CC BY
12
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2011 УДК 616-092:612.64]-02:615.277.3
О. В. Шредер, Е. Д. Шредер, А. Д. Дурнев, С. Б. Середенин
СОПРЯЖЕННОСТЬ ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ И ТЕРАТОГЕННЫХ ЭФФЕКТОВ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ЦИКЛОФОСФАМИДОМ, И ИХ МОДИФИКАЦИЯ АФОБАЗОЛОМ
НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН, Москва
В тканях эмбрионов и плацентах интактных крыс было выявлено характерное соотношение клеток с различной степенью фрагментации ДНК.
Показано, что генотоксический эффект циклофосфамида сопровождается количественным сдвигом от установленного в контроле соотношения различных категорий клеток.
Выявлена взаимосвязь между нарушением соотношения разных категорий клеток в эмбриональных и плацентарных тканях и появлением морфологических аномалий у эмбрионов.
Установлена способность антимутагена афобазола (1, 10 и 100 мг/кг) снижать генотоксические эффекты в тканях эмбрионов и плаценты и взаимосвязанные с ними аномалии развития.
Высказано предположение о перспективности применения показателя поврежденности ДНК в клетках плацент и тканях эмбрионов как биомаркера течения эмбриогенеза и разработки на этой основе индикаторного теста для экспресс-скрининга потенциальных тератогенов.
Ключевые слова: повреждение ДНК, тератогенез, антимутагены, афобазол, крысы
О. V. Shreder, Е. D. Shreder, A. D. Durnev, S. В. Seredenin. - ASSOCIATION OF GENOTOXIC AND TERATOGENIC EFFECTS INDUCED BY CYCLOPHOSPHAMIDE AND THEIR MODIFICATION WITH AF0BA20LE
Intact rat embryonic and placental tissues were found to have a characteristic ratio of cells with different degrees of DNA fragmentation. The genotoxic effect of cyclophosphamide was shown to be accompanied by a quantitative deviation from the control group established ratio of different cell types. A relationship was found between the abnormal ratio of different cell types in the embryonic and placental tissues and the occurrence of embryonic morphological abnormalities. The antimutagen afobazole (1, 10, and 100 mg/kg) was ascertained to be able to lower genotoxic effects in the embryonic and placental tissues and their related malformations. It is presumed that it is promising to use DNA damage index in the embryonic and placental cells as a biomarker of the course of embryogenesis and as a basis for devising an indicator test for rapid screening of potential teratogens.
Key words: DNA damage, teratogenesis, antimutagens, afobazole, rats
Аномальный морфогенез в период эмбрионального
Шредер О. В. — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. лекарственной токсикологии (olga_shreder@List.ru); Шредер Е. Д. — мл. науч. сотр. лаб. лекарственной токсикологии (shrederkaterina@mail.ru); Дурнев А. Д. — чл,-кор. РАМН, проф., зав. лаб. лекарственной токсикологии и лаб. фармакологии мутагенеза ^итеу@ aport.ru); Середенин С. Б. — акад. РАМН, проф., дир. ин-та (п»р-harm@mail.ru)
развития традиционно связывают с нарушением сопряженных процессов пролиферации, миграции и диффе-ренцировки клеток. В основе нарушений этих процессов могут лежать повреждения ДНК [9]. Однако это предположение нуждается в прямых доказательствах, основанных на выявлении взаимосвязи между количеством клеток с генотоксическими повреждениями и выходом тератогенных поражений у эмбрионов.
Дополнительным инструментом для получения доказательств роли повреждений ДНК в тератогенезе может являться оценка модификации ДНК-повреждаюшего и
Влияние афобазола на тератогенные эффекты циклофосфамида
Таблица 1
Показатель ЦФА 20 мг/кг ЦФА + афобазол 1 мг/кг ЦФА + афобазол 10 мг/кг ЦФА + афобазол 100 мг/кг
Количество исследованных плодов 51 111 158 144
% абс. % абс. % абс. % абс.
Аномалии развития:
Кровоизлияние в мозг 75 38 59 66* 22 35* 10 14*
Менингоэнцефалоцеле 100 51 27 30* 40 63* 18 26*
Краниошизис 100 51 56 62 64 101 48 69
Микроцефалия 57 29 0* 0* 28 44* 0* 0*
Экзофтальм 71 36 5 6* 26 41* 10 15*
Микрогнатия 25 13 6 7* 16 25 1 1*
Гипогнатия 41 21 5 6* 15 24* 6 9*
Протрузия языка 29 15 4 4* 10 16* 13 19*
Микромелия 80 41 0* 0* 9 15* 0* 0*
Эвентерация 27 14 5 5* 16 25 0* 0*
Тератома 88 45 21 23* 34 54* 21 30*
Повреждения передних конечностей (олигодактилия, ахейрия) 31 16 13 14* 3 5* 0* 0*
Повреждения задних конечностей (олигодактилия, аподия) 86 44 71 79* 49 78* 24 34*
Примечание. * — разница по сравнению с тератогенной группой статистически достоверна при р < 0,05.
Таблица 2
Соотношение клеток с различной степенью фрагментации ДНК в эмбриональных тканях и плаценте 5 крыс при физиологически нормальной беременности
Период развития, день Интакткые крысы Количество плацент/эмбрионов Обшее количество исследованных "ДНК-комет" до 10%, % "ДНК-комет" от 10 до 3056, % "ДНК-комет" от 30 до 50%, % "ДНК-комет" более 50%, %
клеток 1-я категория 2-я категория 3-я категория 4-я категория
13-й
13-й
14-й
15-й 15-й
13-й
13-й
14-й
15-й 15-й
Контроль 1 Контроль 2 Контроль 3 Контроль 4 Контроль 5
Контроль 1 Контроль 2 Контроль 3 Контроль 4 Контроль 5
12 20 20 5 5
12 20 20 5 5
Плацента
1103 1042 1332 1116 709
1438 2447 2103 1364 678
Эмбрион
91,12 92.90 90,77 83,18 89,84
90,06 91,50 90,54 90,83 89,69
5,53 3,74 4,65 6,80 2,26
6,88 6,21 7,09 5,21 7,36
0,27 0,38 0,53 0,00 0,56
0,21 0,33 0,19 0,15 0,15
3,08 2,98 4,05 10,02 7,33
2,85 1,96 2,19 3,82 2,80
Примечание. В таблице представлены результаты, полученные в нескольких независимых сериях экспериментов.
тератогенного действия под влиянием антимутагенов [1-3].
Цель настоящей работы — оценка сопряженности ге-нотоксических и тератогенных эффектов в модели тератогенеза, вызванного циклофосфамидом, и их модификации под влиянием анксиолитика афобазола, обладающего антимутагенными свойствами.
денной ДНК проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0.
Для анализа взаимосвязи между уровнем клеток с поврежденной ДНК и выходом аномалий развитая применяли метод линейной регрессионной модели в приложении Excel.
Материалы и методы
В работе использовали беспородных белых крыс массой 200—250 г (питомник РАМН Столбовая). Содержание животных в виварии соответствовало приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. "Об утверждении правил лабораторной практики". День обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках принимали за 1-й день беременности.
Модель химически-индуцированного тератогенеза, с максимальным уровнем тератогенных поражений (100%) без увеличения числа случаев гибели эмбрионов создавали введением известного мутагена и тератогена цикло-фосфамида (20 мг/кг внутрибрюшинно).
Циклофосфамид (ЦФА) per se или в сочетании с афо-базолом (1, 10 и 100 мг/кг перорально) вводили самкам крыс на 14-й день беременности по схеме афобазол + ЦФА.
Самок выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков, вскрывали матку, извлекали эмбрионы и плаценты для оценки целостности ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод "ДНК-комет") (6).
Анализ количественного соотношения клеток с различной степенью фрагментации ДНК проводили в плацентах и тканях эмбрионов интактных крыс на 13, 14 и 15-й дни эмбриогенеза. У опытных животных анализ соотношения клеток выполняли через 20 и 24 ч после введения ЦФА и афобазола, т. е. в сроки, в которые в предварительных экспериментах наблюдали максимальный ДНК-повреждающий эффект в тканях эмбрионов и плацентах соответственно.
При анализе взаимосвязи между поврежденностью ДНК и выходом морфологических аномалий у эмбрионов использовали опубликованные ранее данные, полученные при оценке тератогенеза в этом же исследовании, но опубликованные ранее [3,7]. Они суммарно представлены в табл. 1.
Оценку степени поврежденное™ ДНК, вычисление абсолютных и относительных частот клеток с повреж-
Рис. 1. Распределение частот клеток с разной степенью фрагментации ДНК в плаценте (а) и тканях эмбрионов (б) в контрольной группе. По оси ординат — количество клеток, по оси абсцисс — % фрагментации ДНК.
Рис. 2. Распределение клеток с разной степенью фрагментации ДНК.
Препараты окрашивали красителем SYBR Green 1(1:10 ООО в ТЕ-буфере. "Inviirogcn"). Анализ проводили на эпифлюоресцентном микроскопе Мнкмед-2 12Т ("Ломо"), совмещенном с цифровой камерой высокого разрешения (VEC-335, ЭВС). Ув. 200.
ДНК-фрагментация до 10%
"ДНК-комета" 1,25%
1 -я категория
"ДНК-комета" 5%
"ДНК-комета" 10%
2-я категория
ДНК-фрагментация от 10 до 30 %
"ДНК-комета" 10%
"ДНК-комета" 20%
"ДНК-комета" 30%
3-я категория
ДНК-фрагментация от 30 до 50 %
"ДНК-комета" 30%
"ДНК-комета" 40%
т
"ДНК-комета" 50%
4-я категория
Апоптотические кометы
Результаты и обсуждение
В тканях эмбрионов и плацент контрольных животных были выявлены клетки с различной степенью фрагментации ДНК, которые подразделяли на 4 категории (табл. 2, рис. 1, 2).
В 1-ю категорию включали клетки, у которых регистрируемый показатель поврежденности ДНК — "% ДНК в хвосте" — не превышал 10%, во 2-ю — клетки с показателем 10—30% (умеренно поврежденные клетки), в 3-ю — клетки с показателем 30—50% (клетки с выраженным повреждением ДНК), в 4-ю — клетки с показателем более 50% (апоптотические кометы).
При исследовании генотоксических эффектов ЦФА было обнаружено, что максимальный уровень клеток с поврежденной ДНК наблюдается в плацентах через 20 ч, а в эмбриональных тканях через 24 ч после введения мутагена.
Через 20 ч после введения ЦФА было отмечено уменьшение количества клеток 1-й категории в тканях плацент и эмбрионов до 17,9 и 30,8% соответственно (рис. 3). Одновременно наблюдали увеличение количества клеток 2-й и 3-й категорий, характеризующихся повышенной степенью фрагментации ДНК, и апоптотиче-
ских комет в плаценте (38,9%) и тканях эмбрионов (7,9%).
Через 24 ч после введения ЦФА в тканях плацент и эмбрионов наблюдали повышение клеток 1-й категории, снижение клеток 2-й и 3-й категорий, а также увеличение количества апоптотических комет эмбрионов (рис. 4).
Таким образом, характер распределения клеток в рамках тестируемых категорий при действии ЦФА изменяется по сравнению с контролем. Через 20 ч после введения ЦФА сдвиг в соотношении клеток различных категорий более выражен в плаценте, а через 24 ч — в тканях эмбрионов.
При введении афобазола в плацентах опытных животных на фоне максимального повреждения ДНК, индуцированного ЦФА (20-часовая экспозиция) наблюдали статистически значимое снижение повреждающего эффекта, которое выражалось в увеличении доли клеток 2-й и 3-й категорий, а также в снижении количества апоптотических комет.
Через 24 ч (см. рис. 4) в тканях эмбрионов и плацентах под влиянием афобазола отмечено статистически значимое увеличение доли клеток 1-й категории, сниже-
20 ч экспозиции
ЦФА 20 мг/кг ЦФА + Аф 1 мг/кг ЦФА+АФ 10 мг/кг ЦФА+АФ 100 мг/кг
Контроль
□ 1-я категория (83,2%) Ц 2-я категория (6,8%) ■ 3-я категория (0,0%) Щ 4-я категория (10%)
О 1-я категория (17,9%) §1 2-я категория (18,3%) Щ 3-я категория (25%) ^ 4-я категория (38,9%)
□ 1 -я категория (24,6%) Ц 2-я категория (21,6%) ■ 3-я категория (25%) ^ 4-я категория (28,8%)
ЕЗ 1 -я категория (21,2%) §§ 2-я категория (25,2 %) ■ 3-я категория (32,7%) ^ 4-я категория (20,8%)
03 1-я категория (14%) Ц 2-я категория (35,2%) ■ 3-я категория (36%) ^ 4-я категория (14,8%)
Плацента
Эмбрион
Рис. 3. Соотношение различных категорий клеток в эмбриональных и плацентарных тканях опытных животных при 20-часовой экспозиции. Здесь и на рис. 4: Аф — афобазол.
Контроль ЦФА 20 мг/кг ЦФА + Аф 1 мг/кг ЦФА+Аф 10 мг/кг ЦФА+Аф 100 мг/кг
Э 1 -я категория (90,8%) §§ 2-я категория (5,2%) Щ 3-я категория (0,2%) □ 4-я категория (3,8%)
^ 1-я категория (30,8%) 2-я категория (47,0%) В 3-я категория (14,2%) 4-я категория (7,9%)
ЕЗ 1-я категория (56,3%) ^ 2-я категория (32,6%) ■ 3-я категория (4,2%) п 4-я категория (6,9%)
Э 1-я категория (66,9%) ^ 2-я категория (19,8%) | 3-я категория (3,9%) ^ 4-я категория (9,4%)
В 1-я категория (50,5%) ^ 2-я категория (33,9%) И 3-я категория (8,5%) □ 4-я категория (7,0%)
ние количества клеток 2-й и 3-й категорий и апоптоти-ческих комет.
В целом анализ распределения клеток с ДНК различной степени фрагментации в плацентах и эмбрионах крыс показал, что генотоксический эффект ЦФА сопровождается количественным сдвигом от установленного в контроле соотношения различных категорий клеток. При этом афобазол в диапазоне доз 1 — 100 мг/кг модифицирует генотоксические эффекты ЦФА в плацентах и эмбриональных тканях, что приводит к восстановлению соотношения клеток, характерного для этого периода эмбриогенеза у контрольных животных.
С использованием линейной модели регрессионного анализа была проведена обработка совокупности данных, описывающих генотоксические поражения клеток эмбрионов и плаценты, и результатов, характеризующих тератогенные поражения плодов у тех же животных (см. табл. 1).
Была установлена отчетливая взаимосвязь между повышением уровней клеток с поврежденной ДНК в плаценте и появлением аномалий развития у эмбрионов. Это касается таких аномалий, как краниошизис (г = 0,9), экзофтальм (г =0,9) и олигодактилия передних конечностей (г - 0,9).
Аналогичным образом была выявлена взаимосвязь между увеличением количества клеток с поврежденной ДНК в эмбриональных тканях и появлением протрузии языка (г = 0,9), менингоэнцефалоцеле (г = 0,9), кранио-шизиса (/• = 0,9), экзофтальма (г = 0,9), гипогнатии (г = 0,9), ахейрии (г = 0,9), аподии (г = 0,9) и тератом (г = 0,9) у эмбрионов.
Таким образом, установлена взаимосвязь между нарушением соотношения разных категорий клеток в эмбриональных и плацентарных тканях и появлением морфологических аномалий у эмбрионов.
На основании выявленных взаимосвязей можно утверждать, что увеличение количества клеток 2-й и 3-й категорий в эмбриональных тканях и плаценте можно рассматривать как маркер повышенного риска возникновения тератогенных поражений развивающегося плода.
Повышение количества апоггготических комет в эмбриональных тканях указывает на морфогенетические нарушения, приводящие к формированию аномалий, известных в научной литературе как дефекты "минус ткани" [8].
Связь между поврежденностью ДНК и процессами тератогенеза подтверждается результатами, свидетельствующими о способности антимутагена афобазола снижать обе категории повреждений. Кроме того, полученные данные указывают на то, что выявленный антитератогенный эффект афобазола [3, 7] обусловлен его анти-генотоксической активностью, показанной в ряде исследований [3—5].
Таким образом, в результате исследования установлена взаимосвязь ДНК-повреждающего и тератогенного эффектов ЦФА. При подтверждении подобных эффектов на других экспериментальных моделях тератогенеза возникает перспектива использования показателя повре-жденности ДНК в клетках плацент и тканях эмбрионов как биомаркера течения эмбриогенеза и разработки на
24 ч экспозиции
Контроль ЦФА 20 мг/кг ЦФА + Аф 1 мг/кг
□ 1-я категория (89,8%) О 1-я категория (63,9 %) □ 1-я категория (72,9%) 2-я категория (2,3 %) Ц 2-я категория (11,9 %) §§§ 2-я категория (5,4 %)
ЦФА+Аф 10 мг/кг ЦФА+АФ 100 мг/кг
□ 1-я категория (83,9%) □ 1-я категория (83,1%) 2-я категория (6,1 %) jgj 2-я категория (8,9 %)
3-я категория (0,6 %) ¡¿3 3-я категория (2,7 %) ^ 3-я категория (0,0 %) ^ 3-я категория (0,0 %) 3-я категория (0,3 %) Щ 4-я категория (7,3 %) ^ 4-я категория (21,4%) Ш 4-я категория (21,8 %) Щ 4-я категория (9,9 %) ЙЭ 4-я категория (7,7 %)
Плацента
Контроль
Э 1 -я категория (89,7%) 2-я категория (7,4 %) gg 3-я категория (0,2 %) □ 4-я категория (2,8 %)
2
Эмбрион
ЦФА 20 мг/кг
Э 1 ~я категория (71,9 %) §§ 2-я категория (8,8 %) ^ 3-я категория (2,7 %) □ 4-я категория (16,6 %)
ЦФА + Аф 1 мг/кг
S 1-я категория (77,9%) ^ 2-я категория (10,5%) g 3-я категория (0,3 %) □ 4-я категория (11,2%)
ЦФА+Аф 10 мг/кг
Э 1-я категория (82,9%) 2-я категория (10,5 %) ¡2 3-я категория (0,6 %) □ 4-я категория (6,0 %)
ЦФА+Аф 100 мг/кг
Э 1-я категория (78,9%) ^ 2-я категория (9,6 %) g 3-я категория (0,6 %) □ 4-я категория (10,9 %)
Рис. 4. Соотношение различных категорий клеток в эмбриональных и плацентарных тканях опытных животных при 24-часовой экспозиции.
этой основе индикаторного теста для экспресс-скринин-га потенциальных тератогенов.
Литература
1. Дурнев А. Д., Середенин С. Б. // Мутагены: скрининг и фармакологическая профилактика воздействий. — М., 1998.
2. Дурнев А. Д. // Бюл. экспер. биол. — 2008. — Т. 146, № 9. - С. 281-287.
3. Дурнев А. Д., Жанатаев А. К., Шредер О. В., Середенин С. Б. / / Эксперим. и клин, фармакол. — 2009. — № 1. — С. 46—51.
4. Жанатаев А. К., Дурнев А. Д., Середенин С. Б. // Эксперим. и клин, фармакол. — 2000. — Т. 63, № 2. — С. 57—59.
5. Жанатаев А. К., Дурнев А. Д., Середенин С. Б. // Бюл. экспер. биол. - 2000. - № 11. - С. 539-542.
6. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Метод, рекомендации /Дурнев А. Д., Жанатаев А. К., Анисина Е. А. и др. --М., 20Э6.
7. Шредер О. В., Смольникова H. М., Дурнев А. Д., Середенин С. Б. И Бюл. экспер. биол. - 2008. - № 4. - С. 414-417.
8. Ярилин А. А. П Глаукома. — 2003. — № 2. - С. 46-54.
9. Lynnetie R. F., Judith H. F. // Mutât. Res. - 1997. - Vol. 396. - P. 1-8.
Поступила 25.02.11
О А. М. ДУГАН, Д. Л. ТКАЧЕВА, 2011 УДК 613.2:637.523]:575.224
А. М. Дугой', Д. Л. Ткачева2
КОПЧЕНЫЕ КОЛБАСЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ: ОЦЕНКА СУММАРНОЙ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ
'Национальный технический университет Украины КПИ; гНИИ Национального университета физкультуры и спорта Украины, Киев
Работа посвящена оценке суммарной мутагенной активности образцов неорганической и органической фракций копченых колбас трех технологий производства (варено-копченых, полукопченых и сырокопченых) и некоторых пищевых добавок, используемых в производстве перечисленных колбас. Мутагенные эффекты регистрировали на уровне слабой и средней силы в бактериальной тест-системе Salmonella typhimurium с системой метаболической активации. Физико-химический анализ фракций копченых колбас показал существенное загрязнение исследуемых образцов тяжелыми металлами и представителями полициклических ароматических углеводородов, что частично обусловливает наблюдаемые мутагенные эффекты.
Ключевые слова: копченые колбасы, пищевые добавки, мутагенный эффект, тяжелые металлы, бенз(а)пирен
