CC BY
62
Инфекция и иммунитет 2011, Т. 1, № 2, с. 167-170
Оригинальные статьи
К ВОПРОСУ О РОЛИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В КОМПЛЕКСНОЙ ДИАГНОСТИКЕ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Е.В. Горелова1, А.Г. Бойцов2, Т.В. Домакова1, В.С. Щеглов1
1 Закрытое Акционерное Общество «Ситилаб», Санкт-Петербург
2ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова», Санкт-Петербург
Резюме. В настоящее время отсутствует общепризнанный алгоритм применения ПЦР при диагностике урогенитальных инфекций и интерпретации полученных результатов. В то же время применение этого метода для диагностики заболеваний обусловленных условно патогенными микроорганизмами, например M. hominis, U. parvum, может вести к необоснованному назначению антибактериальной терапии.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, урогенитальная инфекция.
ROLE OF POLYMERASE CHAIN REACTION IN THE COMPLEX DIAGNOSTICS OF UROGENITAL INFECTIONS
Gorelova E.V., Boitsov A.G., Domakova T.V., Sheglov V.S.
Abstract. The present day there is no universally accepted algorithm for the application of PCR for the diagnostics of urogenital infections and interpretation of results. At the same time, the application of PCR for diagnostics of infection by opportunistic such pathogens as M. hominis, U. parvum can make the antibiotictherapy to be unnecessary. (Infekc. immun., 2011, vol. 1, N 2, p. 167—170)
Key words: polymerase chain reaction, urogenital infection.
Введение
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) на сегодняшний день является наиболее универсальным методом выявления патогенных и условно патогенных микроорганизмов при воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях органов мочеполовой системы. Согласно МКБ-10 к «истинным» инфекциям, передающимся половым путем (ИППП), относят следующие инфекции: гонококковую, хламидийную, трихомонадную, лимфогра-нулему, шанкроид, паховую гранулему, сифилис. Однако причиной воспалительных заболеваний мочеполовой сферы могут быть многочисленные условно патогенные микроорганизмы, вызывающие микоплазмоз, уреаплазмоз, бактериальный вагиноз, кандидоз, генитальный герпес, папилло-мавирусную инфекцию и др. Клиническая дифференциация этих воспалительных заболеваний
различной этиологии без лабораторного пособия в большинстве случаев невозможна. К сожалению унифицированной схемы обследования пациентов с подозрением на воспалительные заболевания урогенитального тракта в России нет. Очевидно, что ее разработке должен предшествовать анализ частоты находок отдельных возбудителей с помощью тех или иных методов в условиях практических лабораторий.
Материалы и методы
В работе использованы данные полученные в лаборатории ЗАО «Ситилаб» на протяжении 2009 г. Лаборатория ЗАО «Ситилаб» в Санкт-Петербурге обслуживает лечебные учреждения Санкт-Петербурга, Пскова и Великого Новгорода, силами которых осуществлялись взятие и доставка материала. Круг определяемых с помощью
поступила в редакцию 09.03.2011 Адрес для переписки:
принята к печати 14.03.2011 Бойцов Алексей Геннадьевич, 195067, Санкт-Петербург,
д.м.н., профессор, зав. кафедрой Пискаревский пр., 47,
микробиологии, вирусологии ГОУ ВПО «СПбГМА им. И.И. Мечникова»
и иммунологии ГОУ ВПО «СПбГМА Тел.: (812) 543-16-20.
им. И.И. Мечникова» Факс: (812) 543-01-95.
© Горелова Е.В. и соавт., 2011 E-mail: [email protected]
ПЦР возбудителей выбранных в качестве предмета для анализа включал: Chlamidia trachomatis, Mycoplasma hominis Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma spp. (Ureaplasma urea-lyticum, Ureaplasma parvum совместно или раздельно), Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Candida albicans, папилломавирусы, вирусы герпеса 1 и 2 типов, цитомегаловирусы.
При диагностике всех инфекций, кроме вызываемых вирусами папилломы человека, использовался амплификатор «Rotor-Gene 3000» («Corbett Research», Австралия) с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». Для выявления вирусов папиллом человека использовался амплификатор «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) с электрофоретиче-ской детекцией продуктов амплификации в ага-розном геле. Использовались комплекты реагентов для выделения, амплификации и детекции в агарозном геле производства ЦНИИ эпидемиологии Федеральной службы Роспотребнадзора (Россия). С целью диагностики уреаплазмозов по назначению лечащего врача использовали прай-меры для выявления ДНК Ureaplasma spp. или U. urealiticum и U. parvum. Для индикации вирусов папиллом человека использовали «Набор реагентов для выявления и дифференциации ДНК вирусов папиллом человека высокого канцерогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 56, 58, 66 типов». Всего проанализированы результаты 58 136 постановок ПЦР с целью диагностики различных видов урогенитальных инфекций.
Для культурального выявления микоплазм и уреаплазм применяли тест-систему «Mycoplasma IST-2» (bioMerieux, Франция) согласно
инструкции производителя. Культуральный метод выявления хламидий осуществляли согласно [4] с индикацией хламидий с помощью ПИФ и заменой циклогексимида при сенсибилизации клетки преднизолоном. Для выявления трихо-монад использовалась тест-система «Вагикульт» (Орион Диагностика, Финляндия).
Результаты
При обследованиимужчинврачамичаще всего назначались исследования на C. trachomatis, M. hominis и Ureaplasma spp. (3208, 3046 и 2098 исследований соответственно), а реже всего — на N. gonorrhoeae и C. albicans (907 и 870 исследований соответственно) и вирусы (табл. 1).
Женщин чаще всего обследовали на C. trachomatis, Ureaplasma spp, M. genitalium (7866, 6533 и 4786 исследований соответственно), реже всего — на C. albicans и N. gonorrhoeae (474 и 418 исследований соответственно).
Исследования в ПЦР на возбудители вирусных инфекций в 2,7 раза чаще назначали женщинам, чем мужчинам, при этом лидирующее положение занимали папилломавирусы.
У мужчин из патогенных и условно патогенных возбудителей чаще всего выявляли уреа-плазмы: Ureaplasma spp. (без дифференциации видов) — в (24,66±2,38)% случаев, U. urealiticum — в (20,5±1,94)%, U parvum — в (3,75±0,92)%. Уреа-плазмы занимали доминирующие позиции и у женщин: Ureaplasma spp. (без дифференциации видов) — в (42,66±2,78)% случаев, U. urealiticum — в (1,92±0,38)%, U. parvum — в (46±1,38)%. На 3-м месте по частоте находок, как у мужчин, так и у женщин, находились G. vaginalis [(19,02±1,98)%
ТАБЛИЦА 1. ЧАСТОТА НАХОДОК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ У МУЖЧИН И ЖЕНЩИН С ПОМОЩЬЮ ПЦР
Обнаружены Мужчины Женщины
Число обследованных В том числе с положительным результатом Число обследованных В том числе с положительным результатом
абс. % НВИ 95* абс. % НВИ 95
C. trachomatis 3208 203 6,33 5,47-7,19 7868 370 4,70 4,22-5,18
M. hominis 2098 147 7,01 5,89-8,13 4694 545 11,61 10,67-12,55
M. genitalium 1919 41 2,14 1,48-2,8 4786 88 1,84 1,46-2,22
Ureaplasma spp. 1314 324 24,66 22,28-27,04 1261 538 42,66 39,88-45,44
U. urealiticum 1732 355 20,50 18,56-22,44 5272 101 1,92 1,54-2,3
U. parvum 1732 65 3,75 2,83-4,67 5272 2425 46,00 44,62-47,38
N. gonorrhoeae 907 14 1,54 0,72-2,36 418 3 0,72 0-1,54
G. vaginalis 1567 298 19,02 17,04-21 2033 815 40,09 37,91-42,27
C. albicans 890 42 4,72 3,3-6,14 474 95 20,04 16,36-23,72
T. vaginalis 2031 15 0,74 0,36-1,12 2136 21 0,98 0,56-1,4
Папилломавирусы 452 104 23,01 19,05-26,97 3279 910 27,75 26,19-29,31
Вирусы простого герпеса 1-2 347 19 5,48 3,04-7,92 717 28 3,91 2,47-5,35
Вирусы герпеса 2 138 6 4,35 1,77-6,89 651 29 4,45 2,83-6,07
Цитомегаловирусы 254 11 4,33 1,77-6,89 686 54 7.87 5,81-9,93
Примечание: * наиболее вероятный интервал при Р = 95%.
2011, Т. 1, № 2
ПЦР в диагностике урогенитальных инфекций
и (40,09±2,18)% соответственно]. Обращает на себя внимание тот факт, что C. trachomatis, исследования с целью выявления которых назначались лечащими врачами чаще всего, выявлялись как у мужчин, так и у женщин относительно редко. Реже их, вне зависимости от пола, обнаруживались только три микроорганизма: M. genitalium, T. vaginalis, N. gonorrhoeae (табл. 1).
У значительной части обследованных одновременно выделялись 2 и более микроорганизма, способных вызвать воспалительные заболевания урогенитального тракта. Наиболее часто в состав микробной ассоциации входили уреаплазмы. Так выявление недифференцированных Ureaplasma spp. чаще всего сочеталось и у мужчин, и у женщин с обнаружением G. vaginalis (в (31,5±3,92)% и (23,79±4,1)% случаев соответственно). Одновременное присутствие U. urealiticum и U.parvum зарегистрировано у мужчин в (0,87±0,44)%, а у женщин — в (1,16±0,3)% случаев.
Нами была сопоставлена эффективность применения ПЦР и культуральных методов при диагностике хламидиоза, трихомониаза, уреа-плазмоза и микоплазмоза.
Культуральный метод обнаружения хламидий был использован по назначению лечащего врача при обследовании 408 человек. Если в ПЦР, вне зависимости от пола, частота обнаружения хламидий составила (5,17±0,42)%, то для культрального метода этот показатель был равен (9,38±3,02)%. Сто два пациента на протяжении 1 месяца были обследованы двумя методами. При этом хламидии не были обнаружены ни одним из них в 87 случаях, двумя методами были обнаружены в 13, в 2 случаях возбудитель был обнаружен только с помощью ПЦР. Заболеваемость хламидиозом в Санкт-Петербурге в 2005 и 2006 гг. составляла соответственно 174,5 и 161,7 случаев на 100 000 населения [2].
Культуральный метод индикации трихомо-над был использован по назначению лечащих врачей 438 раз. При этом положительный результат был получен только однократно (0,23±0,46)%. В ПЦР из 4167 исследований положительными были 36 (0,86±0,28)%. Отметим, что заболеваемость трихомониазом в Санкт-Петербурге составляла 263,6 на 100 000 населения [1].
Уреаплазмы без учета пола и вида праймеров (с дифференциацией или без дифференциации видов) с помощью ПЦР были обнаружены в (38,96±1)% случаев. С помощью системы «Mycoplasma IST-2» при обследовании 1621 человека уреаплазмы обнаруживались существенно реже — в (28,38±2,24), что не удивительно, учитывая более высокую чувствительность методов генодиагностики и их меньшую зависимость от условий транспортировки исследуемого материала. При этом примерно в 73 случаев (123 из 460) титр уреаплазм по результатам культураль-ного исследования был меньше диагностически значимого — 104 КОЕ/мл (табл. 2).
M. hominis с помощью ПЦР были обнаружены у (10,19±0,74)% мужчин и женщин. Культураль-ное исследование позволило выявить микоплаз-мы этого вида у (5,8±1,16)% обследованных. Более чем в половине случаев титр искомых микроорганизмов был меньше диагностического (табл. 3).
Обсуждение
В России в настоящее время отсутствует стандартная схема обследования больных с воспалительными заболеваниями урогенитальной сферы. Выбор методов исследования и круг выявляемых микроорганизмов, потенциально причастных к патологическому процессу, определяется лечащим врачом исходя из личных, часто субъективных, представлений об этиологической значимости отдельных инфекционных агентов,
ТАБЛИЦА 2. ЧАСТОТА ОБНАРУЖЕНИЯ УРЕАПЛАЗМ КУЛЬТУРАЛЬНЫМ МЕТОДОМ С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ «MYCOPLASMA IST-2» (bioMERIEUX, ФРАНЦИЯ) ПРИ ОБСЛЕДОВАНИИ 549 МУЖЧИН И 1072 ЖЕНЩИН
Уреаплазмы обнаружены Мужчины Женщины Всего
Число случаев Частота обнаружения в % Число случаев Частота обнаружения в % Число случаев Частота обнаружения в %
В титре<104 29 5,28±1,92 94 8,77±1,72 123 7,59±1,32
В титре>104 70 12,75±2,84 267 24,91±2,64 337 20,79±2,02
Всего 99 18,03±3,28 361 33,68±2,88 460 28,38±2,24
ТАБЛИЦА 3. ЧАСТОТА ОБНАРУЖЕНИЯ M. HOMINIS КУЛЬТУРАЛЬНЫМ МЕТОДОМ С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ «MYCOPLASMA IST-2» (bioMERIEUX, ФРАНЦИЯ) ПРИ ОБСЛЕДОВАНИИ 549 МУЖЧИН И 1072 ЖЕНЩИН
M. hominis обнаружены Мужчины Женщины Всего
Число случаев Частота обнаружения в % Число случаев Частота обнаружения в % Число случаев Частота обнаружения в %
В титре<104 6 1,09±0,88 53 4,94±1,32 59 3,64±0,94
В титре>104 0 0±1,44 35 3,26±1,08 35 2,16±0,72
Всего 6 1,09±0,88 88 8,21±1,68 94 5,8±1,16
а так же, учитывая, что исследования чаще всего платные, — финансовых возможностей пациента. Наиболее часто при обследовании больных данного профиля в нашей стране используется ПЦР.
Ценность ПЦР при диагностике вирусных инфекций несомненна, метод широко используется практикующими врачами для выявления в первую очередь папилломавирусной инфекции. В то же время настораживает практически равная частота запросов на выявление вирусов герпеса первого и второго типов и только второго типа (соответственно (1,83±0,12)% и (1,36±0,1)% от общего числа исследований в ПЦР). Это может указывать на то, что не все практикующие врачи осознают этиологическую значимость вирусов первого типа при поражении гениталий.
ПЦР чаще всего используется лечащими врачами с целью диагностики хламидиоза. В нашем случае постановка ПЦР с целью выявления C. trachomatis составила (19,05±0,32)% случаев от общего числа анализов, выполненных с помощью данного метода. На основании проанализированных в настоящей статье данных следует признать, что применение культурального метода для диагностики хламидийной инфекции в большинстве случаев не оправдано.
Исследования на трихомониаз составили (7,17±0,22)% от общего числа случаев использования ПЦР. При этом частота находок трихомо-над методом генодиагностики оказалась почти в 4 раза выше, чем при применении культураль-ного метода. По нашему мнению вопрос о выборе оптимального метода для диагностики данного заболевания нуждается в дальнейшем уточнении, так как эффективность культураль-ного метода во многом определяется способом взятия и транспортировки материала.
Из числа микоплазм, встречающихся в мочеполовых путях, патогенными считают только M. genitalium [6]. Тем не менее, лечащие врачи чаще назначали исследование в ПЦР на M. hominis и Ureaplasma spp. При этом, с одной стороны, M. genitalium в условиях практического здравоохранения могут быть выявлены только в ПЦР, а с другой — сам по себе факт обнаружения M. hominis и Ureaplasma spp, как правило, не имеет диагностического значения, так как их этиологическую роль можно с той или иной долей вероятности оценить только по результатам количественных исследований [3, 5]. Несмотря на то, что имеются отдельные указания на большую вирулентность U. urealiticum по сравнению с U. parvum, оба вида расцениваются как условно патогенные микроорганизмы, сам факт обнаружения которых не является однозначным показанием к антибиотикотерапии. В связи с этим возникают определенные сомнения в целесообразности их раздельного определения в ПЦР, что влечет за собой удорожание исследования.
Также сомнительна и целесообразность применения неколичественных вариантов ПЦР для ин-
дикации других условно патогенных микроорганизмов. Тем не менее, несмотря на неодозначность трактовки результата, практические врачи назначали исследование в ПЦР на G. vaginalis и C. albicans даже чаще, чем для выявления безусловного патогена N. gonorrhoeae (соответственно (6,19±0,2)%, (2,35±0,12)% и (2,28±0,12)% от общего числа исследований, выполненных с помощью ПЦР). Следует отметить, что в случае C. albicans не однозначен как положительный, так и отрицательный результат, так как этот микроорганизм не является единственно возможным этиологическим агентом при кандидозе половых органов. Его причиной могут быть также Candida glabrata, Candida krusei и другие представители рода Candida.
Заключение
Среди практических врачей ПЦР остается одним из наиболее популярных методов этиологической диагностики воспалительных заболеваний женской половой сферы. При этом метод используется для выявления как облигатно-патогенных, так и условно патогенных микроорганизмов. Если результаты ПЦР при индикации вирусов, хламидий, трихомонад, N. gonorrhoeae, M. genitalium достаточно однозначны, то в случае исследований на M. hominis, Ureaplasma spp., G. vaginalis, C. albicans использование только качественного варианта реакции может повлечь за собой диагностическую ошибку.
Список литературы
1. Ермоленко Д.К., Исаков В.А., Рыбалкин С.Б., Смирнова Т.С., Захаркив Ю.Ф. Урогенитальный трихомониаз: Пособие для врачей. — СПб.— Великий Новгород, 2007. — 96 с.
2. Исаков В.А., Куляшова Л.Б., Березина Л.А., Ну-ралова И.В., Гончаров С.Б., Ермоленко Д.К. Патогенез, диагностика и терапия урогенитального хламидиоза: Рук. для врачей / Под ред. А. Б. Жеб-руна. — СПб., 2010. — 112 с.
3. Кисина В.И., Прилепская В.Н., Соколовский Е.В., Савичева А.М., Забиров К.И., Гущин А.Е., Гом-берг М.А. Дискутабельные вопросы клинического значения генитальных микоплазм // Клин. дерматол. и венерол. — 2007. — № 1. — С. 71—77.
4. Кудрявцева Л.В., Мисюрина О.Ю., Генерозов Э.В., Говорун В.М., Бурова А.А., Маликов В.Е., Липо-ва Е.В., Баткаев Э.А. Клиника, диагностика и лечение хламидийной инфекции: Пособие для врачей. — М.: РМАПО, 2001. — 61 с.
5. Савичева А.М., Шипицына Е.В., Башмакова М.А. Генитальные микоплазмы — проблемы диагностики и лечения // Клин. дерматол. и венерол. — 2008. — № 6. — С. 80-90.
6. Castellano-Gonzalez M., Ginestre-Perez M., Pero-zo-Mena A., Alana F., Fernandez-Bravo M., Rincon-Villalobos G. Vaginal colonization by genital mycoplasmas in pregnant and non-pregnant women // Invest. Clin. — 2007. — Vol. 48, № 4. — P. 419-429.
