CC BY
286
замечания редактора
Уважаемые коллеги, авторы статей! Для повышения информативности, практической значимости и научного уровня публикаций в журнале "Клиническая лабораторная диагностика" редакционная коллегия журнала обращается к Вам с просьбой не присылать в редакцию рукописи, которые основаны на методических приемах, давно вышедших из употребления. Это касается:
1) статей, посвященных определению перекисного окисления липидов; определение является в полной мере неспецифичным и диагностического значения не имеет. Как правило, в подобных статьях авторы воздерживаются от обсуждения полученных результатов, а если и обсуждают, то только количественные аспекты полученных результатов;
2) статей, посвященных конформации молекулы альбумина, которые реализованы в том исполнении, которое предложено много лет назад и практической значимости, за прошедшие годы, так и не выявило;
3) неудачных попыток определения не кристаллизации, а высыхания капель плазмы крови с многочисленными предложениями относительно диагностического значения наблюдаемых изменений;
4) работ по оценке содержания молекул средней молекулярной массы, которые не имеют диагностического преимущества перед определением С-реактивного белка в клиническом (СРБ-пентамер) и субклиническом интервале (СРБ-мономер).
Каждую статью следует заканчивать обсуждением полученных результатов и, конечно, объем клинического материала, особенно при наличии большой группы обследуемых, должен быть достаточен для статистической обработки.
Методические аспекты определения химических элементов, микроэлементов в биологических материалах не должны быть, порой старше самих авторов. Редакционной коллегии трудно решить вопрос о сочетании в одной работе хорошего клинически и диагностически важного материала и очень несовременных методов его определения.
Руководитель лаборатории клин. биохимии липидного обмена, проф. В.Н. Титов
© коллектив авторов, 2013
удК 616.155.194-07:616.154:577.118]-074
А.А. Левина, м.м. Цибульская, Л.Т. минина, Н.в. Цветаева
соотношение между основными микроэлементами (ре, си, zn) при анемиях различной этиологии
Гематологический научный центр ФГБу минздрава России
Гомеостаз основных микроэлементов (Fe, Cu и Zn) крайне важен для нормального функционирования организма. В работе представлены данные по определению этих металлов как в сыворотке крови, так и в моче у больных с анемиями различной этиологии, поскольку показатели экскреции могут дать дополнительную информацию и для постановки диагноза, и для необходимой терапии. В связи с этим в статье подробно описаны простые колориметрические методы определения указанных металлов в моче. Показано, что при анемиях наблюдается положительный баланс меди, что возможно, является причиной коагуляционных осложнений.
Ключевые слова: микроэлементы, Fe, Cu и Zn, сыворотка, моча, анемии A.A. Levina, M.M. Tzybulskaya, L.T. Minina, N.V. Tsvetayeva
THE RATIO BETWEEN BASIC MICROELEMENTS (FE, CU, ZN) UNDER ANEMIA OF DIFFERENT ETIOLOGY The hematologic research center of Minzdrav of Russia, Moscow, Russia
The homeostasis of basic microelements (Fe, Cu and Zn) is ultimately important for normal functioning of organism. The article presents the data concerning the detection of these metals both in blood serum and urine of patients with anemia of different etiology. The indicators of excretion can provide additional information for diagnostics and needed therapy. The article describes in details simple colorimetric methods of detection of mentioned metals in urine. It is demonstrated that under anemia the positive balance of cuprum is noted. This occurrence can be a possible cause of coagulation complications.
Key words: microelement, Fe, Cu, Zn, blood serum, urine, anemia
__В последние годы уделяется вполне справедливое
Для корреспонденции: внимание к изучению роли эссенциальных микроэле-
Левина Алла Аркадьевна, вед. науч. сотр. ментов для человека. Связан° ЭТ° прежде всег° с те^
Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский пр., 4а что нарушение гомеостаза каждого микроэлемента при-
Е-таП: yullevina@yandex.ru водит к чувствительным изменениям в состоянии орга-
нов и систем организма. Безусловно, наиболее подробно к настоящему времени изучен метаболизм железа, определены белки, участвующие в абсорбции, транспортировке и выведении железа. Достаточно хорошо изучены состояния, связанные как с дефицитом (анемии), так и с перегрузкой железом (гемохроматоз). Это связано с уникальной ролью железа в организме, поскольку оно входит в гемоглобин, миоглобин и целый ряд железосодержащих ферментов [1]. Поэтому роль железа в организме переоценить невозможно, но и нарушения в его содержании встречаются достаточно часто (ЖДА по данным ВОЗ наблюдается в 15-20%), а гемохроматоз - в 1% [2]. В то же время метаболизм железа тесно связан с состоянием медь- и цинксодержащих белков и ферментов, поскольку основные медьсодержащие белки - це-рулоплазмин и гефестин - катализируют переход Ше+2 в Ше+3, что является необходимым процессом при всасывании железа в кишечнике и переносе его на трансферрин; значение же цинка определяется тем, что он входит в состав ферментов, участвующих в антиоксидантной защите организма [3].
Белки, участвующие в метаболизме железа, подробно описаны в предыдущих обзорах [4, 5]. Метаболизм меди связан с сывороточным белком - церулоплазмином (ЦП). Установлено, что 95% меди, находящейся в организме человека, входит в состав ЦП, это дает возможность утверждать, что ЦП является транспортным белком меди [6]. Молекула ЦП состоит из одной полипептидной цепи, ее длина составляет 1046 аминокислотных остатков. У человека известны две изоформы ЦП. Молекулярная масса ЦП - 132 кД. В связи со своей функцией по окислению железа церулоплазмин называется также ферро02-оксидоредуктазой или феррооксидазой. В состав активного центра ЦП входит 6 ионов меди. Следует учитывать, что ионы меди, входящие в состав белков, разделяются на три типа в зависимости от способа лигандирования и соответственно от спектральных характеристик.
С давних времен было замечено, что медь необходима для нормального метаболизма в организме [7, 8]. При дефиците меди наблюдаются многочисленные нарушения, приводящие к торможению роста, анемии, депигментации кожи и др. В то же время гиперкуперемия приводит к расстройствам нервной и выделительной систем, аллергодерматозам, дефициту всасывания цинка и молибдена. Вероятно, крайне агрессивное проявление гиперкуперемии связано со специфическим строением самой молекулы данного металла, который может за счет свободных валентностей связываться с аминами белков, что приводит к их агрегации. Наиболее известным заболеванием, связанным с нарушениями в метаболизме меди, является гепатолентикулярная дегенерация (болезнь Коновалова-Вильсона), при которой уровень ЦП снижается и в связи с уменьшением экскреции меди с желчью устанавливается положительный баланс меди, которая токсически действует на гепатоциты и затем откладывается в различных органах и тканях. В норме уровень ЦП - 0,2-0,4 мг/мл, при болезни Коновалова-Вильсона значения ЦП снижаются. При воспалении, инфекции, травматических состояниях уровень ЦП повышается, доказано его взаимодействие с лактоферрином, одним из основных бактерицидных белков [9]. При дефиците железа происходит активация экспрессии гена ЦП НШ-1а (фактором, индуцируемым гипоксией) [9]. Синтез ЦП регулируется на уровне мРНК; ген, кодирующий ЦП, локализован на хромосоме 3 и содержит 20 экзонов. Рецепторы ЦП выявлены в многих тканях и органах: аорте, сердце, эритроцитах, моноцитах, эндотелии пече-
ни, лимфоцитах, гранулоцитах, яйцеклетке и особенно в различных структурах мозга, в том числе сетчатке глаза. Встраивание меди в молекулу ЦП происходит в сети аппарата Гольджи.
Как уже говорилось выше, цинк также является одним из крайне значимых элементов для метаболизма. Запасы цинка в организме человека невелики и составляют 1,5-2 г [10]. Наибольшее количество цинка содержится в скелетных мышцах, гипофизе, поджелудочной и предстательной железах, а также в сетчатке глаза; значительно меньше его в печени и почках. В крови цинк в основном содержится в эритроцитах, немного его в плазме и лейкоцитах. Цинк поступает в организм через желудочно-кишечный тракт с пищей, в основном всасываясь в двенадцатиперстной кишке. Кроме того около 10-15% цинка секретируется в поджелудочной железе. Выводится цинк из организма в основном с калом. Цинк входит в состав всех существующих ферментных систем и является компонентом более 300 металлофер-ментов, участвующих в обмене белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот [10]. Цинк участвует в росте, делении и дифференцировке клеток. Цинк входит в состав щелочной фосфатазы костей, связан с кальцифи-кацией скелета и его формированием. Он крайне важен для линейного роста человека как внутриутробно, так и постнатально. Наблюдается высокая активность цинка в процессе регенерации после ожогов и ранений. При дефиците цинка развивается гипогонадизм, низкорос-лость, половой инфантилизм, бесплодие, иммунодефицит, дерматит, ускорение стеатоза печени и атеросклероз вен, происходит снижение синтеза интерлейкинов и образования медиаторов межклеточного взаимодействия [11]. При тяжелом дефиците цинка наблюдается уменьшение лимфоидной ткани, которая проявляется атрофией тимуса, миндалин, лимфатических узлов, селезенки. Цинк является одним из основных металлов, входящих в ферменты антиоксидантной защиты, что свидетельствует о его уникальной роли.
Представленные данные литературы свидетельствуют о значимости этих микроэлементов для гомеоста-за человека в норме. Однако каково соотношение этих элементов при анемиях, не ясно. Цель работы - проанализировать уровни Ше, Си и 2п при анемиях различной этиологии: ЖДА, АИГА и АХВЗ. Причем, исходя из значений этих элементов в метаболизме человека, уделять внимание следует не только уровню металлов в организме, но и выведению их из него, т. е. концентрацию металлов нужно определять как в сыворотке крови, так и в моче.
Материалы и методы. В работе проанализированы результаты обследования 88 пациентов: 24 - с ЖДА, 40 больных с АХВЗ и 24 - с АИГА. Диагнозы установлены на основании стандартных методов обследования и верифицированы с применением современной аппаратуры. Больные с АИГА были разделены на две группы в зависимости от значений гемоглобина: в 1-ю группу вошли пациенты с уровнем НЬ больше 80 г/л, а во 2-ю с НЬ < 80 г/л. Другими словами, в 1-ю группу вошли больные, находящиеся в состоянии относительной ремиссии, а во 2-ю - больные во время гемолитического криза.
В работе использовано определение следующих параметров: Ше, Си, 2п, ОЖСС, НТЖ, ферритина сыворотки и эритроцитов, иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов, гепсидина, НШ, экскреции металлов с мочой и др.
Все металлы определяли колориметрическим методом с применением наборов фирмы Лахема (Чехия).
Таблица 1
показатели Fe, cu и Zn в сыворотке крови
Группа больных Fe (мкм/л) Cu (мкм/л) Zn (мкм/л) Fe/Cu Fe/Zn Cu/Zn Феррит (мкг/л)
АИГА (1) 28,6 ± 7,9 18,8 ± 8,5 17,7 ± 6,5 1,5 ± 0,7 1,6 ± 0,4 1,1 ± 0,4 465± 105
АИГА (2) 15,8 ± 6,4 25,3 ± 7,7 11,3 ± 3,8 0,6 ± 0,1 1,4 ± 0,5 2,9 ± 0,9 264 ± 65
ЖДА 6,1 ± 0,9 20,9 ± 4,7 5,8 ± 0,8 0,34 ± 0,2 1,8 ± 0,3 5,2 ± 0,9 31,4 ± 7,1
АХВЗ 13,9 ± 4,7 27,5 ± 4,5 9,9 ± 2,8 0,6 ± 0,15 1,4 ± 0,25 4,4 ± 0,8 539 ± 122
Норма 15-20 12-17 12-19 1,1-1,3 1,0-1,2 0,7-1,0 40-150
Ферритины сыворотки и эритроцитов определяли радиоиммунным методом, используя наборы фирмы Immunotech, для определения иммуноглобулинов эритроцитов, гепсидина, HIF и др. использовали различные модификации иммуноферментного метода.
Экскрецию металлов с мочой проводили колориметрическим методом в аликвоте мочи из суточного количества и рассчитывали с учетом объема мочи, выделенной за сутки. В связи с тем, что определение металлов в моче с применением колориметрических методов в настоящее время проводится довольно редко, т. к. заменено на спектрографическое, которое, безусловно, является очень прогрессивным, но и крайне дорогим, мы приводим подробное описание недорогих и доступных методов выявления концентрации Fe, Cu и Zn в моче.
Методика определения железа в моче. Определение железа в моче проводят колориметрическим методом с применением феррозина как индикатора. Метод основан на количественном измерении ионов двухвалентного железа, которые с этим реактивом в кислой среде образуют комплекс фиолетового цвета. Для этого вначале все железо восстанавливают, затем добавляют определенный объем реактива, являющегося индикатором Fe+2. Реакцию следует проводить следующим образом: к 0,5 мл мочи добавить 0,5 мл осаждающего раствора [растворы трихлоруксусной кислоты (10%) и тиогликолиевой кислоты (2%) в соотношении 10:1]; центрифугировать и в 0,1 мл надосадочной жидкости добавить 0,1 мл раствора феррозина (0,5 М раствор сульфонилтриазина (феррози-на), 6 мл насыщенного раствора ацетата натрия и 5 мл дистиллированной воды); измерить на спектрофотометре при X 540 нм и рассчитать по формуле концентрацию железа.
C = 17,9/Дст. • Дпр. • V,
где 17,9 - расчетный коэффициент, Дст - показатель оптической плотности стандартного раствора железа при X 540 нм, а Д - показатель оптической плотности изме-
''пр.
ряемой пробы при 540 нм, V - объем мочи за сутки в л.
Методика определения меди в моче. Определение меди основано на использовании в качестве индикатора батокупроина, который с ионами одновалентной меди образует устойчивый комплекс оранжевого цвета, который можно фотометрировать. В связи с этим медь в моче вначале также должна быть восстановлена. Проводили реакцию: к 0,5 мл мочи добавили 0,5 мл осаждающего раствора (гидрохлорная кислота - 2 мл и трихлоруксусная кислота - 0,6 мл), от-центрифугировали и к 0,1 мл надосадочной жидкости добавили 0,1 мл индикатора (5 мл 2 мол батокупроина, 5 мл 1,3% раствора гидроксиламинсульфата); спектрофотоме-трировали при X 490 нм и рассчитали по формуле:
С = 30/Д • Д1 - Д2 • V,
^ст. ^ пр. ^ пр. '
где 30 - расчетный коэффициент, Дст - показатель оптической плотности стандартного раствора меди при 490 нм, а Д1 - показатель оптической плотности изме-
пр.
ряемой пробы при 490 нм, куда внесен индикатор Д2
- показатель оптической плотности измеряемой пробы без индикатора, V - объем мочи (л/сут).
Методика определения цинка вмоче. При определении цинка индикатором служил 2-(5-бром-2-пиридилазо)-5-
(П-пропил-П-сульфопропиламино)-фенол (5-Br-PAPS),
соединенный с хелатором, который с восстановленным цинком образует комплекс красного цвета. Провели реакцию: к 0,5 мл мочи добавили 0,5 мл осаждающего раствора [растворы трихлоруксусной кислоты (10%) и тиогликолиевой кислоты (2%) в соотношении 10:1]; центрифугировали и в 0,1 мл надосадочной жидкости добавили 0,1 мл индикатора, спектрофотометрировали при X 540 нм и рассчитали по формуле:
С - 30,4/ДсТ. • Дпр. • V,
где 30,4 - расчетный коэффициент, Дст. - показатель опт. пл. стандартного раствора цинка при 540 нм, а Д
- показатель опт. пл. измеряемой пробы, V - объем мочи за сутки в л. Получили значения экскреции металла в мкм/сут.
Норма: выведение железа - до 7 мкм/сут; меди - до 3-5 мкм/сут; цинка - 15-20 мкм/сут.
Результаты и обсуждение. В табл. 1 представлены результаты по определению металлов у больных анемиями.
Анализируя результаты определения микроэлементов, можно убедиться, что у большинства больных с анемиями значения меди превышают уровень железа сыворотки и в среднем соотношение Бе/Си < 1. У больных с АИГА во время ремиссии уровень всех микроэлементов находился в пределах нормы, а в период гемолитического криза значения меди, несмотря на то что повышены незначительно, создают, видимо, положительный баланс в организме, что отражается на соотношениях между микроэлементами. Поскольку известно, что перегрузка организма медью может приводить к токсическому воздействию на клетки, а при длительном периоде ги-перкуперенемии откладываться в органах, изменения в соотношениях между этими микроэлементами должны
Таблица 2
Экскреция fe, cu и Zn в сутки
Группа Fe (мкм/сут) Cu (мкм/сут) Zn (мкм/сут)
больных до после до после до после
хелатора хелатора хелатора хелатора хелатора хелатора
АИГА 8,5 ± 0,7 15,5 ± 1,2 5,5 ± 0,8 13,8 ± 1,0 9,2 ± 1,1 12 ± 1,2
ЖДА 5,5 ± 0,7 5,8 ± 0,6 6,0 ± 0,4
АХВЗ 7,5 ± 0,9 15 ± 1,3 6,5 ± 0,9 18,3 ± 2,1 9,9 ± 1,2 15,5 ± 1,8
настораживать, поскольку медь является очень сильным комплексоном и может вызывать агрегацию белков. Можно предположить, что изменения в уровнях эндо-телина и тромбомодулина, показателях коагуляционной системы при АИГА связаны с этим явлением. Было замечено, что применение купренила или десферала вело к уменьшению иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов при АИГА, уменьшению значений меди, снижению гемолиза и купированию анемии. Уровень цинка у большинства больных с АИГА 1-й группы находился в пределах нормы, а во второй несколько снижен, что свидетельствует о цинкодефиците, что возможно связано с усиленным выведением цинка с мочой.
В табл. 2 представлены результаты по определению экскреции металлов у больных с анемиями.
В данной статье представлены аналогичные показатели для больных ЖДА, сочетающейся с воспалительными или инфекционными процессами. В принципе эти больные должны были бы отнесены к больным АХВЗ, но по традиционным биохимическим параметрам (СЖ, СФ, ЭФ, НТЖ, ОЖСС, ТфР) они относятся к ЖДА. У 90% этих больных уровень меди значительно превышает уровень железа и соотношение Fe/Cu равно 0,35, а у 50% этих больных уровень Cu выше средних значений. Уровень Zn практически у всех больных этой группы ниже нормы, что говорит о дефиците цинка при данной форме ЖДА. Почти у 80% этой группы уровень гепсидина тоже не соответствует тем значениям, которые должны быть при истинных ЖДА, поскольку у этих больных уровень гепсидина выше 100 пг/мл, а при нео-сложненных ЖДА значения гепсидина ниже 40 пг/мл. Стоит заметить, что подобные железодефицитные состояния особенно сложно поддаются феррокоррекции.
При АХВЗ уровень СЖ в среднем также значительно ниже уровня Cu, и соотношение Fe/Cu равно 0,6. Уровень меди повышен в этой группе у 50% больных, уровень цинка снижен у 67% больных этой группы, что говорит о присутствии цинкодефицита у больных АХВЗ. Увеличение уровня меди, не связанное с болезнью Коновалова-Вильсона, видимо, сопровождает анемии хронических болезней, посколькул они чаще всего связаны с нарушениями в метаболизме гепатоцитов, что приводит к положительному балансу меди и вызывает изменения, характерные для перегрузки организма медью: усиленную агрегацию белков и образование тромбов.
Данные определения экскреции металлов, представленные в табл. 2, показывают, что до проведения хелаторной терапии выведение железа, меди и цинка незначительно, но после курса десферала или купринила выведение меди возрастает в 2-3 раза, причем оно носит флюктуционный характер. Интересно заметить, что при всех 3-х формах анемий уровень HIF повышен приблизительно в 2-2,5 раза и равен приблизительно 13,6 пг/ мл, т. е. уровень гипоксии при этих состояниях примерно одинаков.
Таким образом, в проведенной работе показано, что при анемиях различной этиологии наблюдается увеличение уровня меди, что может быть причиной многочисленных осложнений, вызываемых положительным балансом меди, и поэтому пути коррекции анемии должны включать выведение меди из организма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Andrews N.C. Disorder of ironmetabolism. N. Engl. J. Med. 1999; 341: 1986-95.
2. Recommendations to prevent and control iron deficiency with of the International Nutritional Anemia Consultative Group (INACG), WHO and UNICEF. Geneva; 2004: 88.
3. ChenH., Altieh Z.K., Su T. Hephaestin is a ferroxidase that maintains partial activity in sex-linked anemia. 2004; 103: 3933-9.
4. Ganz T. Molecular control of iron transport. J. Am. Soc. Nephrol. 2007; 18: 394-400.
5. Левина А.А., Казюкова Т.В., Цветаева Н.В. и др. Гепсидин как регулятор гомеостаза железа. Педиатрия, 2008; 87(1): 67-74.
6. Hellman N.E., Gitlin J.D. Ceruloplasmin metabolism and function. Annu. Rev. Nutr. 2002; 22: 439-458.
7. McKie A.T., Latunde-Data G.O., Meret S. Molecular evidence for the role of a ferric reductase in iron transport. Biochem. Soc. Trans. 2002; 30: 722-4.
8. Vulpe C.D., Kuo Y.M., Murphy T.L. Hephaestin, a ceruloplasmin homologue, implicated in intestinaliron transport. Nat. Genet. 1999; 21: 195-9.
9. Ellison R.T.3. The effects of lactoferrin on gram-negative bacteria. Adv. Exp. Med. Biol. 1994; 357: 71-90.
10. Harris Z.L., Durley A.P., Man T.K. Target gene disruption reveals an essential role for ceruloplasmin in cellular iron efflux. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 10812-71.
11. Смирнов Ю.К. Роль цинка в здоровье человека. Википедия, 2007.
Поступила 12.10.12
отзыв на статью левиной А.А. и соавт. "соотношение между основными микроэлементами (Fe, Zn) при анемиях разной этиологии"
Статья Левиной А.А. с соавторами по мнению всех членов редакционной коллегии имеет диагностическое значение и описанные методы практически используют в клинических гематологических отделениях. Однако, определение содержания железа, микроэлементов меди и цинка выполнено далеко не на современном уровне с учетом еще и того, что биологической жидкостью для исследования явилась моча. Состав этой биологической среды и ее рН могут оказывать влияние на получаемые результаты при использовании метода комплексонообразования. Желательно, для столь важных клинических исследований использовать атомно-абсорбционную спектроскопию, тем более, что такое оборудование есть и отечественного производства.
Статья может быть напечатана из-за значимости клинического материала, но последний раз; методический уровень должен быть выше.
Руководитель лаборатории клин. биохимии липидного обмена, проф. В . Н . Т и т о в
