CC BY
91
УДК 599.745.3:591.111.1
Ключевые слова: тюлени, кровь, протеинограммы
Key words: seals, blood, protein electrophoresis
Ерохина И. А.
ПРОТЕИНОГРАММЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ ТЮЛЕНЕЙ В СВЯЗИ С ОЦЕНКОЙ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ЖИВОТНЫХ
PROTEIN ELECTROPHORESIS OF SEAL'S BLOOD PLASMA IN CONNECTION WITH AN EVALUATION OF A PHYSIOLOGICAL STATE OF ANIMALS
Мурманский морской биологический институт КНЦ РАН, г. Мурманск
Murmansk Marine Biological Institute KSC RAS, Murmansk
Ерохина Ирина Анатольевна, зам. зав. лабораторией морских млекопитающих. Тел. (8152) 23-96-55
Yerokhina Irina A., Deputy Head of Marine Mammal Laboratory. Tel. +7 (8152) 23-96-55
Аннотация. Представлены результаты исследований белкового состава плазмы крови некоторых видов ластоногих в норме и при различных формах патологии. Закономерности изменений соотношения белковых фракций сходны с таковыми у наземных млекопитающих и человека. Показана возможность использования данного показателя, наряду с другими, для оценки физиологического состояния животных - в системе контроля за адаптацией животных к неволе, для оценки эффективности кормления. Протеинограммы могут применяться в качестве неспецифического показателя здоровья животных на уровне «норма - патология».
Summary. The results of researches of a blood plasma protein content in some species ofpinnipeds in norm and at the various forms of a pathology are submitted. The laws of changes of an interrelation of protein fractions are similar to those at terraneous mammalian and man. The potentialities of use of this parameter, alongside with others, for an evaluation of a physiological state of animals in the monitoring system for captive animals and for an evaluation of a feed efficiency are shown. Protein electrophoresis can be applied as a nonspecific parameter of animals health at a level a norm - pathology.
Введение
Клинико-биохимический анализ обычно начинается с определения содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови. Потребность установления его концентрации во многом обусловлена той многообразной и важной физиологической ролью, которую играют белки в организме. Благодаря им поддерживается вязкость, текучесть крови, формируется ее объем в сосудистом русле, а форменные элементы удерживаются во взвешенном состоянии. Белки плазмы осуществляют транспорт многочисленных экзо-и эндогенных веществ, участвуя в связывании гормонов, минеральных компонентов, липидов, пигментов и других биологически важных соединений. Будучи амфотерными электролитами, они играют важную роль в регуляции кислотно-основного состояния организма, являются факторами свертывания крови, антителами. Поэтому изменение их содержания в крови приводит к нарушению гомеостаза и специфической реактивности организма. Представление об уровне
общего белка в плазме крови позволяет сделать более информативной трактовку про-теинограммы - картины разделения белков по фракциям. Соотношение белковых фракций в плазме крови можно определять различными методами: осаждение нейтральными солями, электрофоретическое фракционирование, иммунологические методы, седиментационные методы, осаждение белков охлажденным этанолом (по Кону), хроматография, фильтрация через гели [4]. В клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений наиболее распространен электрофоретический метод исследования, основанный на том, что в электрическом поле белки плазмы крови движутся по смоченному буфером носителю со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки плазмы крови разделяются обычно на пять основных фракций: альбумин и альфа-1-, альфа-2-, бета-, гамма-глобулины, содержание которых определяется с помощью фото-
метрии или денситометрии. Более простой в исполнении и не требующий специального оборудования метод исследования белкового спектра плазмы крови - осаждение нейтральными солями. Этот метод базируется на способности растворов солей (сернокислого аммония, сернокислого и фосфорнокислого натрия и других) разных концентраций осаждать отдельные белки плазмы крови. Содержание белка в каждой из полученных фракций определяется либо турбидиметри-ческим, либо колориметрическим методом. Путем вычитания полученных значений абсорбции в дальнейшем находят концентрацию соответствующих фракций. Для диагностики заболеваний внутренних органов большое значение имеет комплексная оценка изменений всех выявляемых белковых фракций.
В течение многих лет в лаборатории морских млекопитающих Мурманского морского биологического института КНЦ РАН (ММБИ) изучается клеточный и химический состав крови ластоногих в естественной среде обитания и при содержании в неволе. В результате этих исследований мы получили обширный материал, позволяющий в определенной степени судить о связи отдельных показателей крови с физиологическим состоянием животных. В данной работе предпринята попытка обобщить данные о белковом составе плазмы крови тюленей в норме и при различных патологических состояниях и оценить возможность использования этого показателя в практике профилактики и лечения экспериментальных животных.
Материалы и методы
Материалом исследования служила плазма крови нескольких видов арктических ластоногих. Животных обследовали в природных условиях во время экспедиций, а также при содержании на экспериментальном полигоне ММБИ в Кольском заливе. Кровь брали из экстрадуральной вены, как описано в работе [11]. Плазму отделяли центрифугированием и в ней определяли содержание общего белка (биуретовый метод) [4] и распределение его по фракциям. Последний показатель в разные годы был получен с использованием
двух методов: электрофорез на бумаге [4] и нефелометрический метод, основанный на осаждении белков растворами нейтральных солей [8]. Статистически достоверных различий между данными, полученными с использованием двух вышеупомянутых методов, не отмечалось. На этом основании в настоящее время в наших исследованиях применяется нефелометрический метод, поскольку он не требует специального оборудования, прост в исполнении и позволяет получить результат в течение 1 часа. Цифровой материал обработан статистически с использованием критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
При использовании протеинограмм плазмы крови животных с диагностическими целями необходимо располагать нормальными значениями соотношения белковых фракций, учитывая при этом естественные факторы, вызывающие изменения состава крови. Одним из таких факторов является возраст животных. Исследования возрастных изменений содержания в плазме крови белка и его фракций проводились нами у гренландских и серых тюленей.
Содержание общего белка с возрастом, как правило, увеличивается [10, 14]. Концентрация белка у взрослых гренландских тюленей достоверно (р<0,001) выше, чем у щенков (110,09±5,33 г/л против 78,38±2,59 г/л) (табл. 1). Общей закономерностью, наблюдаемой у различных видов животных, является и возрастное перераспределение белка по фракциям [6, 13], причем уровень альбумина несколько снижается по причине уменьшения использования белка для пластических процессов и снижения интенсивности синтеза альбумина в печени. При этом относительная концентрация глобулинов плазмы крови с возрастом увеличивается, что может быть связано с понижением скорости распада глобулинов у взрослых животных. В таблице 1 видно, что в плазме крови взрослых особей повышение уровня общего белка происходит главным образом за счет Р-глобулиновой фракции.
К естественным изменениям соотношения белковых фракций плазмы крови можно
отнести и такие, которые происходят в пределах ответной реакции организма на стрес-сирующие воздействия. Для морских млекопитающих, как и для других животных, стресс-фактором является пленение, транспортировка и помещение в искусственные условия. В ММБИ постоянно содержатся в неволе разные виды ластоногих, в связи с чем мы располагаем данными об изменении состава крови у них на разных этапах содержания в неволе [2]. Динамика концентрации белка плазмы и его фракций у гренландского тюленя в первые дни
содержания в неволе показана на рисунке 1. Содержание общего белка находится в пределах 77,37-89,93 г/л, что показано и для других видов ластоногих [10]. Значительная часть белка (до 75 %) представлена альбумином. В связи с этим и белковый коэффициент (А/Г) у изученных животных довольно высок. При наблюдении за животными в неволе наиболее значительные изменения отмечены в содержании гамма-глобулинов, что,
Рис. 1. Динамика содержания общего белка и его фракций в плазме крови щенков гренландского тюленя в первые дни содержания в неволе.
в первую очередь, указывает на напряжение защитно-приспособительных сил организма. К концу периода наблюдения уровень этих белков возрастает в среднем в 4 раза. Аналогичные результаты были получены и при
Таблица 1.
Содержание общего белка и распределение его по фракциям в плазме крови тюленей разного возраста
Возраст Общий белок, г/л Белковые фракции (отн., %)
альбумин а-глобулины Р-глобулины у-глобулины
Гренландский тюлень
Новорожденные (п=19) 78,38±2,59 64,01±1,75 11,08±2,68 10,47±2,13 14,44±1,69
1,5-2 мес. (п=16) 66,96±2,39* (Р<0,02) 59,50±2,60 (Р>0,05) 9,93±1,36 (Р>0,05) 10,59±1,86 (Р>0,05) 19,98±2,49 (Р>0,05)
1 год (п=4) 102,65±1,56* (р<0,001) 54,75±2,77* (Р>0,05) 18,31±1,84* (р<0,01) 12,53±1,79 (Р>0,05) 14,41±0,92 (р<0,05)
2 года (п=3) 81,97±7,40 (Р<0,05) 58,32±5,70 (Р>0,05) 16,45±3,76 (Р>0,05) 11,01±1,97 (Р>0,05) 14,22±2,62 (Р>0,05)
3 года (п=3) 83,40±2,90 (Р>0,05) 50,88±1,54* (Р>0,05) 23,16±1,40* (Р>0,05) 11,93±0,96* (Р>0,05) 14,03±1,10 (Р>0,05)
Взрослые (п=10) 110,09±5,33* (р<0,001) 54,24±1,50* (Р>0,05) 15,52±0,45 (р<0,001) 21,53±0,90* (р<0,001) 8,71±0,67* (р<0,001)
Серый тюлень
Новорожденные (п=6) 64,69±0,34 64,35±3,38 12,56±2,58 13,13±2,21 10,07±0,74
1,5-2 мес. (п=6) 78,42±2,38* 64,16±3,50 10,85±2,07 14,26±1,87 10,73±0,71
1 год (п=3) 75,69±2,27* 58,11±2,91 13,33±1,35 20,95±1,05* (Р<0,02) 7,61±0,39* (р<0,01)
Примечание: п - количество животных; знаком «*» обозначены статистически достоверные различия по сравнению с показателями новорожденных животных; в скобках указана степень достоверности различий по сравнению с предыдущим возрастом.
исследовании китообразных - дельфинов-афалин [3]. По поводу степени увеличения содержания гамма-глобулинов в крови следует отметить работу [5], в которой приводятся данные о том, что у здоровых дельфинов-афалин, содержащихся в неволе, уровень иммуноглобулина G, составляющего основную часть этой фракции, повышается примерно на 80 %. Другие белковые фракции в меньшей степени подвержены изменениям в период адаптации к неволе, как показывает наше исследование и подобные работы с китообразными [3].
Влияние питания на белковый состав плазмы крови животных подтверждается исследованиями биохимического статуса тюленей с различными нарушениями процесса молочного вскармливания [1]. Аномальное течение лактационного периода, когда ощенившиеся самки в силу каких-то физиологических и патологических причин совсем бросают кормить детенышей или когда детеныши получают недостаточное количество молока в течение лактационного периода, приводит к появлению так называемых щенков-заморышей. По содержанию общего белка между нормальными щенками и заморышами не обнаружено статистически достоверных различий. Однако распределение белка по фракциям у обследованных животных неодинаково, о чем свидетельствуют протеинограммы, полученные методом электрофореза на бумаге (рис. 2).
В группе нормальных щенков обнаружен один тип протеинограмм (рис. 2а). Среди заморышей только 20 % имели протеинограм-мы, близкие к нормальной. Остальные были сгруппированы нами по признаку характерных отклонений от нормального соотношения белковых фракций, которые выражаются в следующем:
значительное уменьшение содержания альбумина и большая выраженность фракции а-глобулинов (рис. 2б); значительное увеличение содержания альбумина наряду с понижением уровня а-глобулинов (рис. 2в);
значительное повышение содержания у-глобулинов, умеренное понижение содержания а-глобулинов (рис. 2г);
значительное увеличение содержания аль-
Рис. 2. Типы протеинограмм, встречающихся у нормальных щенков (а) и заморышей (б, в, г, д) гренландского тюленя (п = 16, 10, 4, 9, 1 соответственно). Стрелками показаны направление и степень выраженности изменений в содержании отдельных белковых фракций у заморышей по сравнению с нормальными щенками.
бумина и в той же мере уменьшение содержания а-глобулинов, умеренное повышение уровня в- и у-глобулинов (рис. 2д).
В процентном выражении среди обследованных заморышей преобладают особи с 1 и 3 типом протеинограмм (34 % и 32 % соответственно). Крайне редко (в 2 % случаев) встречается 4 тип протеинограмм.
Следует отметить, что у заморышей, явно истощенных особей, сопутствующая этому состоянию гипопротеинемия наблюдается только у 42 % обследованных животных. Этот факт наводит на мысль о наличии в организме заморышей патологических процессов, которые не связаны непосредственно с недостаточностью питания. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что у отдельных внешне нормальных щенков и взрослых особей встречаются аномальные протеино-граммы, сходные с таковыми у заморышей. Не исключено, что недокорм матерью не является единственной причиной аномального состояния заморышей. Щенки могут иметь врожденные отклонения в развитии в условиях загрязнения среды обитания, а также поражаться болезнетворными агентами в первые дни и недели жизни.
Распределение белка плазмы крови по фракциям (протеинограмма) является важным диагностическим показателем. Исследование количественных взаимоотношений между отдельными белковыми фракциями позволяет выявить и дифференцировать заболевание даже тогда, когда содержание общего белка, которое само по себе является важным клиническим признаком, оказывается неизменным [4]. Как и другие клинические
биохимические методы, этот используется как для постановки диагноза, так и для изучения тяжести и динамики патологического процесса [7, 12]. Существует перечень типов протеинограмм, соответствующих определенным видам заболеваний внутренних органов человека (табл. 2). Применительно к морским млекопитающим оценка протеи-нограмм при обследовании животных пока еще не является широко распространенной. В большинстве публикаций, посвященных анализу биохимических компонентов крови тюленей и дельфинов, можно встретить «усеченный вариант» протеинограммы - содержание альбумина и суммы глобулинов. Этот вариант имеет право на существование, поскольку соотношение альбумин/глобулины (альбумин/глобулиновый коэффициент) рассматривается как интегральная оценка протеинограмм [4]. Однако для уточнения диагноза рекомендуется определять соотношение глобулиновых фракций. В руководстве по клинической патологии морских млекопитающих [9] приводится толкование изменений в уровне белковых фракций (табл. 3).
Представленные в таблице 3 данные дают самое общее представление о реакции отдельных белковых фракций на различные формы патологии. Отсутствие детализации объясняется в значительной степени тем, что морские млекопитающие до сих пор еще остаются группой животных, недостаточно изученной с точки зрения биохимии и физио-
логии. Результаты лабораторных обследований больных животных крайне разрозненны, неполны и противоречивы.
Можно сказать, что данное направление исследований еще находится на этапе сбора информации. Однако уже сейчас отметим, что закономерности изменений белкового состава плазмы крови морских млекопитающих в ответ на действие различных факторов сходны с таковыми, установленными для наземных млекопитающих и человека, что облегчает интерпретацию результатов исследования морских животных.
Имеющиеся у нас данные в некоторой степени дополняют известные факты о связи белкового состава крови морских млекопитающих с различными видами заболеваний (табл. 4). Судя по приведенным результатам, изменения соотношения
белковых фракций являются неспецифической реакцией на заболевание, и при констатации данного факта требуется дополнительное лабораторное обследование с применением специфических тестов, характеризующих состояние отдельных органов и систем организма. Например, определение билирубина, мочевины, активности трансаминаз, щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтрансферазы - для оценки состояния печени, определение креатинина, мочевины, электролитов (натрий, калий, кальций, фосфор, хлориды) - для оценки состояния почек и т.п.
Таблица 2.
Типы протеинограмм, соответствующие определенным видам заболеваний внутренних органов человека (по: [4])
№ Тип протеинограммы, соответствующий Альбумин Глобулины
а, а2 ß Y
1. острым воспалительным процессам l Î î
2. хроническому воспалению \ / î î
3. нефротическому симптомокомплексу l î î \
4. злокачественным новообразованиям l Î î î î
5. гепатитам \ ^ / î
6. циррозам печени l l î î
7. обтурационной желтухе \ / / /
8. в-глобулиновым плазмоцитомам l l l î l
9. у-глобулиновым плазмоцитомам l l l l î
10. а2-глобулиновым плазмоцитомам l l î l l
Таблица 3.
Изменения относительного содержания белковых фракций плазмы крови в связи с патологическими состояниями организма (по: [9])
Белковые фракции Повышение Понижение
альбумин обезвоживание недостаточное питание; болезни печени, почек, желудочно-кишечного тракта; кровотечения
а-глобулины острый воспалительный процесс; некоторые виды гепатитов; нефротический синдром нет сведений
в-глобулины нефротический синдром; дерматиты; острый и хронический гепатиты нет сведений
у-глобулины острый воспалительный процесс; хронический гепатит; воспаление легких; опухоли; у-глобулиновые плазмоцитомы приобретенный иммунодефицит при хронических заболеваниях
Таблица 4.
Содержание белка, соотношение белковых фракций и альбумин/глобулиновый коэффициент (А/Г) крови ластоногих с различными заболеваниями
Объект Общий белок, г/л Белковые фракции (отн., %) А/Г
альбумин а- глобулины в- глобулины Т- глобулины
Морской заяц, самец, дерматит, до лечения после лечения 76,90 88,60 33,21 51,72 34,64 16,55 8,93 22,76 23,22 8,97 0,50 1,07
Морской заяц, самка, гельминтоз, перед гибелью 89,70 40,00 27,00 23,50 9,50 0,67
Морской заяц, самка, заболевание не установлено 72,30 48,41 14,76 13,97 22,86 0,94
Тюлень-хохлач, самка, заболевание не установлено, перед гибелью 45,90 59,30 8,14 7,68 24,88 1,46
Гренландский тюлень, самка, заболевание не установлено, перед гибелью 54,80 77,60 9,60 8,80 4,00 3,46
Гренландский тюлень, самец, гастроэнтероколит, гепатоз и паренхиматозная желтуха 84,60 71,73 9,07 9,07 10,13 2,54
Гренландский тюлень, самка, энтероколит, гепатоз и паренхиматозная желтуха 87,40 67,11 13,95 10,53 8,42 2,04
Гренландский тюлень, самка, паренхиматозная дистрофия печени и почек, энтерит, обезвоживание 90,30 70,98 21,22 4,63 3,17 2,45
Примечание: вскрытие погибших животных и постановка патанатомического диагноза выполнялись ветеринарным врачом, к.б.н. Елфимовой Т. Б.
Заключение
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что у морских млекопитающих, так же как и у наземных, соотношение основных белковых фракций в плазме крови изменяется под влиянием естественных и патологических причин. В последнем случае направление и степень выраженности изменений может использоваться с диагностической целью с учетом следующих замечаний:
определение соотношения белковых фракций плазмы крови должно проводиться регулярно в процессе диспансеризации с учетом индивидуальной нормы животных;
протеинограмма плазмы крови является неспецифическим показателем здоровья и должна использоваться, наряду с другими подобными тестами, в оценке состояния организма животных на уровне «норма - патология». При отклонении протеинограммы от «нормальной» должны назначаться дополнительные тесты с учетом характера вышеупомянутых отклонений.
Список литературы
1. Ерохина, И. А. Влияние недоедания в период молочного вскармливания на биохимические параметры плазмы крови щенков гренландского тюленя Phoca groenlandica / И. А. Ерохина // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 2002. - Т. 38. - № 2. -С. 153-155.
2. Ерохина, И. А. Состав и свойства белков сыворотки крови щенков гренландского тюленя Pagophilus groenlandicus в период адаптации к неволе / И. А. Ерохина, Н. Н. Кавцевич // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1998. - Т. 34. - № 6. - С. 654-660.
3. Каганова, Н. В. Изменение показателей белкового обмена в крови черноморских дельфинов-афалин в период послеотловной адаптации / Н. В. Каганова, Ю. В. Наумова // Морские биотехнические системы : Сб. научных статей. - Севастополь, 2002. - Вып. 2. -С. 182-187.
4. Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Т. 1. -Минск : Беларусь, 2000. - С. 214-257.
5. Кирюхин, И. Ф. Некоторые характеристики иммуноглобулина G сыворотки крови черноморских дельфинов афалин / И. Ф. Кирюхин, О. Г. Косик // Тез. докл. IX Всес. совещ. по изучению, охране и рациональному использованию морских млекопитающих (9-11 сен. 1986 : Архангельск). - Архангельск, 1986. - С. 187-188.
6. Парина, Е. В. Возраст и обмен белков / Е. В. Па-рина. - Харьков : Изд-во Харьковского ун-та, 1967. -204 с.
7. Сапожников, А. Ф. Гематологические, биохимические и патоморфологические изменения при алеутской болезни норок / А. Ф. Сапожников, В. А. Разницина, А. С. Куликова // Вопросы прикладной экологии (природопользования), охотоведения и звероводства : Матер. науч. конф., 27-28 мая 1997 г. [посвящ. 75-летию ВНИ-ИОЗ им. Б.М.Житкова] - Киров, 1997. - С. 322-323.
8. Справочник специалиста ветеринарной лаборатории / Под ред. Ю. П. Смияна. - Киев : Урожай, 1987. -С. 294-295.
9. Bossart, G. D. Clinical pathology / G. D. Bossart, T. H. Reidarson, L. A. Dierauf, D. A. Duffield // Handbook of marine mammal medicine. 2nd Edition. - CRC Press, Boca Raton, Florida, 2001. - P. 383-436.
10. Engelhardt, F. R. Haematology and plasma chemistry of captive pinnipeds and cetaceans / F. R. Engelhardt // Aquat.Mammals. - 1979. - V. 7, N. 1. - P. 11-20.
11. Geraci, J. R. Functional hematology of ringed seals (Phoca hispida) in the Canadian Arctic / J. R. Geraci, T. G. Smith // J. Fish. Res. Board. Can. - 1975. - V. 32, N. 12. - P. 2559-2564.
12. Lastras, M. E. Effects of sarcoptic mange on serum proteins and immunoglobulin G level in chamois (Rupicapra pyrenaica) and Spanish ibex (Capra pyrenaica) / M. E. Lastras, J. Pastor, I. Marco, M. Ruiz, L. Vinas, S. Lavin // Vet. Parasitol. - 2000. - V. 88. - N. 3-4. -P. 313-319.
13. Salatka, K. Rat serum proteins changes with age / K. Salatka, D. Kresge, J. Harris // Exp. Gerontol. - 1971. -V. 6. - P. 25-36.
14. Sepulyeda, M. S. Age-related changes in hematocrit, hemoglobin, and plasma protein in Juan Fernandez fur seals (Arctocephalus philippii) / M. S. Sepulyeda, H. Ochoa-Acuna, B. L. Homer // Mar. Mammal Sci. - 1999. -V. 15, N. 2. - P. 575-581.
