CC BY
385
© Н. Н. Силина1, О. Г. Головина1, О. А. Смирнова1, А. Е. Николаева2, Л. П. Папаян1
1 ФГУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России», Санкт-Петербург
2 СПб ГУЗ «Женская консультация № 22», Санкт-Петербург
СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ D-ДИМЕРА РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ У ЖЕНЩИН С НОРМАЛЬНО ПРОТЕКАЮЩЕЙ БЕРЕМЕННОСТЬЮ
УДК: 618.2-07
■ D-димер является важным показателем степени активации гемостаза, значительно увеличивающимся в течение физиологической беременности. Уровень D-димера определяли четырьмя различными методами у 90 здоровых беременных женщин в возрасте от 19 до 40 лет. D-димер рекомендуется оценивать наиболее информативным количественным иммуноферментным анализом, адекватно оценивающим содержание D-димера в плазме крови в каждом триместре беременности.
■ Ключевые слова: беременность; D-димер; методы определения уровня D-димера.
Введение
Физиологическая беременность протекает с выраженными изменениями функционального состояния системы свертывания крови. Это связано как с самим процессом гестации, который обеспечивается фетоплацентарным комплексом, так и с необходимостью поддержания маточно-плацентарного кровотока, метаболизма в плаценте и обеспечения послеродового гемостаза [1].
Во время нормально протекающей беременности повышается риск развития осложнений, связанных как с кровотечением, так и с тромбозом. Если кровоточивость в основном встречается во время или после родоразрешения, то риск тром-бообразования повышается во время самой беременности и частично после родов. Изменение реологических свойств крови, повреждение стенки сосуда, изменение фибринолитиче-ской активности и состояние гиперкоагуляции, которое наиболее выражено в III триместре беременности, вносят свой вклад в повышение риска развития тромбоза [1, 10].
Важным показателем для характеристики степени активации гемостаза является уровень D-димера. Образование данного продукта деградации фибрина происходит следующим образом (рис. 1, 2):
1. Первоначально под влиянием тромбина от фибриногена отщепляются два фибринопептида А и два фибринопеп-тида B, в результате образуются растворимые мономеры фибрина, которые состоят из двух доменов D и одного домена E.
2. В следующую стадию мономерные молекулы фибрина полимеризуются и формируют сеть «растворимого» фибрина (фибрин-полимера, фибрина s).
3. На конечном этапе свертывания крови при участии фактора ХШа, который активируется тромбином, образуется нерастворимый фибрин (фибрин i). В нерастворимом фибрине D-домены соседних молекул фибрин-мономера ковалентно связаны между собой с образованием D-димерных комплексов.
Фибрин служит субстратом для плазмина — основного фермента фибринолиза, который вызывает последовательное расщепление этого белка на продукты его деградации. При расщеплении фибрина образуются конечные продукты — тримеры D-E-D и D-димеры, так как плазмин не способен разрезать ковалентную связь между D-доменами (рис. 2) [14].
У здоровых людей концентрация D-димера не превышает 500 нг/мл FEU (единиц эквивалента фибриногена). Период полужизни данного продукта деградации фибрина составляет
Рис. 1. Образование фибрина [13]
Рис. 2. Образование D-димера [3]
примерно 8 часов [7]. Избыток Б-димера свидетельствует об активации фибринолиза, которой предшествует усиление коагуляционного каскада с избыточным образованием нерастворимого фибрина [3]. Таким образом, появление в циркуляции повышенного количества этих продуктов деградации фибрина указывает не только на активацию фибринолиза, но и на увеличение образования тромбина.
В течение нормально протекающей беременности уровень Б-димера в плазме крови постепенно увеличивается в несколько раз, достигая своего пика к первому дню послеродового периода [16]. Чрезмерное повышение уровня Б-димера считают свидетельством неблагополучного течения беременности, которое может развиться вследствие целого ряда осложнений, связанных с нарушением в системе гемостаза, в том числе с развитием
тромботических осложнений [9]. Определение уровня D-димера во время беременности необходимо для диагностики и профилактики тромботических проявлений или других осложнений, связанных с беременностью, а также для мониторинга антитромботической терапии [8].
В современной лабораторной практике определение D-димера возможно с помощью разных методов и реактивов, поставляемых различными фирмами. Во всех методах исследования используются моноклональные антитела к различным неоантигенным эпитопам на D-димере, которые образуются при расщеплении нерастворимого фибрина плазмином, но отсутствуют на фибриногене и растворимых фибрин-мономерных комплексах [6]. Показатели, как правило, значительно варьируются в зависимости от используемых методов и реактивов, что затрудняет сравнение и трактовку полученных результатов.
В связи с этим целью нашего исследования явилось сопоставление результатов определения уровня D-димера различными методами и реактивами в различные сроки физиологически протекающей беременности.
Материалы и методы исследования
Намибылообследовано 117здоровыхбеременных женщин в возрасте от 19 до 40 лет. Из них в I триместре беременности было обследовано 44 женщины, во II — 51 и в III триместре — 22 женщины. В исследование были включены беременные, которые не имели отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза (отсутствие синдрома потери плода, угроз прерывания настоящей беременности, токсикозов и гестозов, а также хронической гинекологической патологии); без хронической соматической патологии, анемии, тромбоцитопении и любых нарушений в системе гемостаза.
Для определения уровня D-димера использовали следующие методы.
1. Количественный иммуноферментный анализ (ИФА), реактивы — "Asserachrom D-DI", Diagnostica Stago, France. Единицы измерения — нг/мл FEU (единицы эквивалента фибриногена).
2. Количественный иммунотурбидиметриче-ский метод латексной агглютинации, который выполнялся на коагулометре "Helena", реактивы "Auto Blue D-dimer 400", England. Единицы измерения — нг/мл.
3. Полуколичественный метод латексной агглютинации, реактивы "D-Dimer Test", Diagnostica Stago, Roche, France. Единицы измерения — нг/мл FEU.
4. Количественный метод иммунометрического анализа сэндвичевого типа с использовани-
ем анализатора NycoCard ридер II, реактивы
"Nico Card D-Dimer Single Test", Axis-Shield,
Norway. Единицы измерения — мг/л.
Следует отметить, что для расчета уровня D-димера используются разные единицы измерения, такие как FEU — единицы эквивалента фибриногена и единицы чистого D-димера (те и другие измеряются в нг/мл). При этом 2 FEU примерно соответствует 1 единице чистого D-димера. FEU отображают концентрацию продуктов деградации фибрина в единицах гравиметрически измеренной массы фибриногена, из которой был получен фибрин. Таким образом, 500 нг/мл FEU имеют иммунореактивность, подобную 250 нг/мл чистого D-димера. Эквивалентная иммунореактивность чистого D-димера может быть рассчитана делением результата в FEU на два [12, 15].
Кровь брали из локтевой вены самотеком в соотношении 9:1 с 3,8 % раствором цитрата натрия. Для получения бедной тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали при 2000g в течение 20 минут при температуре 22 °С. Образцы плазмы, предназначенные для выполнения методов 1 и 2, замораживали при температуре 20 °С до момента исследования. Методы 3 и 4 выполняли сразу после получения бедной тромбоцитами плазмы. Все методы выполняли согласно инструкции фирмы-производителя [5].
Для оценки нормальных показателей уровня D-димера при определении количественными методами (метод 1 и 2) использовали такие статистические параметры, как медиана, 95 %-ный доверительный интервал (2,5-й и 97,5-й процен-тили) и t-критерий для независимых выборок. Использовался пакет STATISTICA 6 [4].
При определении уровня D-димера полуколичественным методом (метод 3) оценивали частоту встречаемости различных показателей в процентах. Такой же способ применяли для более подробного анализа результатов, полученных методами 1 и 2.
Для оценки тесноты связи между методами определения уровня D-димера использовали такой показатель непараметрической статистики, как коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rS). Степень тесноты связи оценивали как слабую при rS < 0,3, умеренную — при rS от 0,4 до 0,7 и высокую — при rS > 0,7 [2]. Различия между показателями считались достоверными при уровне значимости p < 0,05.
Результаты исследования и обсуждение
В таблице представлены результаты определения уровня D-димера количественными методами 1 и 2 у здоровых беременных женщин. Данные показатели значительно отличаются друг от друга по абсолютной величине.
Иммуноферментный анализ (метод 1) показал статистически значимое повышение уровня D-димера как между I и II (172,45 1109,75 нг/мл FEU и 244,40 1268,00 нг/мл FEU соответственно; p < 0,01), так и между II и III триместрами беременности (244,40 1268,00 нг/мл FEU и 512,25 1891,50 нг/мл FEU соответственно; p < 0,01).
При определении иммунотурбидиметриче-ским методом латексной агглютинации (метод 2) отмечалось закономерное увеличение уровня D-димера во II триместре по сравнению с первым (57,00-1434,50 нг/мл против 6,90 468,55 нг/мл, p < 0,05). Однако между II и III триместрами беременности выявлялась лишь тенденция к повышению уровня D-димера (57,00 1434,50 нг/мл и 104,45 1110,70 нг/мл соответственно; p > 0,05). При этом значение 97,5-го процентиля в III триместре оказалось ниже, чем во втором (1110,70 нг/мл против 1434,50 нг/мл).
Обращает на себя внимание тот факт, что разница между показателями 2,5-го и 97,5-го процен-тилей при выполнении измерений иммунотурби-диметрическим методом латексной агглютинации (метод 2) существенно превышает таковую, отмечаемую при оценке результатов ИФА (метод 1). В связи с этим представилось важным оценить частоту встречаемости различных показателей уровня D-димера в каждом триместре у обследуемых беременных, обнаруженную с помощью количественных методов 1 и 2.
При определении уровня D-димера методом 1 (ИФА) частота встречаемости нормальных значений данного теста (< 500 нг/мл FEU) постепенно уменьшалась в каждом последующем триместре беременности и составляла 73,81 %, 42,86 % и всего 5,56 % в I, II и III триместрах соответственно (рис. 3). Частота высоких показателей уровня D-димера (500-1000 нг/мл FEU и > 1000 нг/мл FEU) значительно выросла уже во II и достигла своего пика к III триместру беременности (57,14 % и 94,44 % соответственно). Это согласуется с данными Kline J. A. et al. [11], которые показали, что, начиная со II триместра более чем у половины здоровых беременных женщин, а к III триместру — более чем у 90 % исследуемых уровень D-димера превышает нормальные значения.
На рисунке 4 представлена частота встречаемости различных показателей уровня D-димера при определении иммунотурбидиметрическим методом латексной агглютинации (метод 2). В I триместре беременности отмечалось почти 90 % нормальных показателей D-димера (< 250 нг/мл). Во II триместре более половины, а в III — практически треть исследуемых женщин не отличались от здоровых людей (66,67 % и 30 % соответственно).
Таблица 1
Динамика изменения уровня D-димера при использовании количественных методов определения у женщин с нормально протекающей беременностью (Ме, 95 % -й ДИ)
Триместр беременности Иммуноферментный анализ (метод 1, нг/мл FEU) Иммунотурбидиметрический метод латексной агглютинации (метод 2, нг/мл)
I, n=44 320,00 (172,45-1109,75) 90,00 (6,90-468,55)
II, n = 51 540,00 (244,40-1268,00) 212,00 (57,00-1434,50)
Pi-ii < 0,01 < 0,05
III, n=22 885,00 (512,25-1891,50) 313,00 (104,45-1110,70)
pii-iii < 0,01 > 0,05
73,81
19,05
7,14
I триместр □ <500 нг/мл FEU
42,86 42
I триместр H 500-1000 нг/мл FEU
III триместр >1000 нг/мл FEU
Рис. 3. Частота встречаемости (%) различных показателей уровня Б-димера при определении иммунофермент-ным анализом (метод 1)
% 1009080706050403020100 -
),75
7,69
I триместр □ <250 нг/мл
66,67
Рис. 4. Частота встречаемости (%) различных показателей уровня Б-димера при определении иммунотурбидиме-трическим методом латексной агглютинации (метод 2)
Эти результаты в значительной мере расходятся с данными ИФА, а также противоречат сведениям, имеющимся в литературе [10, 11, 16].
Таким образом, исследование уровня D-димера с помощью количественного иммунотурбидиме-трического метода латексной агглютинации (метод 2), выполняемого на коагулометре «Helena», не выявило ожидаемого роста уровня D-димера у женщин к концу нормально протекающей беременности ни в количественном выражении, ни по частоте встречаемости. Эти результаты дают возможность утверждать, что использование ИФА (метод 1) для определения уровня D-димера позволяет получить наиболее информативные данные, которые дают возможность проследить динамику изменения исследуемого показателя в процессе беременности.
Результаты полуколичественного метода латексной агглютинации (метод 3) оценивали только по частоте встречаемости различных показателей (рис. 5). Уже в I триместре беременности у 68,2 % женщин отмечали повышение уровня D-димера. Частота встречаемости высоких значений данного теста (500-3000 нг/мл FEU и > 3000 нг/мл FEU) увеличивалось во II и III триместрах беременности до 82,4 % и 90,9 % соответственно, в то время как низкие показатели (< 500 нг/мл FEU) встречались реже (17,6 % и 9,1 % соответственно).
Таким образом, при определении уровня D-димера полуколичественным методом латекс-
I триместр □ <500 нг/мл FEU
I триместр H 500-3000 нг/мл FEU
III триместр >3000 нг/мл FEU
Рис. 5. Частота встречаемости (%) различных показателей уровня Б-димера при определении полуколичественным методом латексной агглютинации (метод 3)
ной агглютинации (метод 3) прослеживалось закономерное нарастание уровня D-димера в каждом последующем триместре беременности, но начиная уже с I триместра, выявлялась слишком большая частота встречаемости (68,2 %) высоких показателей данного теста (500-3000 нг/ мл FEU и > 3000 нг/мл FEU), что также относится и ко II триместру (82,4 %). Такая особенность рассматриваемого метода обусловлена, по-видимому, его невысокой специфичностью и субъективным определением результатов. Получение завышенных результатов может
явиться причиной необоснованного назначения антитромботической терапии.
Корреляционный анализ, проведенный между количественными методами определения уровня D-димера, у здоровых беременных женщин выявил высокую достоверную положительную степень тесноты связи между ИФА (метод 1) и иммунотурбидиме-трическим методом латексной агглютинации (метод 2) (rS = 0,737570; p < 0,05) в I триместре, во II триместре — умеренную положительную статистически значимую корреляционную зависимость между методами 1 и 2 (rS = 0,461511; p < 0,05) и в III — умеренную, но не достоверную положительную степень корреляции между теми же методами исследования (rS = 0,434469; p > 0,05). При сравнении количественных методов определения уровня D-димера с полуколичественным методом ла-тексной агглютинации (метод 3) не выявилось никакой корреляционной зависимости.
В отличие от предыдущих методов, результаты количественного метода иммунометриче-ского анализа сэндвичевого типа (метод 4) не отличались у женщин на разных сроках беременности и были представлены только двумя значениями: < 0,1 мг/л и 0,1 мг/л. Возможно, этот метод предназначен для выявления значительно более высоких уровней D-димера, которые не образуются при нормально протекающей беременности.
Заключение
Таким образом, сопоставление четырех методов определения уровня D-димера при физиологически протекающей беременности показало, что только три из них позволяют определять динамику изменения этого показателя в процессе беременности. При этом полуколичественный метод латексной агглютинации имеет тенденцию к выявлению неоправданно высоких показателей, особенно в I и II триместрах. Значения 500-3000 нг/мл FEU и > 3000 нг/мл FEU, полученные полуколичественным методом ла-тексной агглютинации, не дают возможности узнать действительную степень повышения уровня D-димера и не могут служить показанием к назначению патогенетической терапии. Количественный иммунотурбидиметрический метод латексной агглютинации, выполняемый на коагулометре «Helena», не дает возможности определения достоверной разницы между показателями, полученными для II и III триместров, тогда как известно, что именно к концу беременности происходит наиболее выраженный подъем уровня D-димера. Количественный иммунофер-
ментный анализ не обнаруживает указанных недостатков. Показатели, полученные с помощью данного метода, выявляют постепенное нарастание уровня D-димера в процессе беременности, превышающее нормальные значения более чем у 50 % и 90 % женщин во II и III триместрах соответственно. Полученные данные позволяют рекомендовать проводить определение уровня D-димера у беременных женщин с помощью наиболее информативного количественного им-муноферментного анализа, который адекватно оценивает содержание данного продукта деградации фибрина в плазме крови в каждом последующем триместре беременности. При представлении результатов необходимо указывать на метод, с помощью которого проводилось определение и соответствующие ему нормальные значения (медиану и 95%-ный доверительный интервал: 2,5-й и 97,5-й процентили).
Литература
1. Бышевский А. Ш., Полякова В. А., Рудзевич А. Ю. Гемостаз при физиологической беременности, беременности с артериальной гипертензией и преэклампсией // Тромбоз, гемостаз и реология. — 2010. — № 4 (44). — С. 13-30.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. — М.: Практика, 1998. — 459 с.
3. Папаян Л. П., Князева Е. С. D-димер в клинической практике: Пособие для врачей / ред. Н. Н. Петрищев. — М.: Инсайт полиграфик, 2002. — 20 с.
4. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ STATISTICA. — М.: МедиаСфера, 2002. — 312 с.
5. Тарасова Л. Н., Владимирова С. Г. Выполнение и оценка результатов протромбинового теста. — Киров, 2009. — С. 51-68.
6. Adam S. S., Key N. S., Greenberg C. S. D-dimer antigen: current concepts and future prospects // Blood. — 2009. — Vol. 113, №13. — P. 2878-2887.
7. Bockenstedt P. D-dimer in venous thromboembolism // New England Journal Medecine. — 2003. — Vol. 349. — P. 12031204.
8. D-dimer levels during delivery and postpartum / Epiney M. [et al.] // J. thrombosis and haemostasis. — 2005. — Vol. 3. — P. 268-271.
9. D-dimer testing in pregnant patients: towards determining the next "level" in the diagnosis of deep vein thrombosis / Chan W. S. [et al.] // J. thrombosis and haemostasis. — 2010. — Vol. 8. — P. 1004-1011.
10. Eichinger S. D-dimer testing in pregnancy // Pathophysiology of haemostasis and thrombosis. — 2003/2004. — N 33. — P. 327-329.
11. Kline J. A., Williams G. W., Hernandes-Nino J. D-dimer concentrations in normal pregnancy: new diagnostic thresholds are needed // Clinical chemistry. — 2005. — N 51.— P. 825-829.
12. Marlar R. D-dimer: establishing a laboratory assay for ruling out venous thrombosis // Medical laboratory observer. — 2002. — Vol. 34, N 11. — P. 28-32.
13. McKenzie S. B. Clinical laboratory hematology. — 2nd edn. — Prentice Hall, 2010. — 976 p.
14. Practical hemostasis and thrombosis / Colman R. W. [et al.]; eds. O'Shaughnessy D., Makris M., Lillicrop. — Blackwell, 2005.
15. Raby A., Crowther M., Flynn G. D-dimer reporting: what's the problemfor the electronichealth record? An Ontario perspective // J. thrombosis and haemostasis. — 2007. — Vol. 5, suppl. 2. — P. T555.
16. Szecsi P. B., JorgensenM., KlajnbardA. Haemostatic reference intervals in pregnancy // Thrombosis and haemostasis. — 2010. — Vol. 103, №4. — P. 718-727.
Статья представлена М. С. Зайнулиной, НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН,
Санкт-Петербург
PROGESTERONE RECEPTORS IN BREAST TISSUE IN PATIENTS WITH VARIOUS FORMS OF FIBROCYSTIC COMPARISON OF DIFFERENT D-DIMER ASSAYS IN NORMAL PREGNANCY
Silina N. N., Golovina O. G., Smirnova O. A., Nikolaeva A. E., Papayan L. P.
■ Summary: D-dimer is an important test of activation of the haemostasis. D-dimer concentration progressively increases during normal pregnancy. D-dimer level analyzed from 90 healthy pregnant women at the age from 19 till 40 years with four various methods. D-dimer is recommended to estimate by the most informative ELISA. This quantitative assay adequately evaluates D-dimer level in each trimester of pregnancy.
■ Key words: normal pregnancy; D-dimer level; D-dimer assays.
■ Адреса авторов для переписки-
Силина Наталья Николаевна — к. м. н., научный сотрудник лаборатории свертывания крови. Российский Научно-иследовательский институт гематологии и трансфузиологии (РосНИИГТ). 191024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16. E-mail: nnper@mail.ru. Головина Ольга Георгиевна — к. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории свертывания крови. РосНИИГТ. НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН РАМН. 191024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16. E-mail: papayan@mail.ru.
Смирнова Ольга Анатольевна — к. м. н., научный сотрудник лаборатории свертывания крови РосНИИГТ. 191024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16. E-mail: olasova@rambler.ru.
Николаева Алла Ехильевна — заместитель главного врача по медицинской части СПб ГУЗ «Женская консультация № 22». E-mail: alla-nikolaeva2007@yandex.ru.
Папаян Людмила Петровна — д. м. н., профессор руководитель лаборатории свертывания крови РосНИИГТ. 191024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16. E-mail: papayan@mail.ru.
Silina Natalya N. — candidate of medical sciences, research scientist of blood coagulation laboratory, Russian Research Institute of Haematology and Transfusiology. 191024, Saint Petersburg, 2nd Sovetskaya, 16. E-mail: nnper@mail.ru.
Golovina Olga G. — candidate of biological sciences, leading research scientist of blood coagulation laboratory, Russian Research Institute of Haematology and Transfusiology. 191024, Saint Petersburg, 2nd Sovetskaya, 16. E-mail: papayan@mail.ru.
Smirnova Olga A. — candidate of medical sciences, research scientist of blood coagulation laboratory, Russian Research Institute of Haematology and Transfusiology. 191024, Saint Petersburg, 2nd Sovetskaya, 16. E-mail: olasova@rambler.ru.
Nikolaeva Alla E. — deputy chief doctor of Antenatal clinic .№ 2. E-mail: alla-nikolaeva2007@yandex.ru.
Papayan Ludmila P. — doctor of medicine, professor, head of blood coagulation laboratory, Russian Research Institute of Haematology and Transfusiology. 191024, Saint Petersburg, 2nd Sovetskaya, 16. E-mail: papayan@mail.ru.
