CC BY
181
УДК 616-005.2: 616.151.5-07
А.Ш. ОРАДОВА 1 С.К. ТУРСЫНОВА 2, З.К. КАНЖИГАЛИНА 1 Р.К. КАСЕНОВА \
Казахский Национальный Медицинский Университет им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы. Главный внештатный специалист по лабораторной диагностике УЗ г. Алматы. Казахский Национальный Медицинский Университет им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы.
ИССЛЕДОВАНИЕ О-ДИМЕРА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
й-димер - наиболее информативный и стабильный маркер активации свертывания крови и лизиса сгустка крови. й-димер - продукт деградации фибрина, который используется в клинике как маркер тромбозов. В статье представлены основные методы лабораторного исследования D-димера.
Ключевые слова: й-димер, микролатексная агглютинация, ИФА с использованием моноклональных антител.
D-димер: практическое значение для исследования.
Тромбоз глубоких вен (ТГВ) нижних конечностей и тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА), как проявления венозного тромбоэмболизма, являются наиболее частыми заболеваниями, которые в значительном проценте случаев приводят к инвалидизирующим осложнениям и фатальным исходам. В немалой степени это объясняется тем, что диагностика тромботических заболеваний только на основании клинических проявлений не всегда бывает точной [1]. В настоящее время существует целый ряд объективных методов -контрастная венография, ультразвуковая допплерография с дуплексным сканированием для диагностики ТГВ, ангиография и сцинтиграфия легких для выявления ТЭЛА. Однако инвазивная природа некоторых из них, высокая частота отрицательных результатов и ограниченная доступность для ежедневной клинической практики привели к разработке новых методов диагностики, основанных на результатах оценки состояния системы гемостаза. Основанием для применения лабораторных критериев диагностики тромбоэмболических осложнений явился известный факт появления в крови больных с тромбозами специфических маркеров активации системы гемостаза.
Активация системы гемостаза, которая приводит к развитию тромбоза, сопровождается появлением в кровотоке специфических маркеров, отражающих степень повышения гемостатического потенциала крови [2]. Выделяют маркеры активации тромбоцитов (тромбоцитарный фактор 4,бетта-тромбоглобулин) и маркеры активации коагуляционного каскада. К последним относят фрагмент 1+2 (продукт протеолиза протромбина), тромбин-антитромбиновый комплекс (ТАТ), фибрин-мономер, фибринопептид А и D-димер. Однако для ургентных ситуаций, когда время для постановки диагноза ограничено, пригодны далеко не все из этих исследований. Так, например, определение маркеров активации тромбоцитов требует использования специфических ингибиторов и обработки крови при +4°С. Определение фрагмента 1+2 проводится иммуноферментным методом и требует значительного времени, исследование фибринопептида А сопряжено со специфической обработкой исследуемой плазмы для удаления всего перекрестно реагирующего фибриногена. Другие маркеры, такие как фибрин-мономер, ТАТ, D-димер могут быть определены непосредственно в стандартных образцах цитратной плазмы. Однако на определение практически всех из них, за исключением D-димера, могут оказывать
влияние техника взятия крови, примесь тромбоцитов, что также является осложняющим фактором для получения адекватных и воспроизводимых результатов. Определение D-димеров -продуктов деградации поперечно-сшитого фибрина плазмином в этом отношении является исключением. На результаты их исследования практически не влияют вышеперечисленные условия, что и определило значимость оценки данного маркера в клинической практике для диагностики тромбоза. Как известно, образование тромба начинается с момента, когда под действием тромбина фибриноген превращается в фибрин, который образует основной каркас сгустка крови и тромба. Процесс превращения фибриногена в фибрин проходит три стадии [3]. В первую под действием тромбина от фибриногена отщепляются два фибринопептида А от A альфа и два
фибринопептида В от В/бетта цепей, оставляя соответственное -альфа и бетта - цепи, входящие в состав образующегося фибрин-мономера (а, р, у). Последний состоит из 2-х доменов D и домена Е. В следующую стадию мономерные молекулы фибрина полимеризуются, соединяясь друг с другом, бок в бок и конец в конец, и формируют сеть, так называемого, "растворимого" фибрина. На этом этапе образуются водородные связи между D-доменами одной молекулы и Е-доменом другой молекулы. В последнюю стадию фибриновая сеть стабилизируется под действием фактора свертывания ХШа, который катализирует образование связей "конец в конец" между у-цепями двух соседних мономерных молекул. В результате образуется нерастворимый фибрин-полимер, отличающийся от растворимого тем, что в нем D-домены соседних молекул фибрин-мономера ковалентно связаны между собой с образованием D-димерных комплексов. Фибрин, который является конечным продуктом процесса свертывания крови, одновременно служит субстратом для плазмина - основного фермента фибринолиза. Фибринолитическая система в основном адаптирована к лизису фибрина и растворимых фибрин-мономерных комплексов, но при чрезмерной активации фибринолиза возможен и лизис фибриногена. Плазмин вызывает последовательное асимметричное расщепление фибриногена и фибрина на все более и более мелкие фрагменты, обозначаемые как продукты деградации фибриногена/фибрина. В отличие от конечных продуктов расщепления фибриногена, которые представлены в виде отдельных фрагментов D и Е, при расщеплении поперечно-сшитых фактором ХШа волокон фибрина образуются более крупные фрагменты - D-димеры, тримеры D-E-D, поскольку плазмин не способен разрезать ковалентную связь между D-доменами.
У здоровых людей концентрация D-димера не превышает 500нг FEU (фибриноген эквивалентных единиц)/мл. Избыток D-димера свидетельствует об активации фибринолиза, которой предшествует усиление коагуляционного каскада с избыточным образованием нерастворимого фибрина. Клинико - лабораторные методы исследования D-димера. Во всех методах лабораторного исследования D-димера используются моноклональные антитела к неоантигенным эпитопам на D-димере, которые образуются при расщеплении нерастворимого фибрина плазмином, но их нет на фибриногене и растворимых фибрин-мономерах.
Так как эти моноклональные антитела не реагируют с фибриногеном, исследования могут проводиться как в плазме, так и в цельной крови.
В настоящее время для определения D-димера используются несколько методов, которые имеют различную чувствительность, специфичность, положительную и отрицательную диагностическую значимость.
Чувствительность теста, в данном случае теста на D-димер, определяется отношением количества больных с установленным диагнозом тромбоза, для которых результат теста положителен (то есть, когда уровень D-димера превышает пороговое значение 500нг) к общему количеству больных с установленным диагнозом.
Специфичность теста - это отношение количества людей без тромбоза, для которых результат теста отрицательный, к общему количеству отрицательных результатов.
Положительная диагностическая значимость (ПДЗ) теста на D-димер определяет, какой процент пациентов с положительным результатом имеют тромбоз, т.е. это отношение истинно положительных результатов (в данном случае с подтвержденным тромбозом) к общему количеству положительных результатов.
Отрицательная диагностическая значимость (ОДЗ) теста на D-димер определяется как отношение истинно отрицательных результатов (в данном случае без подтвержденного тромбоза) к общему числу отрицательных результатов.
Для тестов на D-димер характерна умеренная ПДЗ, что означает высокую вероятность получения ложно положительных результатов. Напротив, высокая ОДЗ теста (100%) свидетельствует о том, что отрицательный результат позволяет с достаточной долей вероятности исключить диагноз тромбоза. При ОДЗ ниже 100% возможны ложноотрицательные результаты.
Для определения D-димера используются:
1) иммуноферментные методы;
2) методы латексной агглютинации;
3)методы, основанные на агглютинации эритроцитов в цельной крови [4-6].
1. Иммуноферментные методы исследования D-димера имеют высокую чувствительность и высокую ОДЗ, но относительно низкую специфичность. Низкая специфичность этих методов обусловливает в значительном числе случаев ложноположительные результаты. Несмотря на высокую чувствительность и высокую отрицательную диагностическую значимость, иммуноферментные методы имеют ограниченное применение в широкой клинической практике прежде всего из-за необходимости специального оборудования и значительных затрат времени для их проведения. Кроме того, эти исследования достаточно дорогие и обычно проводятся не индивидуально, а на серии образцов плазм. За последние годы были разработаны иммуноферментные методы определения D-димера, которые позволяют получать результат в течение 10 минут. В них используются порозные мембраны, покрытые антителами, которые захватывают D-димер. Плазму больного фильтруют через мембрану и затем к фильтрату добавляют меченые антитела, чтобы определить связанный D-димер. Однако эти методы не менее дорогие, чем обычные иммуноферментные, и в определенной степени трудоемкие, что также ограничивает их применение в широкой клинической практике.
2. Методы определения D-димера, основанные на латексной агглютинации. К плазме, содержащей D-димер, добавляют латексные шарики, покрытые моноклональными антителами против D-димера, и отмечают время появления макроскопической агглютинации на предметном стекле. Это значительно более дешевые и просто выполнимые исследования. Они имеют умеренную чувствительность, но более высокую специфичность по отношению к ТГВ и ТЭЛА, чем иммуноферментные тесты. Чувствительность метода латексной агглютинации 500нгРЕ11/мл является пороговым значением для исключения ТГВ и ТЭЛА.
Одним из вариантов латексного метода определения D-димера является так называемый метод микролатексной агглютинации или иммунотур-бидиметрический метод. Суть метода заключается в том, что при добавлении плазмы пациента, содержащей D-димер, к реагенту происходит увеличение оптической плотности реагента, представляющего собой взвесь микролатексных частиц, покрытых моноклональными антителами против D-димера. При этом наблюдается увеличение оптической плотности пропорционально концентрации D-димера в исследуемом образце. По своей чувствительности и отрицательной диагностической значимости данный метод аналогичен иммуноферментному, но при этом не обладает недостатками последнего, т.е. возможно исследование отдельных образцов. Кроме того, турбидиметрический метод легко автоматизируется, что позволяет выполнять исследования на D-димера в рутинном режиме, наряду с такими показателями как протромбиновое время и АЧТВ (в случае анализатора гемостаза) или как
билирубин и глюкоза (в случае биохимического анализатора). 3. Методы исследования D-димера, основанные на агглютинации эритроцитов в цельной крови. Принцип метода заключается в использовании антител, которые представляют собой соединенные фрагменты антител к D-димеру и антигенам эритроцитов. При добавлении таких антител в исследуемую кровь отмечается макроскопическая агглютинация эритроцитов при повышении уровня D-димера. Это простой и быстрый метод, который позволяет получить результат через 2 минуты практически у постели больного. Важно, что для исследования может быть использована кровь из пальца. Чувствительность и специфичность метода, равно как и ОДЗ близки к характеристике методов латексной агглютинации. Однако при использовании данного метода бывает трудно дифференцировать слабоположительные и отрицательные результаты, что требует от исследователя определенных навыков.
В работах, посвященных сравнительной оценке точности быстрых методов определения D-димера, основанных на принципе агглютинации (вторая и третья группа тестов), отмечается значительная вариабельность результатов, даже когда один и тот же метод используется различными исследователями [7,8]. В качестве потенциальных источников расхождения называют различную специфичность используемых антисывороток к D-димеру, разницу в пограничном значении уровня D-димера, когда тест оценивается как положительный; и, наконец, ошибки интерпретации результатов определения, которые чаще всего встречаются при визуальной оценке наступления времени агглютинации.
Диагностировать ТГВ только на основании клинических проявлений не достаточно, поскольку у 75% - 85% больных боль в ноге, как один из ведущих симптомов ТГВ, может быть не связана с тромбозом. Назначение антикоагулянтной терапии больным с необоснованным диагнозом ТГВ не только не принесет пользы, но может спровоцировать развитие тяжелых кровотечений и гепарин индуцированную тромбоцитопению. С другой стороны, известны случаи, когда ТГВ особенно в первые дни не дает выраженной клинической симптоматики. Сомнения врача относительно точности диагноза могут стать причиной запоздалого лечения, что, в свою очередь, может привести к развитию ТЭЛА и фатальным последствиям. Для подтверждения ТГВ в клинической практике широко используется контрастная венография. Однако это дорогое и неудобное для больного исследование, которое у 3,6% - 10% больных не может быть проведено по тем или иным причинам. Данный метод исследования наиболее информативен для подтверждения проксимально расположенных венозных тромбозов, но менее полезен для диагностики ТГВ голени, на долю которых приходится 15% всех случаев тромбоза. В связи с этим в клинической практике для подтверждения ТГВ все чаще используют неинвазивные методы, в частности ультразвуковая допплерография, которая в отличие от венографии может проводиться повторно в течение ограниченного промежутка времени. Последнее исследование наиболее точное, его чувствительность к выявлению ТГВ составляет 97% (95% С1, 96 -98%), а специфичность - 94% (95% С1, 90 - 98%) для любой локализации ТГВ. Однако перечисленные методы диагностики ТГВ, как было отмечено выше, не всегда доступны для клинической практики, требуют определенного времени и присутствия квалифицированного персонала. Вот почему внимание клиницистов было обращено на возможность использования метода определения D-димера, как маркера тромботического процесса, при обследовании больных с предполагаемым диагнозом венозного тромбоэмболизма. Этому предшествовало значительное число работ, в которых было показано, что уровень D-димера обычно повышен у больных с подтвержденным диагнозом острого ТГВ и ТЭЛА. В то же время оставалось не ясным, можно ли использовать результаты определения D-димера для исключения или подтверждения диагноза венозного тромбоэмболизма без применения объективных методов исследования. С этой целью было проведено сравнение результатов определения D-димера
с результатами венографии у больных с подозрением на ТГВ. Исследование D-димера является в основном чувствительным, но неспецифичным тестом для венозного тромбоза. Это означает, что положительный результат теста на D-димер не гарантирует 100% подтверждения диагноза тромбоза. Недостаточная специфичность этого исследования объясняется тем, что повышение уровня D-димера может быть сопряжено с целым рядом состояний и заболеваний, не сопровождающихся тромбозом, в том числе после обширных хирургических вмешательств, при кровотечениях, травме, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваниях, сепсисе. Кроме того, повышение уровня D-димера установлено у лиц старше 80 лет, а также у беременных женщин. Оказалось, что на показатели D-димера влияют такие факторы как величина тромба, время от начала клинических проявлений до назначения антикоагулянтной терапии, прием антикоагулянтов, на фоне которых уровень D-димера постепенно снижается. Наиболее значимым для исключения диагноза тромбоза является отрицательная диагностическая значимость теста. В зависимости от используемого метода отрицательная диагностическая значимость теста на D-димер колеблется от 78% до 100%. И она тем выше, чем больше чувствительность метода, что характерно для иммуноферментных методов исследования. Чувствительность тестов на D-димер и их
отрицательная диагностическая значимость в значительной степени зависят от частоты встречаемости заболевания в исследуемой популяции. Например, отрицательная диагностическая значимость теста на D-димер будет выше для амбулаторных больных, чем госпитализированных, особенно онкологических больных, поскольку частота встречаемости венозного тромбоэмболизма у первых значительно ниже. Таким образом, все вышесказанное позволяет сделать заключение, что определение уровня D-димера является чувствительным и наиболее полезным тестом только для исключения диагноза венозного тромбоэмболизма. Важно помнить, что нормальные результаты теста на D-димер (не превышающие пороговое значение 500 нг/мл) улиц со слабовыраженной клинической симптоматикой заболевания являются основанием для исключения диагноза венозного тромбоэмболизма, что соответственно позволяет избежать необоснованного лечения антикоагулянтами. В то же время у больных с ярко выраженными клиническими симптомами, то есть с высокой вероятностью наличия ТГВ или ТЭЛА, нормальные результаты определения D-димера не исключают дальнейшего объективного исследования и соответственно назначения антикоагулянтной терапии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Nicolaides A.M., Bergqvist D., Hull R. Prevention of venous thromboem-bolism. International consensus statement // International Angiology, 1997. - 16. - Р. 3-38.
2 Amiral J. Molecular markers in thrombosis and hemostasis. Clin Appl Thrombosis // Hemostasis,1997. - №3. - Р. 71-81.
3 Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования // - Казань:"ФЭН", 2000. - 364 с.
4 Janssen М.С.Н., Heebels А.Е., de Metz M., Verbruggen H. Et al. Reliability of five rapid D-dimer assays compared to ELISA in the exclusion of deep venous thrombosis.Thrombosis // Hemostasis,1997. - 77. - Р.262-266.
А.Ш. ОРАДОВА 1, С.К. ТУРСЫНОВА 2, З.К. КАНЖИГАЛИНА 1, Р.К КАСЕНОВА 1
D- ДИМЕР КЛИНИКО-ДИАГНОСТИКАЛЫК; ЗЕРТТЕУ НЕГ1ЗП ЭД1СТЕР1
Туйш: D-димер - ^анныц жэне ^анныц тушрЫщ лизисыныц турушЫпшц белсенд^уЫщ ец информациялы^ жэне тура^ты тацбалагышы. D-димер - фибринныц азушылыгыныц сия^ты тромбоздыц тацбалагышыныц клиникада пайдаланып продукп. Ма^алада димера D-лабораториялыщ зерттеу- непзп эдiстерi усынысы.
ТYйшдi свздер: D- димер, шагынлатекс агглютинация, ИФА мен игеруштж моноклоналды^ антиденелердiц.
A.SH. ORADOVA1, S.K.TURSYNOVA2, Z.K. KANGIGALINA1, R.K. KASENOVA 1
RESEARCH OF D - DIMER IN CLINIC-DIAGNOSTIC LABORATORY
Resume: D-Dimer is the most informative and stable marker of activation of blood clotting and clot lysis. D - Dimer is a product of degradation of fibrin that is used in a clinic as a marker of thrombosis. The basic methods of laboratory research of D- of dimer are presented in the article. Keywords: D- dimer, microlatecs agglutination, ELISA with the use of monoclonal antibodies.
