CC BY
55
УДК 599.745.3: 591.111.1
Ключевые слова: ластоногие, кровь, эритроциты
Key words: pinnipeds, blood, erythrocytes
Ерохина И. А.
сорбционная способность ЭРИТРОЦИТОВ морских млекопитающих
SORPTION CAPACITY OF MARINE MAMMALS ERYTHROCYTES
ФГБУН Мурманский морской биологический институт КНЦ РАН Адрес: 183010, Россия, г. Мурманск, ул. Владимирская, 17
FSBIS Murmansk Marine Biological Institute KSC RAS, Murmansk Address: 183010, Russia, Murmansk, Vladimirskaya street, 17
Ерохина Ирина Анатольевна, к. б. н., зам. зав. лабораторией морских млекопитающих Тел. (8152) 23-96-55, e-mail: erohina@mmbi.info
Erokhina Irina A., PhD in Biological Sciences, Deputy Head of Marine Mammal Laboratory Tel. +7 (8152) 23-96-55, e-mail: erohina@mmbi.info
Аннотация. Представлены результаты исследования сорбционной способности эритроцитов (ССЭ) крови некоторых видов морских млекопитающих (гренландский тюлень, серый тюлень, морской заяц). Целью работы была оценка возможности использования данного показателя для характеристики физиологического состояния животных, в частности состояния здоровья на уровне норма - патология. ССЭ определяли методом, основанном на представлении об эритроците как универсальном адсорбенте, применяя витальный краситель метиленовый синий.
У изученных видов морских млекопитающих установлена значительная вариабельность ССЭ в пределах 4-57 %. Для ластоногих определены естественные факторы, влияющие на изменчивость данного показателя: сезон, возраст, стресс-реакция в период первичной адаптации к неволе. У больных животных отмечено повышение ССЭ, в ходе лечения - снижение, при выздоровлении - стабилизация на уровне, зафиксированном до заболевания. В настоящее время использование ССЭ для диагностики состояния морских млекопитающих наиболее вероятно в условиях длительного содержании их в неволе, где возможно определение индивидуальной нормы данного показателя.
Summary. The results of the study of sorption capacity of erythrocytes (SCE) in the blood of some marine mammal species (harp seal, gray seal, sea hare) are submitted. The aim of this work was to evaluate the possibility of using this indicator to characterize the physiological state of the animals, in particular, the state of health under normal and pathological conditions. SCE was determined by the method based on the concept of erythrocyte as a universal adsorbent using the vital dye methylene blue.
Considerable variability of SCE was revealed within 4-57 % for marine mammals species studied. The natural factors were determined affecting the variability of this indicator for pinnipeds - the season, age, stress-response during the initial adaptation to captivity. SCE increase was detected in sick animals, decline during the treatment and stabilization during the convalescence at the level recorded before the disease.
Currently, the use of SCE for diagnosis of the status of marine mammals is most likely in long-term keeping them in captivity, where it is possible to determine the individual standard value of this indicator.
Введение
Физиолого-биохимические параметры крови широко используются в диагностике различных отклонений в состоянии здоровья животных. При этом до сих пор вопрос о наборе применяемых показателей не утратил своей актуальности. Известна концепция комплексности тестов [5], суть которой состоит в создании такой системы, где изменение каждого показателя было бы логически, исходя из современных представлений о схеме метаболических путей, связано с тео-
ретически ожидаемым изменением других показателей. Авторы вышеупомянутой концепции считают, что надежность применения данной системы обеспечивается, в частности, широким набором показателей - более ста. Определенные показатели могут быть сгруппированы в профили, характеризующие состояние отдельных органов и систем органов, например, почечный профиль (общий белок и его фракции, осмолярность, глюкоза, мочевина, креатинин, натрий, калий, кальций, фосфор, хлориды), печеночный
профиль (общий белок и его фракции, глюкоза, мочевина, холестерин, билирубин, транс-аминазы, щелочная фосфатаза, гамма-глута-милтрансфераза) и т. д. В настоящее время полное биохимическое исследование крови в лабораторной практике включает в себя до 30 показателей.
Морские млекопитающие, в связи с их образом жизни и особенностями биологии, являются труднодоступным объектом для такого рода исследований. В то же время необходимость оценки состояния их здоровья возникает как при изучении этих животных в естественной среде обитания, так и при содержании их в неволе в многочисленных коммерческих и научно-исследовательских океанариумах. Далеко не каждый океанариум может позволить себе регулярные лабораторные исследования, несмотря на то, что эти мероприятия являются неотъемлемой частью системы полноценного жизнеобеспечения животных в неволе. Биохимические методы диагностики заболеваний морских зверей в океанариумах, на наш взгляд, могут и должны применяться как профилактические мероприятия и укладываться в схему диспансеризации животных. В связи с этим традиционный набор изучаемых показателей основных видов обмена веществ следует расширять за счет неспецифических тестов состояния здоровья животных на уровне норма - патология, с помощью которых можно обнаружить заболевание на той стадии, когда еще не выражены внешние симптомы. Нам представляется, что для создания стройной системы оценки состояния здоровья животных следует охарактеризовать как можно больше различных физиологических показателей в их взаимосвязи, и наиболее четкие и однозначные предлагать в качестве критериев оценки.
Ранее нами были представлены результаты изучения гаптоглобина [1] и белковых фракций плазмы крови [2]. Данная работа является продолжением серии исследований неспецифических показателей состояния здоровья у морских млекопитающих и посвящена оценке сорбционной способности эритроцитов.
Материалы и методы
Исследовали кровь гренландского тюленя (Pagophilus groenlandicus Егх1еЬеп, 1777) (п = 28), серого тюленя (НаИ^оегш grypus Fabricius, 1791) (п = 36) и морского зайца (Erignathus ЬагЬаи Егх1еЬеп, 1777) (п = 7). Кровь брали из экстрадуральной вены, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. Плазму отделяли центрифугированием. Эритроциты троекратно отмывали охлажденным изотоническим раствором хлористого натрия. Сорбци-онную способность эритроцитов (ССЭ) определяли методом, основанным на представлении об эритроците как универсальном адсорбенте [10]. Для этого 1 мл суспензии эритроцитов переносили в пробирку с 3 мл 0,025%-ного метиленового синего в физиологическом растворе. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре пробу центрифугировали 10 мин. при 3 000 об./мин. Определяли оптическую плотность надосадочной жидкости и исходного раствора метиленового синего по отношению к физиологическому раствору при длине волны 630 нм. Количество поглощенного красителя выражали в процентах. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах оценивали по уровню вторичных продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных веществ), основным компонентом которых является малоновый диальдегид [4]. Цифровой материал обработан статистически с использованием критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
В адаптивных реакциях организма изменения в структуре и функциях мембран рассматриваются как одно из основных универсальных звеньев. Эритроциты являются наиболее удобными в качестве естественной модели для исследования общих характеристик всех биологических мембран, поскольку доказана корреляция между изменениями свойств эритроцитов и клеточных мембран внутренних органов. К тому же метаболические процессы, протекающие в этих клетках крови в про-
цессе развития и в аномальных условиях, отражают реакцию клеток на уровне всего организма. В клинической практике часто используется показатель проницаемости мембран эритроцитов как частный аспект изучения проницаемости клеточных мембран. Одним из способов исследования проницаемости эритроцитарных мембран является определение их сорбционной способности.
У изученных нами видов морских млекопитающих установлена значительная вариабельность ССЭ в пределах 4-57 %. При этом наиболее широкий диапазон значений отмечен для эритроцитов гренландского тюленя (3,75-57,50 %). У серого тюленя ССЭ варьирует от 7,29 % до 50 %, у морского зайца - от 7,32 % до 27,96 %. Данные по ССЭ у морского зайца нуждаются в дальнейшем уточнении в связи с тем, что нами были обследованы животные в возрасте от 3 до 10 лет, тогда как для гренландского и серого тюленей были получены значения ССЭ и для младших возрастных групп -от нескольких месяцев до 1-2 лет, в которых и отмечена вышеупомянутая широкая вариабельность изучаемого показателя.
У тюленей сорбционная способность эритроцитов относительно стабильна в течение первых трех лет жизни и находится в среднем в пределах 15-22 %, достоверно увеличиваясь к 5-летнему возрасту до 36 % (рис. 1).
Рис. 1. Сорбционная способность эритроцитов (ССЭ) гренландских тюленей разного возраста.
Впрочем, следует отметить, что у изученных нами морских зайцев в естественной среде обитания (возраст около 5 лет) ССЭ составила 24,27±2,69 %, а значе-
ния выше 30 % регистрировались только у больных животных этого вида, содержавшихся в неволе. А у животного в возрасте 10 лет ССЭ была 7,32±0,44 %, т. е. в три раза меньше, чем у более молодых особей. Таким образом, возрастная динамика изученного показателя у морских зайцев заметно отличается от таковой у гренландского и серого тюленей. Малая выборка (7 особей) не позволяет делать окончательных выводов относительно того, является ли это видовой особенностью, поэтому мы приводим здесь эти цифры лишь для сведения.
У морских млекопитающих, по сравнению с наземными и человеком, следовало бы ожидать более высокие уровни ССЭ как следствие повышенной адсорбционной функции эритроцитов для поддержания низкой вязкости крови. Так, величина этого показателя у человека в норме составляет около 45 % [10]. В наших исследованиях нет данных о ССЭ у животных старше 5 лет (гренландский и серый тюлени) и 10 лет (морской заяц), в связи с этим можно лишь предположить, что в дальнейшем с возрастом не исключено повышение ССЭ. Основанием для этого служат данные литературы о том, что при старении животных происходят изменения морфофизиоло-гических показателей эритроцитов, снижение стабильности эритроцитарных мембран вследствие возрастной интенсификации свободнорадикальных процессов в крови [9].
В наших исследованиях отмечена определенная связь между сорбционной способностью эритроцитов и интенсивностью перекисного окисления липидов в них. О последнем судили по уровню вторичных продуктов данного процесса, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных веществ). На рисунке 2 видно, что повышение ССЭ гренландских тюленей к 24-месячному возрасту сопровождается достоверным увеличением содержания продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах. При этом у щенков тюленей (возраст 6 месяцев) отмечается
высокий уровень ССЭ при относительно невысокой интенсивности окислительных процессов.
ССЭ, % 50
40
30
1НССЭ. %
-О—ТБК-Акг. ммоль/л
ТБК-Акг, мкмоль/л '60
1|
12
15
24 Возраст, мес
Рис. 2. Сорбционная способность (ССЭ) и уровень продуктов перекисного окисления липидов (ТБК-Акт) эритроцитов гренландских тюленей разного возраста.
Сходное соотношение ССЭ и уровня ТБК-активных веществ в эритроцитах животных разного возраста было отмечено и у серых тюленей. Так, например, у двухмесячных щенков ССЭ составляла 24,67±1,28 % при уровне ТБК-активных веществ в эритроцитах 15,69±0,79 мкмоль/л, тогда как у животных в возрасте 2 года - 12,66±1,02 % и 38,72±1,95мкмоль/л, соответственно. Вероятно, в раннем периоде постнатального развития, до годовалого возраста, процессы перекисного окисления липидов не являются единственным и решающим фактором, определяющим функциональное состояние мембран эритроцитов. Гораздо более важное значение в это время имеют метаболические перестройки, связанные с переходом к самостоятельному питанию, интенсивным ростом, адаптациями системы крови к водному образу жизни, напрямую затрагивающими эритроциты как структуры, обеспечивающие повышенную кислородную емкость крови.
Сорбционная способность эритроцитов тюленей характеризуется выраженной сезонной изменчивостью - снижение в весенне-летний период и повышение в осенне-зимний (рис. 3). Наиболее вероятным представляется объяснение этого факта с позиции вышеупомянутой связи ССЭ с уровнем свободнорадикальных процессов. Имеются данные об интенсификации процессов пере-
кисного окисления липидов у животных, обитающих в северных широтах, а также экспериментальные доказательства усиления свободнорадикального окисления при понижении температуры окружающей среды [6].
30 -25 -20 -15 -10 -5 -
¿1
гЬ ¿1
а
д
-1л ГЬ
-I-
I
¡1
IV V VI VII VIII IX X XI XII
Рис. 3. Сорбционная способность эритроцитов (%) гренландских тюленей в течение года.
Рис. 4. Сорбционная способность эритроцитов (%) гренландских тюленей в период адаптации к неволе.
Значительные изменения ССЭ (в 1,5-2 раза) наблюдаются в процессе адаптации животных к условиям неволи (рис. 4) независимо от возраста. Динамика уровня ССЭ в период адаптации к неволе имеет волнообразный вид и характеризуется у всех обследованных животных резким снижением (в 4-6 раз) в течение первой недели содержания в неволе. К концу четвертой недели пребывания в неволе показатели ССЭ в целом приближаются к исходным. Очевидно, в данном случае наблюдается усиление адсорбционно-транспортной функции эритроцитов для стабилизации уровня метаболитов в плазме крови [8] в условиях развития стресс-реакции в начальный период содержания животных в неволе. В дальнейшем интенсивность адсорбции снижается на фоне активизации компенсаторно-при-
способительных механизмов стабилизации состава крови при стрессе, описанных у морских млекопитающих при адаптации к условиям неволи [3].
Нами определялись значения ССЭ у тюленей при заболеваниях различной этиологии. Были отмечены закономерности, описанные и для наземных животных [7], в частности, повышение ССЭ пропорционально тяжести течения процесса. Так, например, у самца морского зайца с многочисленными кожными высыпаниями и язвами уровень ССЭ составлял 32,14 %. В результате лечения через 25 суток внешние поражения исчезли, гематологические и биохимические исследования показали нормализацию показателей крови. ССЭ в этот период снизилась до 21,74 %, практически до уровня, отмечаемого до заболевания. В это же время в крови установлено уменьшение содержания продуктов пе-рекисного окисления липидов с 1,1 нмоль/мг липидов до 0,35 нмоль/мг липидов.
При использовании какого-либо показателя с диагностической целью неизбежно возникает вопрос о значениях нормы для него. В отличие от большинства наземных животных, у морских млекопитающих проблема нормы биохимических показателей еще далека от своего разрешения. Несмотря на большой объем данных по биохимии этих животных (главным образом, массовых видов), пользование этой информацией сопряжено с определенными трудностями. Наблюдаются некоторые различия между данными, представленными разными авторами, вероятно, обусловленные различиями методических подходов, условий получения и обработки материала исследований. Довольно часто в литературе встречается информация, полученная при изучении животных неопределенного возраста, без указания на физиологическое состояние. В то же время хорошо известно (и представленные в настоящей статье результаты демонстрируют это), что большинство биохимических показателей зависят от возраста, питания, стадии линьки, действия стресс-факторов, болезней и паразитов. Определенное влияние могут оказывать условия получения и хранения биоматериала, применяемые антикоагулян-
ты. Работая с животными в неволе, необходимо учитывать изменения их физиологического и биохимического статуса в связи с изменившимися условиями жизни. Вероятно, проблематично использовать в данном случае в качестве нормы показатели того же вида в естественной среде обитания. Хотя, на первый взгляд, этот путь привлекателен, т. к. обычно в природе можно обследовать большое количество особей и получить, таким образом, репрезентативные данные. Думается, что использование различных показателей зверей в естественной среде обитания в качестве нормальных оправдано в тех исследованиях, которые направлены на выяснение путей и механизмов изменения биохимического статуса животных в период адаптации к жизни в неволе. И в тех случаях, когда эти показатели отличаются от таковых в естественной среде обитания, это вовсе не означает отклонения от нормы, а, скорее, указывает на формирование нормальных уровней биохимических параметров у адаптированных к неволе особей. Поскольку в океанариумах содержится обычно ограниченное количество животных разного возраста, пола, принадлежащих к различным видам, целесообразно определять значения «индивидуальной нормы» для каждого конкретного животного. В этом случае отклонение от индивидуальной нормы правомерно рассматривать как следствие изменений физиологического состояния животного.
Заключение
Таким образом, в результате исследования установлена значительная вариабельность уровня сорбционной способности эритроцитов крови различных видов морских млекопитающих. Для ластоногих определены естественные факторы, влияющие на изменчивость данного показателя: возраст, сезон, стресс в период первичной адаптации к неволе. У больных животных отмечено его повышение, в ходе лечения - снижение, при выздоровлении - стабилизация на уровне, зафиксированном до заболевания. Установленные факты приводят к заключению, что в настоящее время определение сорбционной способности эритроцитов для диагностики
состояния морских млекопитающих наиболее вероятно в условиях длительного содержании их в неволе, где возможно определение индивидуальной нормы данного показателя.
Список литературы
1. Ерохина, И. А. Гаптоглобин в плазме крови арктических ластоногих / И. А. Ерохина // Ветеринарная практика. - 2008. - № 3 (42). - С. 164-167.
2. Ерохина, И. А. Протеинограммы плазмы крови тюленей в связи с оценкой физиологического состояния животных / И. А. Ерохина // Актуальные вопросы ветеринарной биологии - 2009. - № 1 (1). - С. 7-13.
3. Каганова, Н. В. Состояние внутриэрит-роцитарного метаболизма у дельфиновфалин при адаптации к условиям океанариума / Н. В. Каганова, С. В. Коношенко, М. В. Ларина // Морские биотехнические системы. - Севастополь, 2002. - Вып. 2. - С. 173-181.
4. Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т.2. / В. С. Камышников. - Минск : Беларусь, 2000. -463 с.
5. Кожевникова, Л. К. Физиолого-биохимический мониторинг в звероводстве / Л. К. Кожевникова, Н. Н. Тютюнник, Х. И. Мелдо // Проблемы экологи-
ческой физиологии пушных зверей. - Петрозаводск : Карельский научный центр РАН, 1994. - С. 7-34.
6. Куликов, В. Ю. Перекисное окисление липидов и холодовой фактор / В. Ю. Куликов, А. В. Семенюк, Л. И. Колесникова. - Новосибирск : Наука, 1988. -192 с.
7. Нежданов, А. Г. Клинико-гематологический и биохимический статус коров при гестозе / А. Г. Нежданов, М. И. Рецкий, Ю. Н. Алехин, В. А. Сафонов, В. И. Шушлебин, Н. Е. Папин, Т. П. Брехов, Е. В. Шишкина // Сельскохозяйственная биология. - 2010. -№ 4. - С. 118-123.
8. Ошакбаев, К. П. Взаимосвязь между эндогенной интоксикацией и анемией / К. П. Ошакбаев, О. Р. Хан, Б. Н. Кожабекова, А. Н. Сейтбай, Б. А. Дукенбае-ва, Г. Р. Ищанова // Профилакт. медицина. - 2007. -№ 1. - С. 21-25.
9. Теплый, Д. Д. Особенности морфофизиологи-ческих показателей эритроцитов белых крыс на этапах онтогенеза в норме и при оксидативном стрессе. Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. / Д. Д. Теплый. -Астрахань, 2011. - 21 с.
10. Тогайбаев, А. А. Способ диагностики эндогенной интоксикации / А. А. Тогайбаев, А. В. Кургузкин, И. В. Рикун, Р. М. Карибжанова // Лаб. дело. - 1988. -№ 9. - С. 22-24.
