BECTH. МОСК. ÓH^A. СЕР. 1б. БИОЛОГИЯ. 2014. № 3
37
МИКОЛОГИЯ И АЛЬГОЛОГИЯ
УДК 582.29; 582.24+582.28-11; 636.085.19:599.735.3
МИКОТОКСИНЫ, УСНИНОВАЯ КИСЛОТА И ИХ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В ЛИШАЙНИКАХ РОДОВ CETRARIA, FLAVOCETRARIA, CLADONIA
Т.Ю. Толпышева
(кафедра микологии и альгологии; e-mail: tolpysheva@mail.ru)
В талломах лишайников 4 видов Cladonia, 2 видов Cetraria, 2 видов Flavocetraria методом иммуноферментного анализа исследовано содержание и характер распределения микотокси-нов и усниновой кислоты. Установлены статистически значимые различия между содержанием некоторых микотоксинов в верхних и нижних участках талломов. Уровни микотоксинов в нижних, более старых частях талломов были выше, чем в верхних, более молодых. Сравнение образцов лишайников одного и того же вида, собранных в разные годы в одном месте, не выявило достоверно значимых различий в содержании микотоксинов как в верхних, так и нижних частях талломов. Статистически значимые различия по содержанию усниновой кислоты выявлены только у C. stellaris. В верхней части подециев концентрация усниновой кислоты выше, чем в нижней.
Ключевые слова: лишайники, микотоксины, усниновая кислота.
Начиная с XX в. в лишайниках стали находить низкомолекулярные биологически активные вещества, относящиеся к группе микотоксинов. Эмодин был выявлен в Xanthoria aureola [1, 2], X. ulophyllodes [2], Asahinea chrysantha [3], Cetraria cucullata [4]; диаце-токсисцирпенол, цитринин, стеригмоцистин и мико-феноловая кислота — в слоевищах лишайников разных таксономических групп; альтернариол — у изолированного микобионта лишайника Graphis cognate [5]. 15 микотоксинов обнаружено в смеси видов рода Cladonia секции Cladina, являющихся в зимний период основной пищей северного оленя [б, 7]. B настоящее время спектр видов лишайников и определенных в них микотоксинов расширился [8, 9].
Микотоксины вызывают заболевания животных. Лишайники составляют основу кормовой базы северного оленеводства. Питаясь, олени скусывают верхушки эпигейных лишайников, поэтому выяснение характера распределения микотоксинов в талломах лишайников имеет существенное практическое значение.
Материалы и методы
Лишайники родов Cetraria, Flavocetraria, Cladonia секции Cladina и C. sulphurina (Michx.) Fr. были собраны в 2010 и 2012 гг.: C. sulphurina и Flavocetraria nivalis (L.) Kärnefelt & A. Thell — в Карелии, F. cucullata (Bellardi) Kärnefelt & A. Thell и Cetraria laevigata Rass. — на Таймыре, C. islandica Ach. — на Таймыре и в Тверской обл., Cladonia rangiferina (L.) F.H. Wigg и С. arbuscula (Wallr.) Flot. — в Тверской обл. и Карелии, C. stellaris (Opiz) Pouzar & Vëz-
ёа — в Тверской и Мурманской (в том числе на территории Лапландского заповедника) областях, в Республике Коми (Печеро-Илычский заповедник). Лишайники собирали во второй половине лета. Подеции кладоний и талломы видов сем. РагшеИасеае, используемые в опытах, делили на 2 неравные части: верхняя часть представляла собой 2/3 высоты лишайника, нижняя — 1/3 высоты. Определение вторичных метаболитов, относящихся к группе микотоксинов, проводили в ближайший после сбора материала месяц.
Концентрацию 16 вторичных метаболитов: альтер-нариола (АОЛ), афлатоксина В1 (АВ1), дезоксинивале-нола (ДОН), диацетоксисцирпенола (ДАС), зеаралено-на (ЗЕН), микофеноловой кислоты (МФК), охраток-сина А (ОА), РЯ-токсина (РЯ), стеригматоцистина (СТЕ), Т-2 токсина (Т-2), фумонизина В1 (ФУМ), циклопиазоновой кислоты (ЦПК), цитринина (ЦИТ), эмодина (ЭМО), эргоалкалоидов (ЭА), роридина А (РоА) определяли методом непрямого конкурентного ИФА по методике, описанной ранее [9]. Определение концентрации усниновой кислоты проводили в тех же экстрактах [10].
Статистическую обработку материала проводили с использованием программы 81аИ8Иса 8,0. Для сравнения средних значений применяли критерий Стью-дента (1-критерий). Достоверно различающимися считались значения 95%, доверительные интервалы которых не перекрывались. В случае если распределение отличалось от нормального, использовали непараметрический критерий с тем же уровнем значимости (критерий Вилкоксона).
38
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2014. № 3
Результаты и обсуждение
По качественному составу микотоксинов исследованные виды лишайников различались. Наибольшее число микотоксинов найдено у C. islandica (13), наименьшее (3) — у F. cucullata. У видов рода Clado-nia их число варьирует от 4 до 6 (табл. 1). Общими для всех исследованных видов лишайников были МФК и ЭМО. Четыре микотоксина (Т-2, ЗЕН, ФУМ, ОА) встречались в C. islandica редко, как правило, в следовых количествах, в некоторых образцах их уровень был на грани чувствительности метода, поэтому они не были включены в статистический анализ. Из 13 проб PR найден в 5 пробах только в нижней части (min — 155 нг/г, среднее — 233,6 ± 45,3 нг/г, max — 398 нг/г), а в верхней части не выявлен. Также в нижней части один раз (в количестве 143 нг/г) этот микотоксин присутствовал у Flavocetraria nivalis. Сравнение с ранее полученными данными [8, 9] не выявило новых микотоксинов у этих видов лишайников и еще раз показало, что наряду с постоянно встречающимися микотоксинами (например, у C. ran-giferina это АОЛ, СТЕ, ЭМО) имеются микотоксины, которые присутствуют в этих организмах эпизодически.
Уровни одних и тех же микотоксинов у разных видов лишайников варьируют, но везде концентрация микотоксинов в нижних частях слоевищ и в подециях выше, чем в верхних, и для большинства микотоксинов эти различия были статистически значимы (табл. 1, 2). Достоверные различия показаны у F. cucullata для МФК и АОЛ, у F. nivalis для СТЕ и ЭМО, у C. laevigata для ЦПК, ЭМО, АОЛ. У C. islandica из 8 выявленных микотоксинов различия в верхней и нижней частях статистически значимы для 6. Исключение только по ЦИТ и ДОН (табл. 2). У видов рода Cladonia секции Cladi-na также для большинства микотоксинов найдены достоверные различия; исключение МФК и ЭА для C. rangi-ferina и ЦИТ и ЦПК для C. stellaris. В подециях C. sulphurina достоверные различия в содержании веществ выявлены только для МФК (табл. 1). Таким образом, распределение микотоксинов в слоевищах не зависело ни от таксономической принадлежности лишайников, ни от строения талломов (например, дорсовентральное — виды сем. Parmeliaceae, радиальное — виды рода Cladonia).
Сравнительный анализ как верхних частей талломов лишайников одних и тех же видов, собранных в раз-
ные годы в одном месте, так и их нижних частей между собой не выявил достоверно значимых различий в содержании микотоксинов. В то же время характер распределения микотоксинов в талломах (верх-низ) лишайников сохранялся.
В отличие от микотоксинов количество уснино-вой кислоты в разных частях слоевищ лишайников достоверно не различалось. Исключение C. stellaris. У этого вида концентрация усниновой кислоты в верхней части подециев была значительна выше по сравнению с нижней (табл. 3). Достоверное снижение содержания усниновой кислоты по направлению к нижней части у Cladonia alpestris (современное название C. stellaris) отмечали ранее А.П. Равинская и Е.А. Вайнштейн [11]. Более высокие значения этого вещества в верхних, молодых частях подециев по сравнению с нижними, старыми частями этого вида лишайника показала также Е.Н. Моисеева [12].
Продуцентами микотоксинов являются митофто-ровые грибы (раньше их называли несовершенные
Таблица 1
Содержание микотоксинов (нг/г) в видах рода Cladonia
Мико-токсины Верхняя часть таллома Нижняя часть таллома
среднее max min среднее max min
C. rangiferina (n = 14)
АОЛ* 97,9 ± 23,0 316 22 622,1 ± 247,0 3550 59
СТЕ* 67,8 ± 27,9 316 8 361,7 ± 114,4 1260 10
МФК 43,3 ± 5,1 64 4 69,0 ± 13,8 184 4
ЭА 14,2 ± 7,6 33 2 41,5 ± 7,6 63 30
ЭМО* 328,5 ± 147,8 2000 30 889,9 ± 258,5 3310 81
C. stellaris (n = 25)
АОЛ* 131,4 ± 33,2 501 24 695,6 ± 171,2 3550 79
ЦИТ 68,7 ± 19,6 394 22 94,1 ± 13,5 257 32
СТЕ* 143,1 ± 33,5 708 28 627,5 ± 119,7 2510 31
ЦПК 187,2 ± 18,5 266 128 236,2 ± 31,2 316 156
МФК* 90,1 ± 20,1 473 20 141,4 ±26,3 631 40
ЭМО* 735,9 ± 295,3 6310 50 1998,5 ± 435,6 11220 200
C. arbuscula (n = 5)
АОЛ* 1635,8 ± 593,1 3162 226 3056,6 ± 685,7 5248 1000
СТЕ* 67,4 ± 13,1 103 37 181,0 ± 95,5 562 66
МФК* 58,8 ± 3,5 70 49 111,0 ± 16,9 151 54
ЭМО* 1072,6 ± 105,0 1390 776 1759,8 ± 313,1 2818 1079
C. sulphurina (n = 3)
АОЛ 174,3 ± 137,4 449 28 1208,7 ± 478,5 1995 343
ЦИТ 98,0 ± 25,1 141 54 130,3 ± 22,7 155 85
СТЕ 163,0 ± 65,5 294 94 441,0 ± 176,5 794 263
МФК* 148,3 ± 41,8 230 92 322,0 ± 75,5 473 245
ЭМО 1040,0 ± 542,1 2101 316 8078,0 ± 1836,7 10778 4571
ВЕСТН. МОЖ. УН-TA. CEP. 1б. БИОЛОГИЯ. 2014. № 3
39
Удержание ми^те^и^в (нг/г) в видах сем. Parmeliaceae
Мико-токсины Верхняя часть таллома Нижняя часть таллома
среднее max min среднее max min
Cetraria islandica (n = 13)
ДОН 120,4 ± 13,8 172 100 180,3 ± 58,9 298 117
ÄAC* 1б9,7 ± 34,б 240 79 211,7 ± 31,9 381 100
ЦОТ 42,7 ± 8,4 52 2б б8,5 ± 8,4 107 37
CTE* 59,1 ± 1б,7 179 12 228,б ± 54,5 б31 31
ЦПК* 332,0 ± б1,4 б92 102 421,1 ± 83,9 955 100
МФК* 53,4 ± 1б,7 1бб 20 110,1 ± 4б,8 525 40
ЭA* 2,7 ± 0,9 4 1 11,0 ± 4,2 22 2
ЭМО* 237,9 ± 57,5 б02 30 74б,9 ± 13б,б 1985 50
Cetraria laevigata (n = 4)
ЦПК* 202,5 ± 49,9 311 91 374,2 ± 35,9 479 324
МФК 27,0 ± 8,8 49 б 40,2 ± 9,8 б8 22
ЭМО* 54,2 ± 13,б 91 2б 130,7 ± 9,3 158 11б
AОЛ* 33,7 ± б,0 50 21 119,5 ± 19,1 1б0 б8
Flavocetraria nivalis (n = 8)
CTE* 175,4 ±41,б 38б б3 353,б ± 85,1 794 50
МФК 10б,б ± 24,0 257 5б 114,7 ± 20,8 200 40
ЦОТ 38,8 ± 11,5 83 22 98,0 ± 2б,б 200 50
AОЛ 230,0 ± 78,5 52б 47 420,7 ± 139,4 1259 27
ЭМО* 1б88,9 ± 1009,7 8710 274 17597,5 ± 3872,3 35012 55б
ÄAC 150,8 ± 18,4 203 б3 199,б ± 28,2 372 132
Flavocetraria cucullata (n = 4)
МФК* 115,7 ± 13,7 151 100 258,2 ± 35,2 320 172
AОЛ* 103,0 ± 10,б 129 78 728 ± 1б0,8 1000 2бб
ЭМО 138,0 ± 21,б 200 100 823,2 ± 423,8 2089 305
грибы) родов Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, обитающие на различных субстратах в природе [13—17]. В качестве контаминантов некоторые виды микроскопических грибов отмечены и в лишайни-
Таблица 2 ках [18]. Многие митофторовые грибы, в том числе и виды родов, способные вырабатывать микотоксины, встречаются в почвах под лишайниками [19—22]. Обитающие в почве микроскопические грибы могли перейти на эпигейные лишайники. Более высокое содержание в верхних частях талломов лишайниковых кислот, которое обычно отмечают исследователи [23—26], может препятствовать проникновению сюда микроскопических грибов. Лишайниковые кислоты избирательно влияют на микроскопические грибы [27] и являются потенциальными агентами, препятствующими проникновению инфекции [28]. Это один из возможных вариантов объяснения наличия микотоксинов и их различного содержания внутри талломов разных видов лишайников. Возможен и другой путь. Изученные виды лишайников имеют кустистые слоевища и часто произрастают на почве куртинами, в которых отдельные особи лишайников соприкасаются друг с другом, а их лопасти и веточки подециев переплетаются. В куртинах дольше сохраняется влага. Тесное соприкосновение слоевищ лишайников способствует в утренние часы капиллярному подъему воды вместе с растворенными в ней веществами из почвы вверх по лишайниковой куртине. В результате капиллярного поднятия воды лишайники могут поглощать микотоксины, находящиеся в почвенных растворах. Лишайники — пойко-логидридные организмы, не имеющие специальных органов для регулирования водообмена. Они пассивно впитывают влагу и так же пассивно ее отдают. Верхушки лишайников высыхают быстрее, чем их нижние части, расположенные ближе к почве, что, возможно, влияет на на-
Таблица З
Удержание ycнинoвoй кистты (нг/г) в лишайниках
Вид лишайника Верхняя часть Нижняя часть
среднее max min среднее max min
Flavocetraria cucullata (n = 4) 1473б,5 ± 40б1,5 2б915 10351 11258,0 ± 997,1 13032 9120
Cetraria islandica (n = 4) 1б,5 ± 5,3 30 4 18,3 ± 7,7 34 1
Cetraria laevigata (n = 4) 11,0 ± 4,1 22 2 12,7 ± 4,0 24 б
*Cladonia stellaris (n = 3) 10242,0 ± 309,4 10715 9бб0 44б7,7 ± 1305,7 7079 31б2
Cladonia rangiferina (n = 7) 17,б ± 4,0 37 б 32,7 ± 1б,8 129 б
Cladonia arbuscula (n = 3) 141,7 ± 7,5 155 129 103,0 ± б,1 114 93
40
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2014. № 3
копление микотоксинов верхними и нижними частями талломов. Для понимания механизмов накопления микотоксинов лишайниками требуются дальнейшие углубленные исследования.
Автор выражает благодарность А.А. Буркину за определение микотоксинов, Е.Ю. Благовещенской за консультацию по статистической обработке, Г.П. Коно-ненко и И.И. Сидоровой — за обсуждение результатов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Plattelli M., Nicola M.G. Anthraquinone pigmets from Xanthoria parietina (L.) // Phytochemistry. 1968. Vol. 7. N 7. P. 1183-1187.
2. Кривощекова O.E., Максимов О.Б., Мищенко Н.П., Степаненко Л.С. Антрахиноны лишайников Xanthoria aureola и X. ulophilloides // Химия природнык соединений. 1981. № 1. С. 96-97.
3. Мищенко Н.П., Степаненко Л.С, Кривощекова O.E., Максимов О.Б. Антрахиноны лишайника Asahinea chry-santha // Химия природных соединений. 1980. № 2. С. 160-165.
4. Krivoshchekova O.E., Maximov O.B., Stepanenko L.S., Mishchenko N.P. Quinones of the lichen Cetraria cucullata // Phytochemistry. 1982. Vol. 21. N 1. P. 193-196.
5. Tanahashi T., Takenaka Y., Nagakura N., Hamada N. 6H-Dibenzo[b, d]pyran-6-one derivaties from the cultured lichen mycobionts of Graphis spp. and their biosyntetic origin // Phytochemistry. 2003. Vol. 62. N 1. P. 71-75.
6. Буркин A.A., Кононенко Г.П. Первые сведения о контаминации ягеля микотоксинами // Иммунология, аллергология, инфектология. 2010. № 1. С. 185-186.
7. Буркин A.A., Кононенко Г.П. Контаминация ягеля микотоксинами // Докл. РАСХН. 2011. № 2. С. 56-58.
8. Burkin A.A., Tolpysheva T.Yu., Kononenko G.P. Preservation of secondary fungal metabolites inherbarium lichen spesimens // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2012. Vol. 67. Iss. 3-4. P. 121-125.
9. Kononenko G.P., Burkin A.A., Tolpysheva T.Yu. Enzyme immunoassay of the secondary metabolites of micromy-cetes as components of lichen substances // Appl. Biochem. Microbiol. 2012. Vol. 48. N 1. P. 71-76.
10. Буркин A.A., Кононенко Г.П, Толпышева Т.Ю. Им-муноферментный анализ усниновой кислоты в лишайниках // Прикладная биохим. и микробиол. 2013. Т. 49. № 3. С. 322-328.
11. Равинская A.n., Вайнштейн E.A. Хемотаксономи-ческое значение изменений содержания лишайниковык кислот // Новости систематики низших растений. 1975. Т. 12. С. 266-273.
12. Моисеева E.H. К вопросу о локализации ферментов и лишайниковых кислот в слоевище лишайников // Бот. журн. 1959. Т. 44. № 8. С. 1128-1134.
13. Moreau C. Moulds. Toxins and Food. Chichester; New-York; Brisbane; Toronto: John Wiley & Sons, 1979. 477 p.
14. Klich M.A. Identification of common Aspergillus species // Centraalbureau voor Schimmelcultures, Ultrecht, the Netherlands. Wageningen, Ponsen Looijen, 2002. 116 p.
15. Samson R.A., Frisvad J.C. Penicillium subgenus Penicillium: new taxonomic schemes, mycotoxins and other extro-lotes // Stud. Mycol. 2004. Vol. 49. 260 p.
16. Кононенко Г.П, Буркин A.A. Токсинообразующая способность грибов рода Aspergillus и оценка загрязненности циклопиазоновой кислотой кормовой продукции // Микол. и фитопатол. 2008. Т. 42. № 2. С. 178-184.
17. Буркин A.A., Кононенко Г.П. Продуценты ми-кофеноловой кислоты в силосованнык и зерновык кормах // Прикладная биохим. и микробиол. 2010. Т. 46. № 5. С. 592-598.
18. Girlanda M., Isocrono D., Bianco C., Luppi-Mos-ca A.M. Two foliose lichens as microfungal ecological niches // Mycologia. 1997. Vol. 89. N 4. P. 531-536.
19. Толпышева Т.Ю. К изучению почвенных грибов боров-беломошников побережья Кандалакшского залива // Новости систематики низших растений. 1979. Т. 16. С. 108-113.
20. Толпышева Т.Ю. Влияние лишайников на видовой состав почвенных микроскопических грибов лишайниковык сосняков // Ботан. журн. 1979. Т. 64. № 5. С. 705-710.
21. Толпышева Т.Ю. Влияние лишайников на численность почвенных микроскопических грибов лишайниковык сосняков // Бот. журн. 1979. Т. 64. № 8. С. 1341—1344.
22. Толпышева Т.Ю. Влияние лишайников на заселение почв микроскопическими грибами // Микол. и фитопатол. 1979. Т. 13. № 3. С. 194—199.
23. Равинская А.П., Вайнштейн E.A. Хемотаксономи-ческое значение изменений содержания лишайниковык кислот // Новости систематики низших растений. 1975. Т. 12. С. 266—273.
24. Шапиро H.A. Содержание усниновой кислоты в лишайнике Parmelia vagans Nyl. // Растительные ресурсы. 1977. Т. 13. Вып. 3. С. 463—466.
25. Mirando M., Fahselt D. The effect of thallus age and drying procedure on extractable lichen substances // Can. J. Bot. 1978. Vol. 56. P. 1499—1504.
26. Hamada N. The distribution pattern of the medullary depsidone salazinic acid in the thallus of Ramalina siliquosa (lichens) // Can. J. Bot. 1982. Vol. 60. N 4. P. 379—382.
27. Толпышева Т.Ю. Влияние экстрактов из лишайников на грибы. III. Действие усниновой кислоты и атра-норина на рост почвенных грибов // Микол. и фитопатол. 1985. Т. 19. № 6. С. 482—489.
28. Lawrey J.D. The chemical ecology of lichen my-coparasites: a review // Can. J. Bot. 1995. Vol. 73. Suppl. 1. P. 603—608.
Поступила в редакцию 12.11.13
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2014. № 3
41
MYCOTOXINS, USNIC ACID, AND THEIR DISTRIBUTION IN THE LICHENS
BELONGING TO THE GENERA CETRARIA, FLAVOCETRARIA, CLADONIA
T.Yu. Tolpysheva
In thalli of lichens belonging to the genera Cladonia (4 species), Cetraria (2 species) and Fla-vocetraria (2 species), the content and the pattern of distribution of mycotoxins, and also usnic acid were studied using the method of immunoenzymatic analysis. Statistically significant differences were estimated between the upper and the lower parts of the thalli. The levels of the mycotoxins in the lower, older, parts of the thalli were higher than in upper, younger ones. The comparison of lichen specimens belonging to the same species which were collected in the same location in different years did not reveal statistically differences in the content of mycotoxins both in the upper and the lower parts of the thalli. Statistically significant differences in the usnic acid content were revealed only in the case of C. stellaris. In the upper part of the podetia of this species the usnic acid content was higher than in the lower one.
Key words: lichens, mycotoxins, usnic acid.
Сведения об авторах
Толпышева Татьяна Юрьевна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-27-226; e-mail: tolpysheva@mail.ru