CC BY
4УДК 577.214.3: 616-07: 616.649
СОПОСТАВЛЕНИЕ ВОСТРЕБОВАННОСТИ И ИНФОРМАТИВНОСТИ ПЦР ПРИ ДИАГНОСТИКЕ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
2Горелова Е.В. (врач-бактериолог),
^омакова Т.В. (врач-бактериолог),
Щеглов B.C. (врач-бактериолог),
2Бойцов А.Г. (профессор)*
'Закрытое Акционерное Общество «Ситилаб»; 2кафедра медицинской микробиологии ГБОУ ВПО Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2011
В настоящее время отсутствует общепризнанный алгоритм применения ПЦР при диагностике урогенитальных инфекций и интерпретации полученных результатов. В то же время применение этого метода для диагностики заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, например Candida albicans, Mycoplasma hominis, Ureaplasma parvum, может вести к необоснованному назначению антибактериальной терапии.
Ключевые слова: Candida, микоплазмы, ПЦР, уреаплазмы, урогенитальные инфекции, хламидии
COMPARISON OF RELEVANT AND INFORMATIVE PCR IN DIAGNOSE OF UROGENITAL INFECTIONS OF DIFFERENT ETIOLOGY
2Gorelova E.V. (bacteriologist),
Gornakova T.V. (bacteriologist),
Zheglov V.S. (bacteriologist), 2Boitsov A.G. (professor)
'Closed Joint-stock Company «Citylab»; 2chair of Medical Microbiology of North-Western State Medical University named after 1.1. Mechnikov, StPetersburg, Russia
© Collective of authors, 2011
The present day there is no universally accepted algorithm for the application of PCR for the diagnostics of urogenital infections and interpretation of results. At the same time, the application of PCR for diagnostics of infection by opportunistic such pathogens as C. albicans, M. hominis, U. parvum can make the antibiotic therapy to be unnecessary.
Key words: Candida, chlamydia, mycoplasmosis, PCR,
ureaplasmosis, urogenital infections
* Контактное лицо: Бойцов Алексей Геннадьевич
Тел.: (812) 543-16-20
ВВЕДЕНИЕ
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в настоящее время является наиболее широко рекламируемым методом диагностики заболеваний, передающихся половым путем, в том числе - так называемых «скрытых инфекций» [1]. Несмотря на неоспоримые достоинства этого метода, возникает вопрос о соответствии его востребованности и диагностической эффективности в зависимости от предполагаемой этиологии патологического процесса. Наиболее часто используют «качественный» вариант постановки ПЦР, не позволяющий определить численность микроорганизмов в исследуемом материале. ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR), позволяющая определить концентрацию инфекционного агента, применяют значительно реже из-за более высокой стоимости исследования. Кроме того, существуют определенные трудности, даже при сопоставлении результатов научных исследований, выполненных с использованием этого метода [2]. В связи с этим возникает вопрос о степени информированности лечащих врачей о диагностической ценности результатов ПЦР при диагностике инфекций, передающихся половым путем (ИППП).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проанализировали результаты 58136 исследований, выполненных в Санкт-Петербургском отделении ассоциации лабораторий «Ситилаб» в течение года с помощью ПЦР. При этом диагностировали 7 бактериальных инфекций, вызываемых Chlamidia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma geni-talium, Ureaplasma urealiticum, Ureaplasma parvum, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis. Для диагностики уреаплазмоза, по выбору лечащего врача, использовали праймеры отдельно к U urealiticum и U parvum и универсальный праймер к Ureaplasma spp. Отметим, что некоторые врачи, по-видимому, недостаточно информированы относительно целесообразности видовой дифференциации уреаплазм или их суммарного определения в тех или иных случаях. В связи с этим неоднократно зарегистрированы одновременно назначаемые исследования на Ureaplasma spp., U urealiticum и U parvum. Такие случаи расценивали как очевидную ошибку и результаты исследования с праймерами на Ureaplasma spp. из дальнейшей разработки исключали.
С помощью ПЦР также выявляли 1 протозойную (Trichomonas vaginalis), 1 грибковую (Candida albicans) и 3 вирусных инфекции (папилломавирус-ную, герпетическую и цитомегаловирусную). При диагностике герпетической инфекции, по назначению лечащего врача, определяли либо без дифференциации вирусы герпеса 1 и 2 типов, либо только вирусы герпеса второго типа. При диагностике папиллома-вирусной инфекции, в зависимости от назначения врача, выявляли вирусы высокого канцерогенного риска: 16, 31, 33, 35; 18, 39, 45, 59 и 52, 56, 58, 66 или
16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67 типов.
В большинстве случаев лечащий врач назначал исследования на 3 и более инфекции.
При диагностике всех инфекций, кроме вызываемых вирусами папилломы человека, использовали амплификатор «Rotor-Gene 3000» («Corbett Research», Австралия) с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». При этом «количественный» вариант постановки реакции не применяли. Вирусы папиллом человека выявляли с помощью амплификатора «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) с электрофоретическим определением продуктов амплификации в агарозном геле. Использовали комплекты реагентов для выделения, амплификации и детекции в агарозном геле производства ЦНИИ эпидемиологии Федеральной службы Роспотребнадзора (Россия). Аналитическая чувствительность использованных наборов, по данным производителя, составляла от 5-102 до 2-103 ГЭ/мл (ГЭ - количество геномных эквивалентов микроорганизма в 1 мл образца клинического материала, помещенного в указанную транспортную среду).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При обследовании мужчинам чаще всего назначали исследования на С. trachomatis, М. hominis и Ureaplasma spp. (соответственно, 3208, 2098, 3046 исследований), реже - на N. gonorrhoeae и С. albicans (соответственно, 907 и 870 исследований) и вирусы.
Женщин чаще всего обследовали на С. trachomatis, Ureaplasma spp., М. genitalium (7866, 6533 и 4786 исследований соответственно), реже - на С. albicans и N. gonorrhoeae (474 и 418 исследований соответственно). Исследования в ПЦР на возбудителей вирусных инфекций в 2,7 раза чаще назначали женщинам, чем мужчинам, при этом лидирующее положение занимали папилломавирусы.
Из 44128 исследованных с помощью ПЦР образцов положительный результат был получен в 7666 случаях (13,2%). И у мужчин, и у женщин чаще всего
Частота находок возбудителей урогенитальных
обнаруживали уреаплазмы, гарднереллы и папилломавирусы, на которые пришлось 64,58% от общего числа положительных результатов (табл.).
У мужчин из патогенных и условно-патогенных возбудителей чаще всего выявляли уреаплазмы: Ureaplasma spp. (без дифференциации видов) - в 24,66±2,38% случаев, U. urealiticum - в 20,5± 1,94%, U. parvum - в 3,75±0,92%. Уреаплазмы занимали доминирующие позиции и у женщин: Ureaplasma spp. (без дифференциации видов) - в 42,66±2,78% случаев, U. urealiticum - в 1,92±0,38%, U. parvum - в 46±1,38%. Подчеркнем, что если доминирование уреаплазм у мужчин было связано с высокой частотой находок U. urealiticum, то у женщин наоборот, превалировали U. parvum.
Исследования на G. vaginalis, которые занимали второе место по выявляемое™, врачи назначали чаще женщинам, чем мужчинам - 2033 и 1567 соответственно. При этом и положительных находок было значительно больше у женщин - 40,09±2,18% против 19,02±1,98% случаев - у мужчин.
У женщин G. vaginalis в 25,74 ±2,26% случаев обнаруживали в сочетании с U. parvum, в 10,26± 1,60% -с М. hominis и в 8,96±3,02% - с С. albicans. У мужчин G. vaginalis чаще выявляли в ассоциации с уре-аплазмами: U. urealyticum - в 8,05±1,66% случаев и U. parvum - в 1,76 ±0,8%, реже - с М. hominis (4,52±1,8%).
Папилломавирусы заняли 3 место среди возбудителей ЗППП, выявленных с помощью ПЦР: 23,01±3,96% случаев - у мужчин и 27,75±1,56% - у женщин. Чаще всего пациентам назначали исследование на папилломавирусы типов 6, 11, 16, 18, 31, 33, на другие типы вирусов - значительно реже и, как правило, только женщинам.
ПЦР с целью обнаружения С. albicans врачи выбирали относительно редко: было обследовано 890 мужчин и 474 женщины. Частота находок указанных микроорганизмов у женщин была значительно выше, чем у мужчин: 20,04±3,68% и 4,72±1,42% соответ-
Таблица
инфекций у мужчин и женщин с помощью ПЦР
Обнаружены Мужчины Женщины
Число обследован- ных Втом числе с положительным результатом Число обследованных В том числе с положительным результатом
Абс. % НВИ* 95 Абс. % НВИ*95
С.trachomatis 3208 203 6,3 5,5-7,2 7868 370 4,7 4,2-5,2
M.hominis 2098 147 7,0 5,9-8,1 4694 545 11,6 10,7-12,6
M.qenitalium 1919 41 2,1 1,5-2,8 4786 88 1,8 1,5 -2,2
Ureaplasma spp. 1314 324 24,7 22,3-27,0 1261 538 42,7 39,9 -45,4
LI.urealiticum 1732 355 20,5 18,6-22,4 5272 101 1,9 1,5-2,3
U. parvum 1732 65 3,8 2,8-4,7 5272 2425 46,0 44,6-47,4
N. qonorrhoeae 907 14 1,5 0,7-2,4 418 3 0,7 0-1,5
G.vaqinalis 1567 298 19,0 17,0-21,1 2033 815 40,1 37,9-42,3
C. albicans 890 42 4,7 3,3-6,1 474 95 20,0 16,4-23,7
T.vaqinalis 2031 15 0,7 0,4-1,1 2136 21 0,9 0,6-1,4
Папиломавирусы 452 104 23,0 19,1-26,9 3279 910 27,8 26,2-29,3
Вирусы простого герпеса 1-2 347 19 5,5 3,0-7,9 717 28 3,9 2,5-5,4
Вирусы герпеса 2 138 6 4,4 1,8-6,9 651 29 4,5 2,8-6,1
Цитамегаловирусы 254 11 4,3 1,8-6,9 686 54 7,8 5,8-9,9
*НВИ 95 - наиболее вероятный интервал при Р=95%
ственно.
У женщин С. albicans чаще всего обнаруживали в ассоциации с Т. vaginalis (13,56±4,46%) и Ureaplasma spp. (12,41±8,66%), чуть реже - с U. parvum (10,53±3,42%).
У мужчин первое место по частоте совместных находок занимали Ureaplasma spp. (3,64±1,78%), второе - G. vaginalis (1,34±0,88%), третье - Т. vaginalis (1,13±0,74%).
По частоте назначений при обследовании на возбудителей урогенитальных инфекций методом ПЦР М. hominis была на третьем место у мужчин и на четвертом - у женщин (2098 и 4694 соответственно), а по частоте выявления - на последнем среди условно-патогенных микроорганизмов. М. hominis чаще выявляли у женщин (11,61±0,94%), чем у мужчин (7,01± 1,12%).
М. hominis у женщин чаще обнаруживали в сочетании с G. vaginalis (10,26% случаев), реже - с U parvum (8,49%) и Ureaplasma spp. (7,69%).
У мужчин М. hominis наиболее часто выявляли в ассоциации с Ureaplasma spp. (5,79±1,48%), на втором месте была G. vaginalis (4,52±1,24%), на третьем - U urealyticum (3,52±1,04%).
Распределение мест среди назначений исследований на обнаружение истинных патогенов у мужчин выглядит следующим образом: С. trachomatis, Т. vaginalis, М. genitalium и N. gonorrhoeae (3208, 2031, 1919 и 907 соответственно). При этом по частоте находок С. trachomatis (6,33±0,86%) также занимает первое место, затем идут М. genitalium (2,14±0,66%), N. gonorrhoeae (1,54%) и Т. vaginalis (0,74%).
У женщин частота назначений исследований на обнаружение истинных патогенов и частота находок этих возбудителей фактически повторяли друг друга: С. trachomatis (7868 и 4,70%), М. genitalium (4786 и 1,84%), Т. vaginalis (2136 и 0,98%) и N. gonorrhoeae (418 и 0,72%).
ПЦР чаще всего используют лечащие врачи с целью диагностики хламидиоза. В нашем случае постановка ПЦР с целью выявления С. trachomatis составила 19,05±0,32% случаев от общего числа анализов, выполненных с помощью данного метода. У мужчин С. trachomatis чаще других обнаруживали в сочетании с Ureaplasma spp. (2,83% случаев), реже - с U. urealyticum (2,44%) и G. vaginalis (1,58%). У женщин С. trachomatis наиболее часто выявляли в ассоциации с G. vaginalis (5,41%), а также с U. parvum (2,90%) и с Ureaplasma spp. (1,76%).
Среди патогенов М. genitalium занимает второе
место по назначениям при обследовании у женщин и третье место - у мужчин (4786 и 1919 соответственно). При анализе всех назначений показано, что М. genitalium входит в первую четверку как у женщин, так и у мужчин.
М. genitalium чаще выявляли у мужчин (2,14±0,66%), чем у женщин (1,84±0,38%). Обращает на себя внимание тот факт, что этот возбудитель находится на втором месте по частоте выявления среди истинных патогенов, вызывающих ИППП вне зависимости от пола обследуемого.
Первое место по частоте совместных находок с М. genitalium у мужчин занимали Ureaplasma spp., второе — U. urealyticum, третье - М. hominis (1,02 ±0,64, 0,40±0,36 и 0,34±0,34% соответственно), у женщин их чаще обнаруживали в ассоциации с U. parvum (1,39±0,38%), С. albicans (1,12± 1,12%) и Ureaplasma spp. (0,82±0,62%).
Частота выявления нейссерий, трихомонад, вирусов герпеса, цитомегаловирусов была столь низка, что сопоставление ее с другими возбудителями ИППП дало бы заведомо не достоверные результаты, поэтому это исследование не проводили.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, из общего числа врачебных назначений только 40,0±0,4% были направлены на выявление истинных патогенов бактериальной и про-тозойной природы, сам факт обнаружения которых поддается однозначной оценке. В остальных случаях для клинической трактовки была необходима дополнительная информация, чаще всего о количестве предполагаемого патогена в исследуемом материале. Особое беспокойство вызывает применение ПЦР для диагностики кандидоза. Во-первых, Candida spp. присутствуют в составе нормобиоты влагалища более чем у 10% здоровых женщин, и о микотическом вагините можно говорить только при их обнаружении в количестве более 104 КОЕ/г [3]. Во-вторых, С. albicans является ведущим, но далеко не единственным, возбудителем микотической патологии влагалища [4]. При этом препараты, эффективные для элиминации С. albicans, могут оказаться бесполезными при лечении кандидозов, обусловленных С. glabrata и С. krusei. В связи с вышеизложенным, следует усомниться в обоснованности широкомасштабного применения ПЦР при урогенитальных инфекциях, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дмитриев Г.А. Стратегия лабораторной диагностики ИППП // Генодиагностика инфекционных болезней. - М.: Медицина для всех, 2004. - Т. 1. - С. 28-29.
2. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., etal. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative RealTime PCR Experiments //Clin. Chemistry. - 2009. - Vol.55. - P. 611-622.
3. Мороз А.Ф., Снегирёва A.E. Методические рекомендации. Грибы рода Candida (Методы выделения, идентификации на видовом уровне и определение чувствительности к противогрибковым препаратам. - М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, 2009. - 56 с.
4. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. - М., Триада-Х, 2001. - 472 с.
Поступила в редакцию журнала 07.12.2011 Рецензент: А.К. Мирзабалаева
