CC BY
19
МИКОЛОГИЯ И АЛЬГОЛОГИЯ
УДК 582.29:619.611.573.616:092.632.636.578
СОХРАННОСТЬ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ГРИБОВ В ГЕРБАРНЫХ ОБРАЗЦАХ ЛИШАЙНИКОВ
А.А. Буркин*, Т.Ю. Толпышева, Г.П. Кононенко*
(кафедра микологии и альгологии; e-mail: tolpysheva@mail.ru)
Методом иммуноферментного анализа в гербарных и свежесобранных слоевищах эпи-гейных лишайников Cladonia stellaris, C.rangiferina, Allocetraria nivalis, A. cucullata, Cetraria islandica, Peltigera canina и Nephroma arcticum не выявлено существенных различий в содержании вторичных метаболитов, относящихся к микотоксинам — дезоксиниваленола, диаце-токсисцирпенола, зеараленона, альтернариола, цитринина, стеригматоцистина, циклопиазоно-вой кислоты, микофеноловой кислоты, эмодина и PR-токсина. Обнаружение этих веществ в образцах, сроки хранения которых превышают несколько десятилетий, свидетельствует об эффективной системе консервации продуктов метаболического обмена в лишайниках.
Ключевые слова: лишайники, микотоксины, гербарий.
Известно, что лишайники перед инсерацией не подвергают химической или температурной обработке, их просто хорошо просушивают на воздухе и помещают в бумажные пакеты. При длительном хранении такого материала не отмечено случаев его порчи насекомыми, поражения грибами или другими микроорганизмами. Отсутствие внешних воздействий дает возможность использовать гербарные образцы лишайников для изучения характера биохимических изменений, сопровождающих процесс хранения. Так, было показано, что у Sticta sp. через 4 года полиолы — рибитол, арабинитол и маннитол уже практически не удается обнаружить, а количество белка снижается с 34 до 18% [1]. Специальные эксперименты по влиянию сроков хранения на уровни содержания лишайниковых кислот не проводились, но в гербарных образцах нескольких видов р. Ever-nia показано присутствие усниновой кислоты [2]. В слоевищах Cladonia stellaris, хранившихся около 10 лет, содержание этой кислоты варьировало в зависимости от места и времени сбора от 0,37 до 2,17% [3]. В 66 исследованных гербарных образцах Parmelia vagans Nyl. [= Xanthoparmelia camschadalis (Ach.) Nyl.] найдены усниновая, салациновая и норстиктовая кислоты [4].
Недавно в свежесобранных лишайниках разной таксономической принадлежности были обнаружены низкомолекулярные биологически активные вещества из группы микотоксинов [5—7]. Эти метаболиты продуцируют микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Alternaria [8] для которых лишайники могут служить экологической нишей [9].
Цель данной работы — сравнительная оценка уровней содержания вторичных метаболитов, принадлежащих к микотоксинам, в гербарных и свежесобранных образцах нескольких видов эпигейных лишайников.
Материалы и методы
В работе использовали 7 видов эпигейных лишайников — Cladonia stellaris (Opiz) Pouz et Vezda, C. rangiferina (L.) F.H. Wigg., Allocetraria cucullata (Bellardi) Randl. et Saag, A. nivalis (L.) Randl. et Saag, Cetraria islandica (L.) Ach., Peltigera canina (L.) Willd. и Nephroma arcticum (L.) Torss. Исследовано 46 фрагментов от образцов лишайников, хранящихся в гербарии им. Д.П. Сырейщикова (MW) Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Для сравнения слоевища соответствующих видов лишайников в количестве 100 образцов были собраны в 2010 г. в Мурманской обл. и на полуострове Таймыр.
В образцах проводили определение количественного содержания 10 вторичных метаболитов, относящихся к группе микотоксинов: дезоксиниваленола (ДОН), диацетоксисцирпенола (ДАС), зеараленона (ЗЕН), альтернариола (АОЛ), цитринина (ЦИТ), стеригматоцистина (СТЕ), циклопиазоновой кислоты (ЦПК), микофеноловой кислоты (МФК), эмодина (ЭМО) и PR-токсина (PR) с помощью непрямого конкурентного иммуноферментного анализа по методике, описанной в работе [7]. Слоевища лишайников измельчали, экстрагировали смесью ацетонит-рила в воде в объемном соотношении 84 : 16, интен-
* Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены, экологии РАСХН, г. Москва.
сивно встряхивали, выдерживали 14—16 ч при комнатной температуре и еще раз перемешивали. Соотношение навески и раствора составляло 1 : 10 (г/мл). Полученные экстракты перед анализом разбавляли в 10 раз 0,15 М фосфатно-солевым буфером (рН 7,5), состоящим из 0,01 М №2ИР04, 0,14 М и
0,05% Твин 20.
Результаты и обсуждение
Из 6 метаболитов, наиболее часто встречающихся у С1айоп1а $1е11ат1$, ДАС, СТЕ и ЭМО обнаружены во всех исследованных гербарных образцах и в соответствующих количествах, а по остальным частота случаев подтверждения снижалась в ряду АОЛ, МФК, ЦИТ (табл. 1). Уровни содержания этих веществ в гербарных образцах соответствовали количественному диапазону, найденному для свежесобранных слоевищ.
У С. га^1/вг1па из 4 регулярно обнаруживаемых веществ СТЕ и ЭМО находили во всех без исключения образцах, в том числе в сборе 1910 г . из Забайкалья. Количество ЭМО здесь было более чем в 2 раза выше предельного уровня накопления у свежесобранного лишайника (табл. 2). Положительными по содержанию АОЛ были два из 3 гербарных
образцов, по МФК — 1, но с количеством на порядок выше, чем в слоевищах 2010 г. Редко встречающиеся метаболиты (ДАС, ЦПК) также находили в гербарных образцах, при этом в некоторых случаях даже в больших количествах, чем в слоевищах, собранных в 2010 г. По отсутствующим в образцах сравнения ДОН и ЭА получены положительные результаты для гербарных образцов из восточных районов России.
Для лишайников р. Allocetraria с 5 характерными метаболитами — ДАС, АОЛ, СТЕ, МФК и ЭМО полное воспроизведение наблюдалось у A. nivalis по АОЛ, СТЕ, МФК и ЭМО, у A. cucullata — по СТЕ, МФК и ЭМО, а АОЛ не был найден ни в одном из образцов (табл. 3, 4). Такие же исключения наблюдались и для ДАС. Этим видам свойственно нерегулярное обнаружение всех других веществ, поэтому редкие положительные результаты поиска в гербарных образцах вполне понятны.
Для 3 наиболее частых в свежесобранных слоевищах Cetraria islandica метаболитов АОЛ, СТЕ и ЭМО представленность в гербарных образцах выражена в полной мере для ЭМО, с одним исключением для СТЕ и с тремя — для АОЛ (табл. 5). Тот факт, что редкие в образцах сравнения метаболиты — ЦИТ, ЦПК, МФК, ДАС — в гербарных образ-
Таблица 1
Содержание вторичных метаболитов грибов в образцах Cladonia stellaris
Место и год
n+, диапазон содержания веществ, нг/г
сбора образцов ДАС АОЛ ЦИТ СТЕ МФК ЭМО
Мурманская обл., 2010 г. (п = 30) 27 100—355 17 37—1260 17 41—89 30 42—200 28 35—132 21 100—8910
Якутская АССР, 1938 251 40 — 100 78 631
Якутская АССР, 1938 100 200 — 126 — 2510
Читинская обл., 1958 285 50 — 129 — 157
Читинская обл., 1958 234 — — 79 — 1000
Якутская АССР, 1961 282 — — 126 — 178
Якутская АССР, 1961 151 519 — 48 63 1290
Мурманская обл., 1983 178 — — 141 — 132
Читинская обл., 1987 288 — 50 112 56 100
Таблица 2
Содержание вторичных метаболитов грибов в образцах Cladonia rangiferina
Место и год n+, диапазон содержания веществ, нг/г
сбора образцов ДОН ДАС АОЛ ЦИТ СТЕ ЦПК МФК ЭА ЭМО
Мурманская обл., 2010 (п = 13) — 1 124 5 45—200 3 40—98 10 15—417 1 219 8 41—76 — 12 45—638
Забайкалье, 1910 — 100 — — 15 407 562 794 1640
Читинская обл., 1987 129 153 89 — 8 — — — 684
Мурманская обл., 2000 — — 62 — 48 — — — 119
Таблица 3
Содержание вторичных метаболитов грибов в образцах Allocetraria nivalis
Место и год сбора образцов n+, диапазон содержания веществ, нг/г
ДАС АОЛ ЦИТ СТЕ ЦПК МФК ЭМО
Мурманская обл., 2010 (п = 11) 10 100-202 7 44-1000 3 45-66 11 63-631 - 11 50-151 11 193-1905
Южный Урал, 1927 - 355 61 102 - 1259 12 580
Коми АО, 1927 - 124 - 79 - 98 1290
Читинская обл., 1933 112 529 66 120 - 204 1445
Алтайский заповедник, 1935 158 298 51 282 108 110 28 185
Иркутская обл., 1941 100 59 - 98 - 102 15 850
Тувинская АО, 1946 - 71 47 74 - 72 1000
Мурманская обл., 1971 - 50 - 78 - 88 543
Магаданская обл., 1974 117 148 126 126 - 275 1820
Таблица 4
Содержание вторичных метаболитов грибов в образцах Allocetraria cucullata
Место и год сбора образцов n+, диапазон содержания веществ, нг/г
ДОН ДАС ЗЕН АОЛ ЦИТ СТЕ МФК ЭА ЭМО
Таймыр, 2010, п = 4 - 3 135-1 86 2 50; 64 3 98-15 3 2 38; 40 4 40-90 4 36-25 4 - 4 63-51 3
Забайкалье, 1923 - 112 - 126 - 51 200 19 288
Восточные Саяны, 1929 - - - 40 - 78 158 - 398
Восточные Саяны, 1937 - 100 - 164 40 98 114 - 513
Мурманская обл., 1971 98 98 - - - 48 74 - 229
Магаданская обл., 1975 - 178 - 1259 50 66 190 - 2818
Таблица 5
Таблица 5
Содержание вторичных метаболитов грибов в образцах Cetraria islandica
Место и год сбора образцов n+, диапазон содержания веществ, нг/г
ДОН ДАС АОЛ ЦИТ СТЕ ЦПК МФК ЭА ЭМО
Мурманская обл., 2010 (п = 12) - 1 170 11 54-1000 3 40-71 9 20-313 2 102; 126 2 62; 104 - 11 100-962
Московская губ., 1912 100 - - 45 20 355 64 - 630
Московская губ., 1925 138 155 50 64 32 372 190 158 1620
Нижегородская губ., 1926 112 100 88 50 43 394 86 - 87
Архангельская губ., 1927 127 - 40 80 12 610 64 - 51
Мурманская обл., 1961 - - - 52 9 263 - - 794
Мурманская обл., 1971 - - - 50 - 363 104 - 380
цах встречались повсеместно (ЦИТ и ЦПК), за единичным исключением (МФК) или несколько реже (ДАС), по-видимому, связан с географической неоднородностью и малыми выборками материала. Более того, ДОН и ЭА, которые не удалось найти в этом лишайнике в 2010 г., присутствовали в са-
мых старых гербарных образцах слоевищ, собранных в 1912-1927 гг.
У всех рассмотренных выше видов лишайников в морфологическом строении есть как общие черты, так и некоторые отличия. С1айота $1в11ат и С. гап-giferina имеют кустистое слоевище с ложным ко-
Таблица 6
ровым слоем и полостью внутри, а в качестве фо-тобионта — зеленую водоросль Trebouxia [10]. Allo-cetraria nivalis, A. cucullata и Cetraria islandica — кустистое уплощенное слоевище с хорошо развитым с обеих сторон лопастей коровым слоем, с фото-бионтом Trebouxia [11]. Сохранность веществ исследуемой группы у них одинаково высока, некоторые отличия наблюдаются только в отношении качественного состава и уровней накопления этих метаболитов.
У Peltigera canina в самом старом из исследованных образцов 1902 г. из Иркутской губернии присутствовали все три характерных метаболита — АОЛ, СТЕ и ЭМО, в остальных — всегда СТЕ и ЭМО и реже — АОЛ (табл. 6). Морфологической особенностью этого лишайника с листоватым слоевищем является то, что коровый слой развит только с верх-
ней стороны и фотобионтом является цианобакте-рия Nostoc. Возможно, это имеет отношение к малому числу встречающихся в нем метаболитов, но явно не влияет на их сохранность, ее следует признать высокой.
Для вида Nephroma arcticum, которому свойственно наибольшее многообразие в составе присутствующих метаболитов микромицетов, в гербарных образцах сохраняются эти черты (табл. 7). Из 7 наиболее типичных соединений во всех случаях обнаружены АОЛ, ЦИТ, СТЕ, МФК, ЭМО и за немногими исключениями — ЦПК и ДАС. Для остальных метаболитов встречаемость была хотя и ниже (ЗЕН, ДОН, PR), но, как правило, количества оставались в рамках ожидаемого диапазона. Листоватое слоевище этого лишайника имеет хорошо развитый с обеих сторон коровый слой и два фотобионта — зеленую водоросль Coccomyxa и во внутренних це-фалодиях — цианобактерию Nostoc [12]. Накопление обширного спектра вторичных метаболитов отличает его от других видов, но по сохранности этих веществ он не имеет особенностей.
Таким образом, у морфологически отличающихся видов лишайников наблюдаются особенности в разнообразии и уровнях содержания вторичных метаболитов из группы микотоксинов. Однако независимо от таксономической принадлежности организмов эти вещества одинаково хорошо сохраняются в сухих слоевищах и могут быть обнаружены даже в образцах, собранных в начале прошлого века. Результаты анализа гербарных образцов с длительными сроками хранения подтверждают возможность эффективной консервации метаболитов грибов в лишайниках. Расшифровка особых биохимических механизмов, обеспечивающих сохранность продуктов вторичного обмена при удалении организма из среды естественного обитания, может стать новым важным этапом развития фундаментальных исследований в лихенологии.
Таблица 7
Содержание вторичных метаболитов грибов в образцах Nephroma arcticum
Место и год сбора образцов n+, диапазон содержания веществ, нг/г
ДОН ДАС ЗЕН АОЛ ЦИТ СТЕ ЦПК МФК ЭМО PR
Мурманская обл., 2010 (п = 25) 5 200—525 25 112—785 20 40—151 25 129—2600 25 63—345 25 56—631 25 141—638 25 700—5012 25 1914—23 380 7 100—193
Коми АО, 1927 90 — — 97 180 30 184 1000 2500 —
Тюменская обл., 1962 89 141 — 229 178 61 190 1288 3273 —
Мурманская обл., 1962 — — — 158 155 23 200 785 5623 —
Мурманская обл., 1971 — 190 — 305 182 28 162 977 6310 —
Мурманская обл., 1971 209 108 112 1122 127 67 174 1230 3548 153
Магаданская обл., 1974 — 251 75 363 52 23 — 1000 22 390 507
Мурманская обл., 1983 98 195 48 245 190 87 309 1905 6310 —
Содержание вторичных метаболитов грибов в образцах Peltigera canina
Место и год сбора образцов n+, диапазон содержания, нг/г
АОЛ СТЕ ЭМО
Мурманская обл., 2010 (п = 5) 2 158; 158 5 25—102 4 251—417
Иркутская губ., 1902 64 38 398
Владимирская губ., 1913 — 95 120
о. Валаам, 1915 46 18 204
Восточно-Казахстанская обл., 1953 — 316 214
Мурманская обл., 1962 — 41 331
Магаданская обл., 1974 — 335 168
Хабаровский край, 1976 — 442 309
Мурманская обл., 1994 — 72 132
Соловецкие о-ва, 1996 — 9 50
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Corradi da Silva M., Iacomini M, Jablonski E, Go-rin Ph.A.J. Carbohydrate, glycopeptide and protein components of the lichen Sticta sp. and effect of storage // Phytoc-hemistry. 1993. Vol. 33. N 3. P. 547-552.
2. Culberson Ch.F. The lichen substances of the genus Evernia // Phytochemistry. 1963. Vol. 2. N 4. P. 335—340.
3. Равинская А.П., Вайнштейн E.A. Хематаксономи-ческое значение изменений содержания лишайниковых кислот // Новости систематики низших растений. 1975. Т. 12. С. 266—273.
4. Шапиро И.А. Содержание усниновой кислоты в лишайнике Parmelia vagans Nyl. // Растительные ресурсы. 1977. Т. 13. Вып. 3. С. 463—466.
5. Буркин А.А., Кононенко Т.П. Первые сведения о контаминации ягеля микотоксинами // Иммунология, аллергология, инфектология. 2010. № 1. С. 185—186.
6. Буркин А.А., Кононенко Т.П. Контаминация ягеля микотоксинами // Докл. Рос. акад. с.-х. наук. 2011. № 2. С. 56—58.
7. Кононенко Т.П., Буркин A.A., Толпышева Т.Ю. Им-муноферментный анализ вторичных метаболитов микро-мицетов в составе лишайниковых веществ // Прикладная биохим. и микробиол. 2012. Т. 48. № 1. С. 81-89.
8. Moreau C, Mould S. Toxins and food. Chichester; New York; Brisbane; Toronto: John Wiley & Sons, 1979. 477 p.
9. Girlanda M, Isocrono D, Bianco C, Luppi-Mosca A.M. 1997. Two foliose lichens as microfungal ecological niches // Mycologia. Vol. 89. N 4. P. 531-536.
10. Трасс Х.Х.Сем. Cladoniaceae // Определитель лишайников СССР. 1978. Вып. 5. С. 7-79.
11. Рассадина К.А. Сем. Parmeliaceae // Определитель лишайников СССР. 1971. Вып. 1. С. 282-386.
12. Домбровская A.B. Сем. Peltigeraceae incl. Nephroma-taceae // Определитель лишайников СССР. 1975. Вып. 3. С. 139-196.
Поступила в редакцию 21.06.11
SAFETY OF FUNGAL SECONDARY METABOLITES
IN HERBARIAL LICHEN SPECIMENS
A.A. Burkin, T.Yu. Tolpysheva, G.P. Kononenko
Fresh and taken from herbarium thalli of epigeous lichens Cladonia stellaris, C. rangiferina, Allocatraria nivalis, A. cucullata, Cetraria islandica, Peltigera canina, Nephroma arcticum were studied by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). There were found no significant differences in the content of secondary metabolites belonging to mycotoxins deoxynivalenol, diaceto-xyscirpenol, zearalenone, alternariol, citrinin, sterigmatocystin, cyclopiazonic acid, mycophenolic acid, emodin, PR-toxin. Revealing of these substances in specimens kept in herbarium for some decades testify to an effective system of conservation of metabolic products in lichens.
Key woods: lichens, mycotoxins, herbarium.
Сведения об авторах
Буркин Алексей Анатольевич — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН. Тел.: 8-499-256-80-31.
Толпышева Татьяна Юрьевна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-27-22, e-mail: tolpysheva@mail.ru
Кононенко Галина Пантелеевна — докт. биол. наук, зав. лаб. микотоксикологии Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН. Тел.: 8-499-256-80-31; e-mail: kononenkogp@mail.ru
