CC BY
99
ДАНЬ ЛИ, ЛИ СЯОЛЭЙ,
T.K. КАЛЕНИК, В.В. ГРИЩЕНКО,
А.Г. ВЕРШИНИНА, Л.О. КОРШЕНКО,
Е.В. МЕДВЕДЕВА, КВАН-ХВА ПАК
Соевый молочный продукт, обогащенный легкорастворимыми изофлавонами
Изучено обогащение соевого молока изофлавонами с целью повышения его полезности как диетического продукта. Показано, что термоустойчивый фермент мальтозилтрансфераза из бактерий осуществляет трансфер (остаток мальтозила) из мальтотриозы в гликозиды изофлавона сои in vivo.
Ключевые слова: изофлавоны, растворимость, мальтозилтрансфераза, трансгликозилирование, соя, молоко.
Soy milk product enriched with readily soluble isoflavones. DAN LI, LI
XIAOI.F.I, T.K. KAI.F.NIK, V.V. GRYSHCHENKO, A.G. VERSHININA, L.O. KOR-SHENKO, E.V. MEDVEDEVA, KWAN-HWA PARK
Studied isoflavones enriched soy milk to increase its usefulness as a dietary product. Shown that the thermostable enzyme from the bacterium carries maltozil-transferaza transfer (residue maltose) from maltotriozy in glycosyl soy isoflavones in vivo.
Key Terms: isoflavones, solubility, maltoziltransferaza, transglycosylation, soy,
milk.
Понимание важного значения, которое имеет диета для здоровья человека, привело к осознанию того, что некоторые непитательные вещества в пище способны обеспечить защиту организма от многих болезней. Фитоэстрогены, будучи многофункциональными в царстве растений, представляют большой научный интерес в отношении изучения классов изофлавонов и лигнанов [15]. Эпидемиологические и клинические исследования показали, что диетическое потребление изофлавонов может уменьшить риски гормонально зависимых и независимых раковых образований, сердечно-сосудистых заболеваний, облегчить менопаузальные признаки (прилив крови, остеопороз), предотвратить наследственное хроническое кровотечение из носа и аутоиммунные болезни [1, 3, 17]. Аналогичное воздействие на организм человека в настоящее время выявлено у антиоксидантов гречихи [22].
Изофлавоны чаще всего встречаются в растениях семейства бобовых. В питании населения Юго-Восточной Азии соевые продукты (соевое молоко, тофу, темпе, соевый соус, ростки сои, натто) являются основным источником изофлавонов [10].
В результате исследований в разных странах мира в соевом молоке была выявлена следующая концентрация изофлавонов: по данным ученых из университета штата Айова (США) она составила
12,6-211,3 мг/кг [18]; ученых Великобритании - 69-209 мг/л [21]; Бразилии - 12-83 мг/л [7].
Принимая во внимание рекомендуемую норму ежедневного потребления изофлавонов (60-100 мг), выявленное содержание изофла-вона в соевом молоке следует считать низким. Предположительно это связано с их плохой растворимостью [2, 5].
Одним из авторов настоящей работы гликозид изофлавона сои (дайдцин) был подвержен гликозилированию теплоустойчивой маль-тозилтрансферазой [11]. В качестве субстрата трансгликозилирования использовалась смесь изофлавонов сои. Была подробно изучена растворимость трансгликозилированного изофлавона. Продукты транс-гликозилирования вводились в промышленное соевое молоко, затем исследовалась устойчивость изофлавона в этом молоке, а также оценивались цвет и вкус соевого молока, обогащенного трансгликозили-рованным изофлавоном.
Смесь изофлавонов сои (35 % гликозида изофлавона) была предоставлена фирмой Pulmuone Co, Ltd (Республика Корея), мальтот-риоза приобретена в Sigma (St. Louis, США). Все прочие реагенты были стандартного качества. Соевое молоко закупалось в супермаркете г. Сеула в 2010 г.
Мальтозилтрансферазу готовили по методике, ранее описанной Ли с соавторами [11], анализ действия осуществлялся методом Мейс-нера [14]. Единицей активности (1 U) было принято количество фермента, которое вызвало увеличение спектральной поглощающей способности на 1,0 за 1 мин.
Концентрат белка определялся методом Брэдфорда [4]. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) выполнялся методом Лэммли [9].
Трансгликозилирование осуществлялось следующим образом. Смесь 0,2 мг/мл изофлавонов сои и 0,3 мг/мл мальтотриозы инкубировалась в течение 10 мин при 85 °С в буфере Мак-Илвейна с pH 6,5. Мальтозилтрансфераза была добавлена в раствор в количестве 0,005 U на 1 мг мальтотриозы. Реакция происходила в течение 10 мин при 85 °С, заканчивалась после 15-минутного кипения. Полученный раствор был отфильтрован ватманской бумагой.
Далее проводилась очистка продукта пересадки. С целью поглощения гликозидов изофлавонов в трансгликозилированном растворе и удаления смеси и буфера мальто-олигосахарида использовался столбец C18 (Waters, USA) [20], ранее активированный ацетатом этила, метанолом и водой. Извлеченный метанолом раствор подвергался ультрафильтрации, чтобы удалить денатурированную мальто-зилтрансферазу.
В процессе определения растворимости оставшиеся изофлавоны сои или продукт их пересадки смешивались с 1 мл растворителя в пробирке Эппендорфа при комнатной температуре. Для максимизации растворимости изофлавона использовался ультразвуковой очи-
ститель (5510R-DTH, Branson, Danbury, USA). После обработки ультразвуком при комнатной температуре в течение 1 ч образец был фильтрован мембраной 0,45 мкм (PVDF, MILLIPORE) для последующего определения высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
Регулярно проводились тесты сохранения качества изофлаво-нов. Частично очищенные гликозиды трансгликозилированного изофлавона были добавлены в обычное соевое молоко в концентрации 0,5 мг/мл. После стерилизации при температуре 121 °С в течение 30 мин соевое молоко выдерживалось при комнатной температуре и при нагревании до B0 °С соответственно. Изофлавоны, содержащиеся в соевом молоке, извлекались и определялись каждые 10 дней.
Экстракция изофлавонов осуществлялась следующим образом. В соевое молоко добавляли метанол - B мл метанола к 2 мл молока, -смесь обрабатывалась ультразвуком при 25 °С в течение 1 ч [6], затем фильтровалась мембраной 0,45 мкм (PVDF, MILLIPORE) для последующего определения ВЭЖХ.
Для определения содержания изофлавонов использовались система Waters 600E ВЭЖХ, соединенная со столбцом C1B Nova-Pak 155 мм и с внутренним диаметром 3,9 мм (Waters, Milford, MA), и детектор (UV-Vis SLC 200, Samsung, Seoul, Korea) с 254 нм. Степень экстракции была следующей: в раствор А (вода/метановая кислота, 100/0,1, v/v) было добавлено B0 % метанола; в течение 20 мин раствор Б (метанол/вода/метановая кислота, 50/50/0.1, v/v/v) увеличился постепенно с 20 до 100 %. Текучесть составляла 1,2 мл/мин. Концентрации были вычислены и гликозиды изофлавонов идентифицированы как дайдцин (daidzin), генистеин (genistеin) и глицитеин (glycitein) по калиброваной линии.
Цветовой анализ проводился с помощью измерителя цветовой насыщенности (CR-300, Минолта, Япония). Цвет молока сои определялся согласно CIE L*a*b*-System [13].
Для органолептической оценки качества соевое молоко было кодировано и распределено в произвольном порядке. Образцы оценивали 11 участников публичной дегустации из Национального университета Сеула, отразив свою точку зрения в оценочном листе. При анализе результатов мнения были преобразованы в средние параметры численных значений: цвет, вкус, запах, консистенция, и общие характеристики были оценены как отличные (90-100 %), хорошие (8090 %), средние (70-80 %), плохие (60-70 %).
Как уже сказано, растворимость трансгликозилированного изофлавона изучалась подробно. Агликоны изофлавонов сои: дайдцина, генистеина и глицитеина обладают очень сильными гидрофобными свойствами. В отличие от других флавоноидов дайдцин, генистеин и глицитеин обычно содержат один остаток глюкозила, поэтому у изофлавонов сои низкая растворимость в воде - 0,43 мM.
Таблица 1
Растворимость изофлавонов сои
Изофлавоны сои Растворимость в воде, мМ (25 °С) Относительная растворимость, ед.
Дайдцин 0,0247 1
Дайдцин-7 -О-триглюкозид 1864 7,5х104
Генистеин 0,0229 1
Генистеин-7-О-триглюкозид 1012 4,4х104
Гликозиды 0,4291 1
Трансгликозилированные гликозиды 95,2 222
После трансгликозилирования количество мальтозила, присоединенное к гликозидам изофлавонов сои, изменилось. Растворимость трансгликозилированной смеси изофлавонов, т. е. основных транс-гликозилированных изофлавонов: дайдцина-7-О-триглюкозида, гени-стеина-7-О-триглюкозида - значительно увеличилась по сравнению с естественными изофлавонами, дайдцином и генистеином (табл. 1).
В результате трансгликозилирования изменился состав изофлавонов в соевом молоке. Изофлавоны сои встречаются в нескольких химических формах: генистеин, дайдцин и глицитеин, ацетиловые гликозиды и малониловые гликозиды [8]. Большинство натуральных изофлавонов сои существует в виде гликозидов [19]. В традиционном неферментированном соевом молоке основными изофлавонами являются дайдцин, генистеин и глицитеин. Концентрация дайдцина и генистеина в исследуемом соевом молоке была 0,0818 мг/мл и 0,0944 мг/мл соответственно.
Приведем хроматограмму ВЭЖХ изофлавонов в обычном и обогащенном трансгликозилированными изофлавонами соевом молоке (рис. 1).
После добавления трансгликозилированных изофлавонов структура изофлавонов в соевом молоке стала соответствовать структуре трансгликозилированного продукта. Все пики гликозидов изофлавона были идентифицированы с помощью стандартов (рис. 1,Ь).
Помимо естественных изофлавонов - дайдцина, генистеина и гли-цитеина - полученные трансгликозилированные гликозиды изофлавонов включают генистеин-7-О-триглюкозид, генистеин-7-О-пентаглюкозид, генистеин-7-О-гептаглюкозид, дайдцин-7-О-триглюкозид, дайдцин-7-О-пентаглюкозид и дайдцин-7-О-гептаглюкозид. Для сравнения все транс-гликозилированые изофлавоны были использованы в концентрации
0,426 мг/мл дайдцина, 0,376 мг/мл генистеина. Концентрация глицитеи-на в обоих видах соевого молока была низкая. Трансгликозилированного глицитеина не обнаружено.
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
о
-0.1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
О
-0.1
2 а
: 1>
1
і і і і і
С
О
1 О
10
15 гп п
20
25
30
і і і і і і 1 1 ■— =3=_И!-. 1' 2 ь ІІ
1 1 1 1 1
15
гпп
20
25
30
Рис. 1. Хроматограмма высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) изофлавонов в обычном (а) и обогащенном трансгликозилированными изофлавонами (Ь) соевом молоке: 1 - дайдцин; 2 - генистин; 3 - глицитеин; 4 -генистеин-7-О-триглюкозид; 5 - генистин-7-О-пентаглюкозид; 6 - генистеин-7-О-гептаглюкозид; 7 - дайдцин-7-О-триглюкозид; 8 - дайдцин-7-О-
пентаклюгозид
При добавлении трансгликозилированного изофлавона объем соевого молока 200 мл может обеспечить не менее 100 мг агликонов изофлавонов на человека в день, что соответствует стандарту потребления.
Процедура обработки и условия хранения влияют на устойчивость изофлавонов и определяют их концентрацию в соевых продуктах [23].
При комнатной температуре все изофлавоны в соевом молоке относительно стабильны. После хранения в течение 1 мес концентрация генистеина и трансгенистеина практически не изменилась. По сравнению с дайдцином концентрация трансдайдцина уменьшилась на 10% (рис. 2). Возможно, это обусловлено более высокой антиоксидантной емкостью трансдайдцина. Обнаружено, что высокорастворимый транс-дайдцин защищал другие изофлавоны от потерь при окислении.
5 10 15 20 25 30
5 10 15 20 25 30
сут
Рис. 2. Устойчивость изофлавонов в соевом молоке: 1, 2 - дайдцин (1 - при 80 оС, 2 - при 25 оС); 3, 4 - трансдайдцин (3 - при 80 оС, 4 - при 25 оС); 5, 6 - генистеин (5 - при 80 оС, 6 - при 25 оС); 7, 8 - трансгенистеин (7 - при 80 оС, 8 - при 25 оС)
При нагревании соевого молока до 80 °С количество всех изофлавонов значительно уменьшилось. Трансгликозилированные изо-флавоны оказались более устойчивыми, чем естественные - процент их потерь со временем был ниже (рис. 2).
Экстракция и идентификация соединений желтого цвета из соевого молока показали, что эти пигменты являются изофлавонами [12]. По сравнению с обычным (индекс цветности: Ь* 76,18; а* 1,24; Ь* 17,03) обогащенное изофлавонами (индекс цветности: Ь* 68,23; а* 4,30; Ь* 19,44) соевое молоко было темнее и имело более ярко выраженные оттенки красного и желтого.
Изофлавоны влияют также и на вкус соевых продуктов, вызывая горький привкус [12]. Основными веществами - источниками неприятного привкуса являются глюкозиды сапонинов и изофлавонов. В агликонах изофлавонов неприятный привкус сильнее, чем в глюкозидах [16].
По сравнению с обычным соевым молоком органолептическая оценка качества соевого молока, обогащенного трансгликозилирован-ными изофлавонами (особенно аромат и вкус), улучшилась (табл. 2), однако все изменения были в пределах допустимых норм стандартов. Чтобы получить высокую органолептическую оценку качества, необходимо использовать добавки (приправы, специи и т. д.).
Таблица2
Органолептические показатели качества соевого молока
Качество Балльная оценка
Обычное Обогащенное трансизофлавонами
Цвет 9З,8 90,2
Аромат 93,2 88,1
Вкус - запах 98,3 У9,У
Структура 99,0 99,3
Итого: 99,З 81,У
Таким образом, трансгликозилированные изофлавоны сои легко растворяются в воде и относительно устойчивы в соевом молоке. Соевое молоко, обогащенное трансгликозилированными изофлавонами, содержит достаточное количество изофлавонов для того, чтобы быть полезным для здоровья человека.
Литература
1. Adlercreutz H., Mazur W. Phyto-oestrogens and Western diseases // Ann. Med. 1997. N. 9. P. 95-120.
2. Barnes S. Phyto-oestrogens and osteoporosis: what is a safe dose // Br. J. Nutr. 2003. Р. 898-906.
3. Barns S. Evolution of the health benefits of soy isoflavones // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1998. N. 217. Р. 386-392.
4. Braford M. A rapid and sensitive method for the quantition of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. N 72. Р. 248-254.
5. Branca F., Lorenzetti S. Biological effects of phytoestrogens // XLVI Italian Society of Agricultural Genetics: SIGA Annual Congress. Giardini Naxos, Italy, 2002. Р. 65-69.
6. Eisen B., Ungar Y., Shimoni E. Stability of isoflavones in soy milk stored at elevated and ambient temperatures // J. Agric. Food Chem. 2003. N 51. Р. 2212-2215.
7. Genovese M.I., Lajolo F.M. Isoflavones in soy-based foods consumed in Brazil: Levels, distribution, and estimated intake // J. Ag-ric. Food Chem. 2002. N 50. P. 5987-5993.
8. Kudou S., Fleury Y., Welti D. Malonyl isoflavone glycosides in soybean seed (Glycine max Merrill) // Agric. Biol. Chem. 1991. N 55. P. 2227-2233.
9. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage // Nature. 1970. V. 4, N 227. P. 680-685.
10. Lee M.J., Park O.J. Soy food intake behavior by socio-demographic characteristics of Korean housewives // Nutr. Res. Pract. 2008. N 2. P. 275-282.
11. Li D., Park J.-H., Park J.-T., Park K.-H. Biotechnological synthesis of highly soluble isoflavone glycosides by Thermotoga maritima maltosyltransferase // J. Agric. Food Chem. 2004. N 52. P. 25612567.
12. Matsuura M., Obata A., Fukushima D. Objectionable flavor of soy milk developed during the soaking of soybeans and its control // J. Food Sci. 1989. N 54. P. 602-605.
13. McLaren K. The development of the CIE 1976 (L*a*b*) uniform colour space and colour-difference formula // J. Soc. Dyers and Colourists. 1976. N. 92. P. 338-341.
14. Meissner H., Liebl W. Thermotoga maritima maltosyltransferase, a novel type of maltodextrin glycosyltransferase acting on starch and malto-oligosaccharides // Eur. J. Biochem. 1998. N 250. P. 10501058.
15. Mitchell J.H. Phytoestrogens: involvement in breast and prostate cancer // Handbook of Nutraceuticals and functional foods / ed. R.E.C. Wildman. Boca Raton, FL.: CRC Press, 2001. P. 99-112.
16. Okubo K., Iijima M., Kobayashi Y., Yoshikoshi M., Uchida T., Ku-dou S. Components responsible for the undesirable taste of soybean seeds // Biosci. Biotech. Biochem. 1992. N 56. P. 99-103.
17. Setchell K.D.R., Cassidy A. Dietary isoflavones: biological effects and relevance to human health // J. Nutr. 1999. V. 129. P. 758-767.
18. USDA-Iowa State University Database on the Isoflavone Content of Foods, Release 1.3. 2002. - URL: http://www.nal.usda.gov/fnic/ foodcomp/Data /isoflav/ isfl_tbl.pdf.
19. Wang H.J., Murphy P.A. Isoflavone content in commercial soybean foods // J. Agric. Food Chem. 1994. N. 42. P. 1666-1673.
20. Wang J., Sporns P. MALDI-TOF MS analysis of isoflavones in soy products // J. Agric. Food Chem. 2000. N .48. P. 5887-5892.
21. Wiseman H., Casey K., Clarke D.B., Barnes K.A., Bowey E. Isoflavone aglycon and glucoconjugate content of high- and low soy U.K. foods used in nutritional studies // J. Agric. Food Chem. 2002. N 50. P.1404-1410.
22. Xiolei Li, Dan Li, Shmidt L., Grishchenko V., Kalenik T. Antioxida-tive properties of hydrated ethanol extracts from tartary buckwheat grains as affected by the changes of rutin and quercetin during preparations // J. Med. Plants Res. 2010. N 4. P. 10-16.
23. Xu Z.M., Wu Q., Godber J.S. Stability of daidzin, glycitin, genistin, and generation of derivatives during heating // J. Agric. Food Chem. 2002. N 50. Р. 7402-7406.
© Дань Ли, Ли Сяолэй, Каленик T.K., Грищенко В.В., Вершинина А.Г., Коршенко Л.О., Медведева Е.В., Кван-Хва Пак, 2011 г.
