonal composition of C. diphtheriae strains' population in Russia and has shown perspectives of use of this n?ethq4 to characterize population of diphtheria causative agent,' deiteqt epide^j^y'si^iiQcant ^ifwns fiad^ectffh^r Ipcjj ¿¿¡diphtheria Miction.

Zh.Mikrobioh (Moscow), 2016, No. 5,.¡P..50—бЬ : ; : .,.','.,

Key words: С^гупеЬасШит diphtheriae, m^ . "

ВВЕДЕНИЕ

Идентификация, классификация и типирование возбудителей инфекционных заболеваний относятся к числу глобальных задач не только прикладной, но и фундаментальной микробиологии и эпидемиологии [13]. Типирование штаммов возбудителей инфекционных заболеваний ставит перед собой несколько задач: выяснить, являются ли выделенные в одном очаге штаммы близкородственными или они не взаимосвязаны между собой; циркулируют ли штаммы на других близлежащих территориях, на других отдаленных территориях и в других странах; появились штаммы недавно или выделялись они в разные временные периоды. Решение таких задач с помощью типирования позволяет изучить и выявить закономерности циркуляции, формирования и эволюционного развития популяций возбудителей инфекционных заболеваний, создание клонов возбудителей и появление эпидемически значимых штаммов.

Изучению штаммов возбудителя дифтерийной инфекции — Coiynebacterium diphtheriae — посвящено значительное число работ ученых разных стран мира. Биологические свойства оценивались с помопц>ю классических микробиологических (серотипирование, биотипирование, фаготипирование, антибиотико-чувствительность), а также молекулярно-генетических методов, таких как гибридизация ДНК, рестрикЦйонный анализ! ПЦР с универсальными праймерами (УП-ПЦР, RAPD), AFLP, пульс-гель электрофорез (PFGE) (ПЦР-ПДРФ (RFLP), риботипирование, мультилокусный энзимэлектрофорез (МЭЭ), сполиготипирование, а также секвенирование отдельных генов [1 — 17].

В настоящее время, благодаря появлению высокотехнологичных молекулярно-гейетических технологий и высокопроизводительного секвени-рования стало возможным с новых позиций подойти к изучению биологических свойств и внутривидового разнообразия возбудителей инфекционных заболеваний. Одним из таких методов является мультилокусное секвенирование ДНК (Multilocus sequence typing, MLST, МЛСТ), предложенное Maiden М.С. (1998). МЛСТ в последнее десятилетие стало одним из наиболее распространенных методов генотипирования возбудителей инфекционных заболеваний, которое дает возможность охарактеризовывать штаммы микроорганизмов с использованием ДНК-секвенирования внутренних фрагментов генов. К настоящему времени МЛСТ широко используется для мониторинга Neisseria meningitidis, Vibrio vulnificus, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus haemolyticus, Bordetella pertussis и др. Схема проведения МЛСТ для C.diphtheriae была разработана

Bolt F. et al. [5] и включала штаммы 79 сиквенс-типов, объединенных в 11 клональных комлексов. К настоящему времени в международной базе данных PubMLST (http://pubmlst.org/) представлено более 300 сиквенс-типов, выделенных в различных странах мира при оценке состава циркулирующих популяций возбудителя дифтерийной инфекции.

В связи с этим, целью исследования является характеристика клонального состава популяции штаммов C.diphtheriae, выделенных в России, с помощью MJ1CT, а также оценка возможности использования этого метода при проведении мониторинга штаммов возбудителя дифтерийной инфекции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе изучено 148 штаммов C.diphtheriae, выделенных на территории России с 1957 по 2015 гг. и присланных в референс-центр по дифтерии и коклюшу МНИИЭМ им. Г.Н.Габрического, и два контрольных штамма C.diphtheriae № 665 и C.diphtheriae PW8. Токсигенных штаммов C.diphtheriae было 121, нетоксигенных штаммов — 20 и нетоксигенных токс-несущих штаммов (НТТН-штаммы) — 7. Изученные штаммы C.diphtheriae принадлежали к био-варам gravis и mitis. Выделение штаммов C.diphtheriae проводили согласно Методическим указаниям «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» МУ 4.2.698-98 и МУК 4.2.3065-13. Исследуемый материал засевали на кровяно-теллуритовую среду (КТА) на основе 2% СПА («Микроген», Махачкала) с 10% ККРС (НПО «Лейтран», Москва) и 0,02 % теллурита калия (ГНЦ ПМБ, Оболенск) и термостатировали 24 — 48 часов при 37°С. Выросшие колонии оценивали по культурально-морфологическим, токсигенным и биохимическим свойствам согласно МУ 4.2.698-98 и МУК 4.2.3065-13, а также с использованием тест-системы «ДС-ДИФ-КОРИНЕ» (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород).

Хромосомную ДНК выделяли стандартным методом кипячения согласно Маниатис Т., (1984) из 24-часовой культуры C.diphtheriae. Генотипирование штаммов С. diphtheriae с помощью МЛСТ проводили согласно международному протоколу [5] с последующей модификацией на основе секвенирования фрагментов 7 генов, являющихся генами «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) — atpA (ATP- synthase alpha chain), dnaE (DNA polymerase III alpha subunit), dnaK (chaperone protein), fusA (elongation factor G), leuA (2-iso-propylmalate synthase), odhA (2-oxoglutarate dehydrogenase El and E2 components) и rpoB (DNA-direct RNA polymerase beta chain), с последующей идентификацией аллельного профиля каждого штамма. Секвенирование фрагментов генов rpoB, atpA, dnaE, dnaK, fusA, leuA, odhA у штаммов C.diphtheriae проводили согласно общепринятому методу (Sanger F., 1977) в ФНКЦ ФХМ ФМБА России (Москва) и ЗАО «Евроген» (Москва). Идентификацию аллелей осуществляли согласно международной базе данных MLST — PubMLST (http://pubmlst. org/). Для кластерного анализа использовали программу построения дерева минимальных расстояний (minimum spanning tree) на основе аллельных профилей с помощью MEGA 6.06 (http://wvAv.megasoftware.net/megamac.php).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среди изученных штаммов С. diphtheriae при секвенировании выявлено от 4 до 12 аллелей этих генов. Все изученные штаммы С. diphtheriae были разделены на 36 сиквенс-типов (ST) (рис. 1) — 27 ранее известных и опубликованных в базе данных — ST5, ST8, ST12, ST17 ST18, ST19, ST24, ST25, ST28, ST29, ST30, ST32, ST40, ST41, ST43, ST44, ST45, ST46, ST47, ST48, ST53, ST60, ST62, ST66, ST67, ST76, ST202 и девять новых, выявленных нами впервые — ST-newl, ST-new2, ST-new3, ST-new4, ST-new5, ST-new6, ST-new7, ST-new8, ST-new9. Из них,

ST-new4

ST-new6

ST-new7

ST-new8

ST-new3 ST-new2

ST-newl

-ST-newlO

ST18

ST41

Рис. 1. Удельный вес штаммов C.diphtheriae различных сиквенс-типов, выделенных в России в 1957 — 2015 гг.

согласно PubMLST, каждый аллельный профиль соответствовал определенному сиквенс-типу: ST5 - 2-4-4-1-3-3-5 профиль, ST8 - 3-5-6-5-3-3-6, ST12 - 1-5-6-5-3-3-6, ST17 - 5-8-12-10-10-6-4, ST18 - 8-6-7-6-6-3-8, ST19 - 2-6-7-6-6-3-8, ST24 - 2-4-15-6-7-8-9, ST25 - 5-6-7-6-6-3-8, ST28 - 2-9-3-13-3-3-3, ST29 - 10-8-16-14-10-3-5, ST30 - 10-8-16-14-10-3-9, ST32 -3-1-18-4-13-3-5, ST40 - 8-3-19-2-7-3-3, ST41 - 2-9-22-13-3-3-3, ST43 - 15-1-18-4-13-3-5, ST44 - 14-2-23-4-2-14-2, ST45 - 2-1-2-1-3-1-2, ST46 - 16-4-8-1-7-16-9, ST47 - 2-11-9-19-17-17-9, ST48 - 4-4-25-6-3-5-9, ST53 - 2-1-2-1-3-3-2, ST60 - 2-5-3-1-3-3-9, ST62 - 4-1-18-4-3-16-2, ST66 - 3-5-6-5-11-3-6, ST67 - 3-2-3-6-3-3-2, ST76 - 2-9-1-1-13-3-2, ST202 - 2-4-58-1-3-3-5 профиль. Девять новых сиквенс-типов имели следующий аллельный профиль: ST-newl

- 18-10-27-19-4-3-16 профиль, ST-new2-4-1-4-4-3-16-2, ST-new3 - 19-12-4-1-3-3-2, ST-new4

- 19-5-16-5-3-3-6, ST-new5 - 3-8-6-1-10-3-2, ST-new6 - 2-1-20-4-4-3-6, ST-new7 - 16-4-5-1-3-30-9, ST-new8— 18-10-27-19-20-3-16, ST-new9- 19-8-16-1-10-3-2прфиль,нуклеотидные последовательности которых в настоящее время отправлены в международную базу данных.

Среди изученных штаммов C.diphtheriae доминирующими были два сиквенс-типа ST25 и ST8, к которым относились 22 и 18% изученных штаммов (рис. 1); 9% штаммов C.diphtheriae принадлежали к ST5, 7% — к ST76,6% — к ST24, 5% — к ST28, 4% — к ST40. С меньшей частотой встречаемости (по 3% штаммов C.diphtheriae) были зарегистрированы ST30, ST46, ST67; по 2% штаммов C.diphtheriae относились к ST-newl и ST-new3. Остальные сиквенс типы среди изученных штаммов C.diphtheriae встречались в единичном проценте случаев. Производственный вакцинный штамм C.diphtheriae PW8 характеризовался ST44, штаммов с таким сиквенс-типом среди изученных нами штаммов C.diphtheriae обнаружено не было. Контрольный токсигенный штамм C.diphtheriae биовара gravis № 665, выделенный еще в 1960-е годы, относился к ST25.

Далее нами были проанализированы данные о возможной связи способности штаммов C.diphtheriae к продукции дифтерийного токсина и принадлежности их к различным сиквенс-типам. Оказалось, что токсигенные штаммы C.diphtheriae принадлежали к 26 сиквенс-типам, а нетоксигенные штаммы

C.diphtheriae относились к 9 сиквенс-типам. Анализ принадлежности штаммов C.diphtheriae разных биоваров к сиквенс-типам показал, что для штаммов различных биоваров: характерны определенные сик- 1 венс-типы. Так, штаммы C.diphtheriae биовара gravis принадлежали к 15 сиквенс-типам, а штаммы биовара mitis — к 20 сиквенс-типам.

Для большинства токсиген-ных штаммов C.diphtheriae биовара gravis были характерны два сиквенс-типа — ST25 (к нему относилось 33 штамма) и ST8

— 27 штаммов; 3 токсигенных штамма C.diphtheriae биовара gravis относились к ST-newl, к остальным 11 сиквенс-типам принадлежали единичные штаммы (рис. 2). Среди токсигенных штаммов C.diphtheriae биовара mitis преобладали четыре сик-венс-типа: большинство штаммов (13 штаммов) относились к ST5, 9 штаммов — к ST24, 7 штаммов — к ST28, 4 штамма

- к ST46,3 - к ST-new3, 2 - к ST-new7, остальные сиквенс-типы встречались в единичных

зз

и

27

1 1

. 1,1 I "' I

1

1 1

3

ж

1 1

1

r-ZZL

О) .¿о Л- Л

V V V <о

V V <о

I "" I , I ' I # ^ £ &

4- Ф 4- Ф

№

Рис. 2. Частота встречаемости токсигенных штаммов C.diphtheriae биовара gravis различных сиквенс-типов.

s

§

Ж.

1

ж

1

ж

1

ж

1

ж.

<ьч о.

24 V <о

А."

сл ¿Л tZS

«о4 <Ь <Ь V- <Ь

% ff <Р -V Л"

V V

£

Рис. 3. Частота встречаемости токсигенных штаммов C.diphtheriae биовара mitis различных сиквенс-

ТИПОВ. г.'.'..',..",':' ,(„'./>

случаях (рис. 3). Нетоксигенные штаммы С^рЬШепае биовара шШб разделились следующим образом: большинство штаммов (8 штаммов) относились к 8Т76,4 штамма—к ¿ТЗО, 2 — к БТ40, все остальные сиквенс-типы встречались в единичных случаях. • • < • ч : . ; . г ¡> ^

Для оценки филогенетических взаимоотношений между изученными штаммами С^рЬШейае и уточнения времени их дивергенции использованы методы определения эволюционных дистанций, основанные на сравнении нуклеотидных последовательностей гомологичных генов. Анализ полученных данных и визуализация филогенетических отношений осуществлялись путем построения дендрограммы (рис. 4). Данный анализ позволяет нам оценить родство сиквенс-типов, а также увидеть, какие сиквенс-типы имеют более раннее в эволюционном плане происхождение.

Анализ показал, что популяция штаммов С^рМЪейае обладает высокой степенью гетерогенности. Все изученные штаммы разделились на два кластера. Первый кластер представлен двумя субкластерами, первый из которых включает две ветви. В одну ветвь вошли токсигенные штаммы С^рЬШейае сиквенс-типа БТ5, выделенные в период 1950 — 1969 гг., и близкие к ним ветви, включающие штаммы С^рЬШейае, выделенные в последующие годы, все принадлежащие к биовару тШв. Основу второй ветви составили токсигенные

831-ST-29

6'l J-ST-30

-ST-17

'ST-new 9

- ST-new 4

85

-ST-60

40L

40l-—

91 |STA5

—:-ST-76

—ST-2B 1. — SR-67 ' ,

--ST-48 ,r ,

j ' i—ST-25

-^L'sT-fe ■ •

-ihjb -J

22

- ST-new 3

- ST-202

95

35

f-r 11

-St-new7 ' ÍST-46

28 L

-ST-40

381 I-ST-66

53'-ST-new 5

-ST-24

42

8i—ST-45 'ST-53

-ST-41

22

—ST-47 - ST-new 6

19

1001 ST-new t I-ST-new 8

24

-ST-44

-ST-new 2

42

■ST-62

-Г

tIst-

ST-43

100'ST-32 ,

Рис. 4. Дендрограмма филогенетических взаимоотношений штаммов C.diphtheriae, построенная с помощью MEGA 6.06. ,.....■

штаммы C.diphtheriae сйквенс-типа ST25,¡также выделенные в период 1950 — 1969 гг., и близкие к ним ветви, включающие штаммы C.diphtheriae, выделенные в последующие годы, преимущественно биовара gravis. Во второй кластер вошли токсигенные штаммы C.diphtheriae сиквенс-типа 8Т24 биовара mitis, выделенные, начиная с 1970-х гг. и давшие основу для токсигенных штаммов C.diphtheriae двух биоваров, выделенных ;в 1980-е, 1990-е и 2000-е годы. Вместе с тем, у данного дерева есть недостаток, заключающийся в том, что при проверке достоверности данных с помощью метода «rapid bootstrap» оказалось, что достоверность для оценки эволюционных взаимоотношений падает от «предка к потомку». Скорее всего, это связано с высокой генетической вариабильностью штаммов C.diphtheriae. В связи с этим, трудно сделать выводы об эволюционных взаимоотношениях между штаммами. Вместе с тем, при анализе ветвей можно отметить, что есть ветви, включающие современные токсигенные штаммы C.diphtheriae (ST28 и ST67, ST-newl, ST-new6 и ST-new8), а есть ветви, состоящие из токсигенных штаммов C.diphtheriae более раннего происхождения (ST-new7 и ST46, ST-new3 и ST5). Однако видно, что почти во всех случаях близкородственные штаммы C.diphtheriae начинали выделяться приблизительно одновременно.

Учитывая небольшое количество изученных штаммов C.diphtheriae, мы предприняли попытку проанализировать распространение штаммов C.diphtheriae различных сиквенс-типов в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции. С этой целью все изученные штаммы C.diphtheriae были разделены на шесть групп. В первую группу вошли штаммы C.diphtheriae, выделенные в допрививочный период и первые десять лет проведения массовой иммунизации (1957— 1969 гг.), во вторую группу — штаммы C.diphtheriae, выделенные в 1970 — 1979 гг., в третью группу — штаммы C.diphtheriae, выделенные в 1980 — 1989 гг., в четвертую группу — штаммы C.diphtheriae, выделенные в период подъема и начала снижения заболеваемости дифтерией (1990 — 1999 гг.). Пятая группа состояла из штаммов C.diphtheriae, выделенных в 2000 — 2009 гг., и в шестую группу вошли штаммы C.diphtheriae, выделенные в последние шесть лет (2010 — 2015 гг.).

Среди штаммов C.diphtheriae, выделенных в 1957 — 1969 гг., были зарегистрированы штаммы четырех сиквенс-типов — ST25, ST5, ST19 и ST62. Из них большинство штаммов (83,0%) принадлежало к биовару gravis и сиквенс-типу ST25, который характерен для контрольного токсигенного штамма C.diphtheriae № 665, выделенного в 1960-е годы. Изученные токсигенные штаммы C.diphtheriae принадлежали ктрем сиквенс-типам, из которых штаммы биовара gravis относились к двум сиквенс-типам — ST19 и ST25, а штаммы биовара mitis — к одному сиквенс-типу ST5.

Среди штаммов C.diphtheriae, выделенных в 1970 — 1979 гг., были зарегистрированы штаммы шести сиквенс-типов — ST25, ST5, ST24, ST-new2, ST32 и ST202. Токсигенные штаммы C.diphtheriae принадлежали к пяти сиквенс-типам — ST25, ST-new2, ST32, ST5 и ST24. Среди них токсигенные штаммы C.diphtheriae биовара gravis были представлены тремя сиквенс-типами — ST25, ST-new2 и ST32. У токсигенных штаммов C.diphtheriae биовара mitis зарегистрированы два сиквенс-типа — ST5 и ST24.

Среди штаммов C.diphtheriae, выделенных в 1980 — 1989 гг., было отмечено большее разнообразие циркулирующих сиквенс-типов и зарегистрированы штаммы тринадцати сиквенс-типов — ST5, ST8, ST24, ST25, ST43, ST46, ST47, ST48, ST53, ST60, ST66, ST-new3 и ST-new7. Токсигенные штаммы C.diphtheriae принадлежали к двенадцати сиквенс-типам — ST24, ST46, ST5, ST-new3, ST-new7, ST48, ST53 и ST60, ST8, ST25, ST43 и ST 66. Среди токсигенных штаммов C.diphtheriae преобладали штаммы биовара mitis, у которых выявлено большое разнообразие циркулирующих сиквенс-типов. Зарегистрировано девять сиквенс-типов — ST24, ST46, ST5, ST-new3, ST-new7, ST48, ST53 и ST60 с преобладанием штаммов двух сиквенс-типов — ST24 и ST46. У токсигенных штаммов C.diphtheriae биовара gravis выделено четыре сиквенс-типа — ST8, ST25, ST43 и ST 66, из которых преобладали штаммы сиквенс-типа ST8.

Среди штаммов C.diphtheriae, выделенных в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией и начала ее снижения — 1990 — 1999 гг., были зарегистрированы штаммы одиннадцати сиквенс-типов — ST5, ST8, ST12, ST17, ST18, ST24, ST29, ST30, ST40, ST45 и ST-new4. Токсигенные штаммы C.diphtheriae относились к восьми сиквенс-типам — ST8, ST12, ST18, ST-new4, ST5, ST24, ST 17 и ST45. Токсигенные штаммы C.diphtheriae биовара gravis принадлежали к 4 сиквенс-типам — ST8, ST12, ST18 и ST-new4. Токсигенные штаммы C.diphtheriae биовара mitis также относились к четырем сиквенс-типам - ST5, ST24, ST 17 и ST45.

Среди штаммов C.diphtheriae, выделенных в период снижения заболеваемости дифтерией (2000 — 2009 гг.), зарегистрированы штаммы девяти сиквенс-

типов — ST5, ST8, ST25, ST28, ST41, ST-newl, ST-new5, ST-new6 и ST-new8, из которых токсигенные штаммы C.diphtheriae принадлежали к восьми сиквенс-типам — ST8, ST-newl, ST25, ST-new6, ST-new8, ST28, ST5 и ST41. Из них токсигенные штаммы C.diphtheriae биовара gravis принадлежали к пяти сиквенс-типам — ST8, ST-newl, ST25, ST-new6 и ST-new8, а токсигенные штаммы биовара mitis — к трем сиквенс-типам — ST28, ST5 и ST41.

В последние шесть лет на территории России зарегистрированы штаммы 8 сиквенс-типов - Т5, ST8, ST25, ST28, ST40, ST67, ST76 и ST-new9, из которых токсигенные штаммы относились к четырем сиквенс-типам — ST8, ST25, ST5 и ST67. Токсигенные штаммы C.diphtheriae биовара gravis представлены двумя сиквенс-типами — ST8 и ST25, токсигенные штаммы C.diphtheriae биовара mitis также относились к двум сиквенс-типам — ST5 и ST67. Среди выделенных токсигенных штаммов C.diphtheriae практически с одинаковой частотой превалировали штаммы биовара gravis сиквенс-типа ST8 и биовара niitis сиквенс-типа ST67. 1

ОБСУЖДЕНИЕ

Учеными МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского разработана система эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией, которая опирается на глубокое понимание эпидемиологических закономерностей, особенности клинического течения и предусматривает наблюдение за фенотипическими и генотипическими свойствами штаммов C.diphtheriae [1,2,3,9]. И.К. Мазуровой в 1990-е годы разработана комплексная система наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции, основу которой составили классические микробиологические, иммунохимические (реакция непрямой гемагглютинации, имму-ноферментный анализ) и молекулярно-генетические методики (ДНК-ДНК гибридизация нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция по выявлению гена дифтерийного токсина). Применение такого комплексного подхода позволило установить, что возбудитель дифтерии, его биологические свойства могут влиять на развитие эпидемического и тяжесть инфекционного процесса. С. Ю.Комбарова в дальнейшем расширила систему мониторинга возбудителя дифтерийной инфекции с использованием высокоинформативных молекулярно-генетических технологий — риботипирование, мультило-кусный энзимный электрофорез (МЭЭ), полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами (УП-ПЦР) и секвенирование отдельных генов. Многолетний микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг штаммов C.diphtheriae, проводимый в МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, позволил установить особенности биологических свойств штаммов и формирования структуры популяции C.diphtheriae в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции [1, 2, 3, 9].

Проведенное исследование показало, что для токсигенных штаммов C.diphtheriae характерно более выраженное разнообразие сиквенс-типов (26 сиквенс-типов), чем для нетоксигенных штаммов C.diphtheriae (9 сиквенс-типов). Кроме того, для штаммов C.diphtheriae различных биоваров характерны определенные сиквенс-типы и отмечается более выраженная гетерогенность для штаммов биовара mitis (20 сиквенс-типов), чем для штаммов биовара gravis (15 сиквенс-типов). Анализ данных о принадлежности токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae двух биоваров к сиквенс-типам показал прямую взаимосвязь между фенотипическими свойствами (токсиген-ность и биовар) и принадлежностью штаммов C.diphtheriae к определенному сиквенс-типу. Так, токсигенные штаммы C.diphtheriae биовара gravis принад-

лежали к 14 сиквенс-типам: ST8, ST12, ST18, ST19, ST25, ST32, ST43, ST44, ST66, ST-newl, ST-new2, ST-new4, ST-new6,4ST-new8. Токсигенные штаммы C.diphtheriae биовара mitis принадлежали к 13 сиквенс-типам: ST5, ST17, ST24, ST28, ST41, ST45, ST46, ST48, ST53, ST60, ST*-new3, ST-new7. Нетоксигенные штаммы C.diphtheriae биовара gravis относились kST62. Нетоксигенные штаммы C.diphtheriae биовара mitis принадлежали к 8 сиквенс-типам: ST29, ST30, ST40, ST47, ST76, ST202, ST-newS, ST-new9. м .

Анализ распространения штаммов Gidiphtheriae различных сиквенс-типов в динамике эпидемического процесса дифтерийной инфекции показал, что среди штаммов C.diphtheriae, выделецныхв 1957 — 1969 гг., большинство (83,0%) штаммов принадлежало к биовару gravis ST25, который характерен и для контрольного токсигенного штамма Gidiphtheriae № 665, выделенного в 1960-е годы. Среди штаймов C.diphtheriae, циркулирующих в 1970 — 1979 гг., также преобладали штаммы C.diphtheriae биовара gravis ST25, но удельный вес их снизился, а к концу 1970-х годов увеличился удельный вес штаммов биовара mitis ST5. В 1980-е годы у штаммов C.diphtheriae отмечено увеличение разнообразия циркулирующих сиквенс-типов, где среди токсигенных штаммов преобладали штаммы биовара mitis двух сиквенс-типов — ST24 и ST46, а у штаммов биовара gravis — ST8, последний из которых превалировал в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией 1990-х годов и ее снижения (2000 — 2009 гг.). В последние шесть лет на территории России зарегистрированы штаммы 8 сиквенс-типов, из которых токсигенные штаммы относились к четырем сиквенс-типам и с практически одинаковой частотой превалировали штаммы биовара gravis ST8 и биовара mitis ST67. Причем первый токсигенный штамм C.diphtheriae сиквенс-типа ST67 был выделен в Ханты-Мансийском АО в 2012 г., и уже в 2015 г. на этой же территории были | идентифицированы три токсигенных штамма этого сиквенс-типа от лиц, не имевших между собой контактов.

Следует отметить, что токсигенные штаммы C.diphtheriae сиквенс-типов ST5 и ST25 регистрировали на территории России, начиная с 1960-х годов и по настоящее время, что может свидетельствовать о том, что такие сиквенс-типы циркулируют постоянно на территории России с определенной частотой, варьируя в различные периоды. В то время, как ST8 был зарегистрирован на территории России только в 1980-е годы, что может свидетельствовать о ввозе данных штаммов на территорию России. Штаммы с этим сиквенс-типом заняли доминирующее положение в популяции в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией 1990-х годов и до сих пор выделяются на территории нашей страны. По данным зарубежных исследователей [4,13], два клональных комплекса, включающих четыре сиквенс-типа — ST8, ST12, ST52 и ST66, связывают с подъемом заболеваемости дифтерией в 1990-х годах, т.е. они имеют, как полагают, наибольшую эпидемиологическую значимость. Однако токсигенные штаммы C.diphtheriae ST66 были зарегистрированы только в незначительном проценте случаев в 1980-е годы, а штаммов ST52 вообще не выделяли в России. 1

Метод MJICT используется для характеристики токсигенных и нетокси-генных штаммов C.diphtheriae в Англии, Германии, Польше, Франции и Бразилии [5, 6,10,14 — 16]. Так, при идентификации генотипа токсигенных штаммов C.diphtheriae, выделенных в Англии в 2007 — 2013 гг., было обнаружено 8 сиквенс-типов — ST10, ST261, ST262, ST263, ST264, ST265, ST266 и ST267 [6, 15, 16]. Выделенный в Германии в июне 2015 г. от больного дифтерией токсигенный штамм C.diphtheriae принадлежал к другому сиквенс-типу

— ST255 [4]. Однако такие сиквенс-типы на территории России не выделяли. Аналогичные исследования C.diphtheriae с помощью метода MJICT, проведенные в Польше, Франции и Бразилии, были посвящены характеристике1 нетоксигенных штаммов C.diphtheriae [7,10,14 — 16]^ Идентифицировано от 6 до 11 сиквенс-типов, из них большинство штаммов объединены в три сиквенс-типа — ST8, ST-82-и 8Т130. 0днако нетоксигенных штаммов данных сиквенс-типов также на территории России пока не выделено. Обобщая литературные данные по мультилокусному секвенированиию штаммов C.diphtheriae, можно сказать; что тв настоящее время происходив накопление данных • о выделенных сиквенс-типах, которые аккумулируются в международной базе данных PubMLST, где представлено более 300 сиквенс-типов. Вместе с г тем, данный метод может бьггь использован с высокой степенью достоверности для характеристики циркулирующих Штаммов возбудителя дифтерии при расследовании вспышек и расшифровке завозных случаев.

Таким образом, впервые в России оценен клональный состав циркулирующей популяции возбудителя дифтерии с помощью MJICT. Идентифицированы штаммы C.diphtheriae 36 сиквенс-типов, 27 из которых описаны в международной базе PubMLST, и девять новых сиквенс-типов, идентифицированных нами впервые. Среди штаммов C.dipfitheriae доминировали штаммы ST25 и ST8. Показаны взаимосвязи между фенотипи-ческими свойствами (токсигенность и биовар) и принадлежностью штаммов: C.diphtheriae к определенному сиквенс-типу — токсигенные и нетоксигенные штаммы C.diphtheriae различных биоваров характеризовались определенными сиквенс-типами. Использование MJICT позволило охарактеризовать циркулирующую популяцию штаммов C.diphtheriae, выделенных в России, и показало перспективность применения этого метода для характеристики популяции возбудителя дифтерии, выявления эпидемически значимых штаммов (клональных комплексов) и расшифровки очагов дифтерийной инфекции.

ЛИТЕРАТУРА / , .

1. Комбарова С. Ю., Борисова О. Ю., Мельников В. Г. и др. Полиморфизм генов tox и dtxR у циркулирующих штаммов Corynebacterium diphtheriae. Журн, микробиол, 2009,

"1:7-п. ; ■ ■ ' •..';■■' " ' '.'.,.'.';.'.'.'" "

2. Мазурова Й.К., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю. и др. Мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции. Эпидемиология и вакцинопрофилактИка. 2009,3 (46): 17-22.

3. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.К).«и др. Характеристика штаммов C.diphtheriae, циркулирующих в России в различные периоды эпидемического: про-цесса дифтерийной инфекции. Инфекция и иммунитет. 2012, 2(1 — 2):294.

4. Berger A., Meinel D.M., Schaffer A. et al. Acase of pharyngeal diphtheria in Germany, june 2015. Infection. DOI 10.1007/sl5010-016-0882-2.

5. Bolt F., Cassiday P., Tondella M. et al. Multflocus sequence typing identifies evidence for recombination and two distinct lineages of C.diphtheriae. J. Clin. Microbiol. 2010, 48 (11): 4177-4185.

6. Both L., Collins S., Zoysa A. et al. Molecular and epidemiological review of toxigenic diphtheria infections in England between 2007 and 2013. JCM. 2015, 53 (2): 567-572.

7. Fafour E., Badell E., Zasada A. et al. Characterization and comparison of invasive C.diphtheriae isolates from France and Poland. J. Clin. Microbiol. 2012,50 (1): 173-175.

8. Grimont F., Grimont P. Ribosomal ribonucleic acid gene restriction patterns as potential taxonomic tools. Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1986, 137 В (2): 165-175.

9. Kombarova S., Kim C., Melnikov V. et al. Rapid identification of Corynebacterium diphtheriae clonal group associated with diphtheria epidemic, Russian Federation. J. Infect. Dis. 2001,7, 1: 133-136.

10. Mattos-Guaraldi A. L., Moreira L. O., Damasco P. V. et al. Diphtheria remains a threat to health in developing world — an overview. Memorias Instituto Oswaldo Cruz. 2003, 98: 987-993.

11. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeshenko E. et al. Efficent discrimination within Corynebacterium diphtheriae clonal group by a noval macroarray-based method. J. Clin. Microbiol. 2005,43, № 4: 662-668.

12.Popovic T., Kombarova S. J., Reeves M. W. et al. Molecular epidemiology of diphtheria in Russia. J. Infectious Diseases. 1997, 174:1064-1072.

13.Spratt B. G., Maiden M. C. Bacterial population genetics, evolution and epidemiology. Philosophical Transactions Royal Society B. 1999, 354:701-710.

14. Viguetti S., Pacheco L., Santos L. et al. Multilocus sequence types of invasive C. diphtheriae isolated in the Rio de Janeiro urban area, Brazil. J. Epidemiol. Infect. 2011, 53: 1-4.

15. Wagner K., White J., Lucenko I. et al. Diphtheria in postepidemic period, Europe, 2000 — 2009. J. Emeig. Infect. Dis. 2012,18 (2): 217-225.

16.Zakikhany K., Efstratiou A. Diphtheria in Europe: current problems and new challenges. Future Microbiol. 2012, 7 (5): 595-607.

17.Zoysa A., Efstratiou A., Hawkey P. H. et al. Molecular characterization of diphtheria toxin repressor (dtxR) genes present in nontoxigenic Corynebacterim diphtheriae strains isolated in the United Kingdom. J. Clinical Microbiology. 2005,43,1: 223-228. ■

Поступила 01.06.16

Контактная иформация: Чагина Ирина Алексеевна, 125212, Москва, ул.Адмирала Макарова, 10, р.т. (499)747-64-84

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016

С.Б.Яцышина, А.Н.Рентеева, А.В.Валдохина, М.А.Елькина, А.С.Сперанская, Е.В.Пимкина, Р.Р.Минтаев, М.Л.Маркелов, В.В.Малеев

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ ГРИППА A/H3N2 И В, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В РОССИИ В 2013 - 2015 ГГ.

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Москва

Цель. Установить генетическую характеристику, провести филогенетический анализ и определение молекулярных маркеров резистентности к этиотропным препаратам вирусов гриппа A/H3N2 и В, циркулировавших в России в 2013 — 2015 гг. Материалы и методы. Исследованы 80 биологических образцов, содержащих РНК вируса гриппа A/H3N2, и 31 образец, содержащий РНК вируса гриппа В. Секвенирование фрагментов ПЦР выполнялось на ABI-3100 PRIZM™ GeneticAnalyzer (AppliedBiosystems, США) и с использованием MiSeq (Illumina, США), Обработка и анализ данных проводились с помощью программ CLC v.3.6.5., DNASTAR и BioNumerics v.6.5. Результаты. В 2013 — 2014 гг. доминировали вирусы гриппа A/H3N2 клайда ЗС.З, подобные вакцинному штамму A/Texas/50/2012, 10% принадлежали к субклайду ЗС.2а и 10% — к ЗС.ЗЬ. Подавляющее большинство (81%) вирусов 2014 — 2015 гг. вошли в клайд ЗС.2а, доля вирусов, относящихся к ЗС.ЗЬ и ЗС.За, составляла 9% и 10%. Среди исследованных вирусов гриппа В превалировали Ямагата-подобные, лишь 1 вирус в 2014 — 2015 гг. относился к линии Виктория, обнаружен 1 реассортант линий Ямагата и Виктория. Во всех вирусах гриппа À/H3N2 выявлена мутация устойчивости к ремантадину S31N (белок М2). Мутации, определяющие устойчивость к озельтамивиру (ген NA), вирусов гриппа A/H3N2 и В обнаружены не были. Заключение. Подъем заболеваемости гриппом в 2014 — 2015 гг. обусловлен появлением вирусов гриппа A/H3N2 и В, отличающихся по антигенному составу от циркулировавших ранее и от вошедших в вакцину, что привело к решению ВОЗ заменить компоненты A/H3N2 и В вакцины 2015 - - 2016 гг. Одновременная циркуляция двух линий вируса гриппа В и появление их реассортантов свидетельствует о целесообразности применения четырехвалентной вакцины, включающей обе линии.

Журн. микробиол., 2016, № 5, С. 60—72

Ключевые слова: вирусы гриппа, ПЦР, филогенетический анализ