CC BY
27
УДК: 616.24-002.5-07-085.289873.21.015.8 http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-7-75-79
СОПОСТАВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ФЕНО-ТИПИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МБТ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ Пшеничникова-Пеленёва1 И.М., Шурыгин1 АА., Милкова2 А.В. 1ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера, г. Пермь, Российская Федерация 2Клинический фтизиопульмонологический медицинский центр, г. Пермь, Российская Федерация Аннотация. В статье приведены сведения об использовании молекулярно-генетических и культуральных методов идентификации микобактерий туберкулёза и определения их лекарственной чувствительности к противотуберкулёзным препаратам у больных деструктивными формами туберкулёза лёгких. Цель исследования: сопоставление информативности разных методов идентификации и определения лекарственной устойчивости МБТ в клинической практике у больных с распространёнными деструктивными формами туберкулёза лёгких. Показано наличие несовпадений между результатами этих методов в 24% случаев. Подтверждены фенотипическими культураль-ными методами прогностические возможности определения генетического маркера лекарственной устойчивости к рифампицину как критерия множественной лекарственной устойчивости МБТ. Отмечен высокий уровень лекарственной устойчивости к пиразинамиду, множественной и широкой лекарственной устойчивости МБТ, у 54% бак-териовыделителей. Результаты исследования лекарственной устойчивости МБТ культуральными методами исследования имеют значение при выборе тактик лечения и эффективности химиотерапии. Таким образом, при деструктивных специфических процессах в лёгких в клинической практике этиологическая верификация туберкулёза и ранее определение лекарственной устойчивости возбудителя лежит в основе эффективного лечения и опирается на комплексе методов, каждый из которых вносит свой информационный вклад в лечебно-диагностический процесс. Ключевые слова. Лекарственная резистентность, мико-бактерии туберкулёза, туберкулёз легких, методы определения COMPARISON OF GENETIC AND PHENOTYPIC SIGNS OF MDT DRUG RESISTANCE IN CLINICAL PRACTICE Pshenichnikova-Pelenyova1 I.M., SHurygin1 AA., Milkova2 A. V. 1Perm state medical university named after academician E.A. Wagner, Perm, Russian Federation 2Clinical phthisiopulmonologic medical center, Perm, Russian Federation Annotation. The article provides information on the use of molecular genetic and cultural methods for identifying mycobacteria tuberculosis and determining their drug sensitivity in patients with destructive forms of pulmonary tuberculosis. The aim of the study was to compare the informative value of different identification methods and determine the drug resistance of MBT in clinical practice in patients with advanced destructive forms of pulmonary tuberculosisIt was shown that there were discrepancies between the results of these methods in 24% of cases. The prognostic possibilities of determining the genetic marker of drug resistance to rifampicin as a criterion for multiple drug resistance of MBT have been confirmed by phenotypic culture methods. A high level of drug resistance to pyrazinamide, multiple and broad drug resistance of MBT, in 54% of bacterial discharges was noted. The results of the study of the drug resistance of MBT culture and study methods are important in the choice of treatment tactics and the effectiveness of chemotherapy. Thus, with destructive specific processes in the lungs in clinical practice, the etiologic verification of tuberculosis and the earlier determination of the drug resistance of the pathogen underlies the effective treatment and is based on a set of methods, each of which contributes to the therapeutic and diagnostic process. Key words: drug resistance, tuberculosis micobacteria, pulmonary tuberculosis, definition methods.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК [1] Приказ Министерства здравоохранения РФ от 29 декабря 2014 г. № 951 «Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулёза органов дыхания» URL: REFERENCES [1] Prikaz Ministerstva zdravoohraneniya RF ot 29 dekabrya 2014 g. № 951 «Ob utverzhdenii metodicheskih rek-omendacij po sovershenstvovaniyu diagnostiki i lecheniya tuberkuleza organov dyhaniya» URL:
http://www.garant.rUproducts/ipo/prime/doc/70749840/#i xzz5JtBRx3Da (доступ 30.06.2018)
[2] Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулёза органов дыхания с множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя. - М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2014. - 72 с.
[3] Вишневский Б.И. Лекарственная устойчивость мико-бактерий туберкулёза. Лекция // Медицинский альянс. - 2017.- № 1.- С. 29-35
[4] Воробьева О.А. лекарственная устойчивость микобак-терий туберкулёза - современные взгляды на проблему // Сибирский медицинский журнал. - 2008.- № 2.-С. 5-8.
[5] Cohen Т., Becerra V.C., Murray M.B. Isoniazid resistance and the future drug-resistance tuberculosis // Microb. Drug. resist.2004. Vol. 10, N 4. Р. 280-285_
http://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/70749840/#i xzz5JtBRx3Da (dostup 30.06.2018)
[2] Federal'nye klinicheskie rekomendacii po diagnostike i lecheniyu tuberkuleza organov dyhaniya s mnozhestven-noj i shirokoj lekarstvennoj ustojchivost'yu vozbuditelya. - M.-Tver': OOO «Izdatel'stvo «Triada», 2014. - 72 p.
[3] Vishnevskij B.I. Lekarstvennaya ustojchivost' mikobak-terij tuberkuleza. Lekciya // Medicinskij al'yans.- 2017.-№ 1.- p. 29-35
[4] Vorob'eva O.A. lekarstvennaya ustojchivost' mikobakterij tuberkuleza - sovremennye vzglyady na problemu // Sibirskij medicinskij zhurnal. - 2008.- № 2.- p. 5-8.
[5] Cohen T., Becerra M.C., Murray M.B. Isoniazid resistance and the future drug-resistance tuberculosis // Microb. Drug. resist.2004. Vol. 10, N 4. P. 280-285
Рост заболеваемости и болезненности лекарственно устойчивым туберкулёзом является одной из самых актуальных проблем фтизиатрии. В Пермском крае доля МЛУ-туберкулёза среди бациллярных кон-тингентов возросла в 1,2 раза с 48,2% в 2015 г. до 59,4% в 2017 г. Раннее определение лекарственной устойчивости МБТ решается использованием молеку-лярно-генетических методов (МГМ) для определения генетических маркеров лекарственной устойчивости и регламентировано Приказом МЗ РФ № 951 [1, 2]. ПЦР-диагностика для определения ДНК МБТ характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью. Метод основан на определении специфичной ДНК МБТ и мутаций в генах, приводящих к формированию лекарственной устойчивости возбудителя без возможности оценки морфофункционального состояния МБТ. Поэтому для бактериологической диагностики ЛУ МБТ требуется применение целого комплекса различных по скорости, трудоемкости и информативности методов, результаты которых не всегда совпадают.
Цель исследования: сопоставление информативности разных методов идентификации и определения лекарственной устойчивости МБТ в клинической практике у больных с распространёнными деструктивными формами туберкулёза лёгких.
Материалы и методы. Объектом исследования явились 90 больных с впервые выявленным и рецидивным деструктивным туберкулёзом лёгких, наблюдавшихся в КФМЦ в 2016 и 2017 годах. Критерии включения: негативный ВИЧ-статус, рентгенологически наличие деструкции лёгочной ткани и/или наличие КУМ в мокроте бактриоскопически, готовность результатов всего комплекса бактериологических методов исследования. Критерии исключения: пророст неспецифической флоры при культуральном исследовании (до 8%). Мужчины составили 75% выборки, средний возраст - 41 год. Основными клиническими
формами были инфильтративный туберкулёз легких (73%) и диссеминированный туберкулёз легких (15%). В остальных случаях: 6% - ФКТ, 3% - казеоз-ная пневмония, 3% - туберкулёз бронха с бронхоле-гочным поражением.
При поступлении в центр деструктивного туберкулёза всем больным трехкратно забиралась мокрота для бактериологического исследования. В каждой порции мокроты определялись КУМ методом люминесцентной микроскопии, производились посевы на плотные питательные среды, однократно - посев на жидкие питательные среды в системе BACTEC MGIT 960, двукратно применялись молекулярно-генетические методы идентификации возбудителя -мультиплексная ПЦР real time (CFX-96) и генетических маркеров лекарственной устойчивости возбудителя к изониазиду и рифампицину. При культураль-ных видах исследования применялись следующие виды идентификации МБТ: мазок культуры с окраской по Циль-Нильсену, экспресс иммунохроматогра-фия на чипе для дифференциации туберкулёзных и нетуберкулёзных микобактерий. Определение фено-типических признаков лекарственной устойчивости МБТ на плотных средах производилось методом абсолютных концентраций и позволило оценить ЛУ возбудителя к препаратам первого ряда (изониазид -
H, рифампицин - R, этамбутол - E), за исключением стрептомицина, так как в Пермском крае высокий уровень устойчивости МБТ к нему; к препаратам второго ряда (канамицин - Km, этионамид - Еа, офлок-сацин - Ofl, аминосалициловая кислота - PAS). В системе BACTEC для теста лекарственной чувствительности МБТ использовался метод пропорций с определением ЛУ к препаратам первого ряда (изониазид - Н, рифампицин - R, этамбутол - E, пиразинамид - Z), препарату второго ряда офлоксацину - Ofl. Алгоритм бактериологической диагностики представлен на рис.
I.
ЛУпоПЦР
Ускоренный метод
крмуралъньп
Ида«я*мпн>™« исследований с устоичяю гтыс iH.R rrcv
ЛЮМ-и»тол по В А СТЕК mmbKCTni
* 1 t-
1-2 дня 3-1дня 4-5 дней Бактериоскопия ПЦР
7— 14 дней 21 — 2S дней 6— S нед
Классический Изучение ЛУ
крътуральный "его л ом абсолютных
метод концентраций
Рис. 1. Алгоритм использования различных методов этиологической верификации туберкулёза
Для обработки фактического материала и подтверждения различий в информативности методов идентификации и ЛЧ МБТ использованы следующие статистические подходы: коэффициент углового преобразования Фишера (ф*).
Результаты и обсуждение. Интенсивность и постоянство бактериовыделения у больных распространенными специфическими процессами находится в корреляционной зависимости от наличия, размеров, длительности существования, выраженности казеоз-но-некротического слоя полостей деструкции, проходимости дренирующего бронха и других факторов.
По результатам комплексного бактериологического исследования больных с деструктивными формами туберкулёза заболевание верифицировано этиологически обнаружением ДНК МБТ в 84,4% случаев, культуральными методами - значительно чаще, в 99,9% (табл. 1). При сравнении результатов посевов на жидкие и на плотные питательные среды различий по частоте бактериовыделения и доле VЛУ МБТ не
Таблица 1
Результаты молекулярно-генетических и культуральных методов идентификации и определения ЛУ МБТ
было, поэтому для сравнения с МГМ они объединены в одну совокупность. Среди пациентов с ДНК МБТ+ генетические маркеры ЛУ выявлены в 69,7% случаев, у бактериовыделителей по результатам посевов на жидкие и плотные питательные среды способность к размножению и росту в присутствии противотуберкулёзных препаратов установлена в 64% наблюдений (табл. 1). По этому критерию МГМ и фенотипически значимых различий не имеют и показывают высокий уровень ЛУ МБТ у больных с деструктивными формами туберкулёза на текущий момент. При оценке удельного веса множественной лекарственной устойчивости МБТ МГМ показали тот же уровень, что и культуральные методы. Важно, что определение мутаций, приводящих к устойчивости только к рифам-пицину без маркеров устойчивости к изониазиду, не подтверждалось посевами, в то время как ЛУ только к Н без устойчивости к R, как правило, было подтверждено культурами (табл. 1).
Результат Генетические маркеры ЛУ МБТ (ПЦР) Посев и фенотипические маркеры ЛУ МБТ (на жидких и плотных средах)
n % n %
Отрицательный (МБТ-) 14 15,6 1 1,1
Положительный (МБТ+) 76 84,4 89 98,9*
Всего 90 100 90 100
От МБТ+ • без ЛУ 23 30,3 32 36,0
• с ЛУ 53 69,7 57 64,0
Всего ЛУ от МБТ+ 76 100 89 100
■ устойчивость к Н без R 10 18,9 8 14,0
■ устойчивость к R без Н 5 9,4 0 0
■ устойчивость к Н и R 38 71,7 42 73,7
■ ШЛУ (ЛУ к Н+R+Ofl+Km) 6 10,5
■ другая Л У 1 1,8
Всего от ЛУ МБТ+ 53 100 57 100
Примечание. * - различия достоверны при сравнении двух методов, р <0,05, ф*
Во всех случаях ЛУ к R по МГМ была получена устойчивость к НR по культурам. Поэтому для под-
счета доли МЛУ по МГМ суммировали ЛУ к R и ЛУ к HR и получили 81,1% от всех случаев ЛУ. По резуль-
татам культуральных методов доля МЛУ составила 73,7%, но с учетом выявленной методами посева ШЛУ соотношение с МГМ по устойчивости к HR выровнялось и составило 84,2%. Таким образом, в клинической практике определение генетических маркеров устойчивости к R и HR позволяет адекватно оценить удельный вес МЛУ и части, ШЛУ с входящей в нее устойчивостью к HR.
В то же время в 22 (24,5%) случаев наблюдались несовпадения результатов МГМ и культуральных методов. Наиболее часто встречалась ситуация, когда ДНК МБТ обнаружено не было, а рост культур был получен (13 случаев, 59,1% от несовпадений, 14,4% от обследованных). При этом у 46,2% культур МБТ сохранена полная чувствительность к противотуберкулёзным препаратам, а у 53,8% - сформировалась МЛУ, что соответствует наблюдениям с ДНК+. Остальные 9 случаев несовпадений встречались гораздо реже в нескольких вариациях.
1) ЛУ только к R без Н по МГМ (5 случаев) сопровождалась устойчивостью HR и к другим препаратам при посевах. Недовыявление генетических маркеров ЛУ к Н с помощью МГМ обусловлено различиями в механизмах формирования ЛУ: к R изменения затрагивают 1 ген (rpoB), к Н - несколько, лишь 70% случаев касаются гена katG, который и используется в диагностических тест-системах, более редкие мутации в них не включены [3, 4, 5].
2) Наличие ЛУ к Н по МГМ без ЛУ, но к R при посевах выявлена ЛУ к НЯ (2 случая). Недовыявление мутаций к R может быть связано с несколькими причинами: низкой концентрацией ДНК в материале, мозаичностью штаммов МБТ у одного больного.
3) При МГМ выявлены маркеры ЛУ к Н или к НЯ, а при посеве культуры имеют полную чувствительность к противотуберкулёзным препаратам (2 случая). Эту ситуацию можно связать с мозаичностью штаммов МБТ у одного больного, и/или с суперинфицированием на текущий момент.
Следовательно, на выбор лечебной тактики могут оказать влияние несовпадение МГМ и культуральных методов, и доля таких неверных решений может составить до 1/5 случаев. На основании МГМ отсутствие ДНК МБТ не позволяет определить маркеры ЛУ к Н и R и выбрать нужный режим ХТ, значит необходимо учитывать, что у половины больных есть МЛУ МБТ. А наличие множественных штаммов у одного больного является причиной неэффективности лечения у 5% бактериовыделителей.
Результаты культуральных исследований хоть и были весьма близки по результатам, тем менее имеются некоторые несовпадения. Часть из них обусловлена особенностями методов, в частности спектром противотуберкулёзных препаратов. Так на BACTEC методом пропорций изучалась чувствительность к 5
АБП, методом абсолютных концентраций на плотных средах - к 7 АБП. Общими набором АБП для обоих методов были HREOfl. Лишь в 2 случаях (3,5% от ЛУ форм) имелось несовпадение результатов исследования ЛУ на жидких и плотных средах: в одном из них МГМ и по BACTEC определения ЛУ к Н, а на плотных средах ШЛУ (HREEаKPASOfl); в другом наблюдении МГМ не найдена ДНК МБТ, на BACTEC ЛУ только к Z и Ofl, на плотных средах так же обнаружена ШЛУ (HREаKmPASOfl).
Только посевы на жидкие питательные среды в системе BACTEC позволяют оценить ЛУ к пиразинами-ду из-за особенностей препарата и его взаимодействия с МБТ. Чувствительность к остальным противотуберкулёзным препаратам исследовалась только методом абсолютных концентраций: Km, Еа, PAS.
По данным нашего исследования культуральными методами монорезистентность выявлена лишь у 5 пациентов (8,8% от ЛУ форм), и это была устойчивость к изониазиду. У подавляющего большинства больных с ЛУ МБТ наблюдалась полирезистентность: к двум АБП в 28% случаев, к 3 АБП - 24,6%, к 4 АБП - 7%, к 5 АБП - 17,5%, к 6 АБП - 12,3%, к 7 АБП -1,8% наблюдений.
В изученном спектре лекарственной устойчивости МБТ из 8 АБП наиболее часто обнаруживалась устойчивость к препаратам первого ряда: первое ранговое место занимает изониазид (91,2% от ЛУ форм, 58,4% бактериовыделителей), на втором месте ри-фампицин - 77,2% (48,4% от МБТ+), третье место у пиразинамида - 60,7% (49,4% от МБТ+), четвертое у этамбутола 59,6% (38,2% от МБТ+). Устойчивость к другим, резервным, препаратам выявлена в меньшей доле: к этионамиду 33,3% (21,3% от МБТ+), к офлок-сацину 22,8% (14,6% от МБТ+), к канамицину 21,1% (13,5% от МБТ+), к PAS 19,3% (12,4% от МБТ+).
Удельный вес комбинаций АБП, к которым сформировалась ЛУ МБТ закономерно различался при разных культуральных методах. Так, в системе BACTEC в спектре ЛУ чаще преобладало сочетание HREZ 32,1%, HR, HRE и HREZOfl по14,3% от ЛУ форм. На плотных средах наиболее часто встречалась комбинации: HR и HRE по 21%, HREE^mOfl 10,5%, HREEаPAS 5,3% от ЛУ форм. Остальные комбинации встречались реже, но включали в себя сочетание HR, за исключением 3 случаев.
Наиболее значимо определение доли МЛУ и ШЛУ МБТ как фенотипического признака, определяющего лечебную тактику. Доля МЛУ как на жидких, так и на плотных средах составила 73,7% от ЛУ форм (47,2% от МБТ+). Широкая лекарственная устойчивость в виде сочетания HRKmOfl составила 10,5% от ЛУ форм и 6,7% от МБТ+. Однако преШЛУ, т.е. ЛУ HROfl, дающая основание для назначения 5 режима химиотерапии согласно Приказа МЗ № 951, встреча-
лась еще у 12,3% пациентов с ЛУ формами, и пре-ШЛУ в виде НRКm - у 10,5%. У пациентов с пре-ШЛУ самый высокий риск формирования ШЛУ.
Таким образом, при деструктивных специфических процессах в лёгких в клинической практике этиологическая верификация туберкулёза и ранее определение лекарственной устойчивости возбудителя лежит в основе эффективного лечения и опирается на комплексе методов, каждый из которых вносит свой информационный вклад в лечебно-диагностический процесс.
Выводы:
1. Чувствительность культуральных методов выше, чем молекулярно генетических. Генетические маркеры ЛУ к R подтверждаются фенотипически в 100% случаев могут служить критерием МЛУ в клинической практике. Доля МЛУ МБТ, диагностированная с
помощью МГМ соответствует культуральным методам и составляет 73,7% от ЛУ форм и 47,2% от бакте-риовыделителей.
2. В каждом пятом случае имеется то или иное несоответствие МГМ и культуральных методов, в 17% случаев влияющее на лечебную тактику.
3. Результаты культуральных методов исследования ЛУ МБТ совпадают в 94% наблюдений. Доля ШЛУ МБТ составляет 10,5% от ЛУ форм и 6,7% от бакте-риовыделителей, вместе с преШЛУ - 33,3% от ЛУ форм, 21,3% от МБТ+. МЛУ и ШЛУ МБТ в сумме -84,2% от ЛУ форм и 53,9% от всех бактериовыдели-телей. Выявлен высокий уровень ЛУ к пиразинамиду 60,7% от ЛУ форм и 49,4% от МБТ+, обуславливающий недостаточную эффективность основных режимов ХТ.
