CC BY
381
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11 2008 Вып. 1
УДК 616-009.7:612.112.3
Н. Н. Петрищев1, Л. В. Васина2, А. В. Луговая2
СОДЕРЖАНИЕ РАСТВОРИМЫХ МАРКЕРОВ АПОПТОЗА И ЦИРКУЛИРУЮЩИХ АННЕКСИН V- СВЯЗАННЫХ АПОПТОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК В КРОВИ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ КОРОНАРНЫМ СИНДРОМОМ
1 Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова
2 Клиническая больница им. Л. Г. Соколова, Санкт-Петербург
Коронарная болезнь сердца является одной из наиболее частых причин смерти и инвалидизации населения развитых стран. Согласно современным представлениям, в основе острого коронарного синдрома чаще лежит нарушение целостности атеро-склеротической бляшки в результате апоптоза эндотелия и тромбоз коронарной артерии [1, 2]. При этом острый инфаркт миокарда является примером заболевания, при котором в реализации основного поражения решающая роль принадлежит апоптозу, являющемуся преобладающей формой гибели миоцитов в период «реперфузии» участка миокарда, ранее подвергшегося ишемии [3]. Исследования в области патофизиологии апоптоза открывают широкие возможности для предупреждения, прогнозирования и лечения многих до сих пор трудно управляемых и порой безнадежных состояний.
Интенсивность исследований проблемы апоптоза в последние годы связана с рядом обстоятельств. Прежде всего появились методические возможности регистрации различных проявлений апоптоза и анализа его молекулярных механизмов, которые тесно связаны с механизмами других актуальных явлений (например, активацией клеток и связанной с ней сигнальной трансдукцией). Кроме того, изучение апоптоза оказалось очень продуктивным для понимания ряда важнейших процессов.
К наиболее важным регуляторам апоптоза относятся индукторы гибели клетки, в частности, поверхностный рецептор Fas (CD95, APO-1), и белки семейства Bcl-2, ингибирующие апоптоз [4].
В последние годы большое внимание уделяется изучению биологической активности белков, относящихся к семейству аннексинов. Аннексин А5, как и другие ан-нексины, не выделяется из нормальных клеток; источником внеклеточного аннексина А5 являются апоптотические и разрушенные клетки [5].
В механизме действия аннексина А5, как и других аннексинов, большое значение имеет их свойство связываться с отрицательно заряженными фосфолипидами, в том числе с фосфатидилсерином (ФС), экспозиция которого на клеточной мембране является одним из ранних признаков апоптоза [6, 7]. Это свойство рекомбинантного аннексина А5 используют для определения и подсчета апоптотических клеток в периферической крови.
Данные об образовании растворимых форм аннексина А5, Apo/1 Fas и Bcl-2 и содержании циркулирующих в периферической крови аннексин V-связанных апоптотических клеток у больных острым коронарным синдромом малочисленны и противоречивы.
© Н. Н. Петрищев, Л. В. Васина, А. В. Луговая, 2008
Целью нашей работы послужило изучение содержания в крови растворимых форм маркеров апоптоза аннексина А5, Apo-1/Fas, Bcl-2 и количества циркулирующих мононуклеаров, подвергшихся апоптозу в крови больных острым коронарным синдромом для уточнения их роли в патогенезе заболевания.
Материалы и методы исследования. В исследование было включено 83 больных (21 женщина и 62 мужчины) с острым коронарным синдромом без тяжелой сопутствующей патологии, средний возраст которых составил 59,8 + 10,5 года. Распределение по возрастным группам было следующим: 40-49 лет — 9 (10,8 %) пациентов, 50-59 лет — 38 (45,7 %), 60-69 лет — 36 (43,3 %) больных. Все обследованные были разделены на 3 группы: в 1-ю группу вошли 47 пациентов, поступивших по поводу нестабильной стенокардии, во 2-ю — 36 больных с острым инфарктом миокарда (из них с зубцом Q — 13 пациентов (36 %), без зубца Q — 23 (63,8 %)). Диагноз инфаркта миокарда (ИМ) основывался на традиционных критериях ВОЗ. При дифференциальной диагностике между ИМ без зубца Q и нестабильной стенокардией ориентировались на уровень сердечного тропонина I.
Первичный инфаркт миокарда перенесли 26 больных (72,2 %), повторный — 10 (27,7 %). Инфаркт миокарда преимущественно передней локализации был диагностирован у 23 больных, нижней локализации—у 13 пациентов. Артериальная гипертензия 1-3-й степени на основании критериев ВОЗ (1999) была определена у 15 (18 %) пациентов, сахарный диабет 2-го типа по критериям European Nid Polici (2000) — у 9 (10,8 %) больных, ожирение I—III стадии по критериям Международной группы по ожирению IOTF (1999)—у 12 пациентов (14,4 %). В 3-ю (контрольную) группу вошли 14 практически здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с больными. Статистически значимых различий по возрасту, полу, основным традиционным факторам риска, осложнениям атеросклероза разной локализации между группами не было.
До поступления в стационар пациенты не получали гиполипидемической терапии.
У всех больных определяли содержание в сыворотке крови липидов и аполипопротеи-нов. Уровень общего холестерина, триглицеридов и холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) измеряли на биохимическом анализаторе SPECTRUM, США. Содержание аполипо-протеинов А-1, В и липопротеина (а) определяли с помощью иммунологического турбидиметри-ческого метода. Растворимые маркеры апоптоза Bcl-2, Apo-1/Fas и аннексин А5 в плазме крови определяли иммуноферментным методом, используя тест-системы фирмы Bender MedSystems, Австрия. С целью исследования ранней стадии апоптоза мононуклеаров периферической крови использовали набор ANNEXIN V-FITC-kit (Bender Medsystems, Австрия), включающий Аннексин V, конъюгированный с флюорохромом — флюоресцеинизотиоционат (Annexin V-FITQ, про-пидиум иодид (PI) и буфер для окрашивания.
При статистическом анализе различий между основной и контрольной группами проводили проверку вариационных рядов на нормальность распределения и однородность дисперсий (критерий Колмогорова-Смирнова, W и F-критерии). В случаях, когда гипотеза нормальности отвергалась, использовали непараметрические критерии Уилкоксона-Манна-Уитни. В остальных случаях расчет проводили с помощью критерия Стьюдента, парного Г-критерия и корреляционного анализа.
Исследование ранней стадии апоптоза мононуклеаров периферической крови с помощью Annexin V-FITS / PI окрашивания осуществляли следующим образом.
1. Выделение мононуклеаров периферической крови
Не позднее чем через 2 ч после получения крови проводили выделение клеток методом центрифугирования в градиенте плотности «Limpholite» (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/см3 (A. Boyum, 1968). Гепаринизированную кровь разводили в два раза раствором хлорида натрия (9 г/л, pH 7,2), наслаивали на 3 мл градиента плотности и центрифугировали 30 мин при 400 g. Образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеаров отбирали пипеткой, полученную клеточную взвесь трижды отмывали раствором хлорида натрия (9 г/л, pH 7,2) и доводили концентрацию до 2 х 106 клеток/мл. Жизнеспособность клеток, которую определяли по связыванию трипанового синего (Н. Р. Ланг, 1976), составляла 95-100 %.
2. Окрашивание мононуклеаров периферической крови
Полученную взвесь мононуклеаров отмывали дважды в холодном фосфатно-солевом буфере (PBS), затем ресуспендировали клетки в рабочем растворе буфера для окрашивания
до концентрации 1 х 106 клеток/мл. Далее переносили 100 мкл клеточной суспензии (1 х 106 клеток/мл) в пробирку емкостью 5 мл, добавляли 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл PI. После этого содержимое пробирки аккуратно перемешивали, инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте. Далее в каждую пробирку добавляли 400 мкл рабочего раствора буфера для окрашивания. Анализировали на проточном цитометре в течение часа после окрашивания.
3. Анализ на проточном цитометре
Цитометрический анализ мононуклеаров проводили на проточном цитофлуориметре PARTEC PAS (Германия). Накопление производили до 5000 событий в лимфоцитарной области. Для настройки режимов компенсации и установки границ квадрантов использовали следующие кон-троли: неокрашенные клетки, клетки, окрашенные только Annexin V-FITC (без PI), клетки, окрашенные только PI (без Annexin V-FITC).
В образце оценивали показатели прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния клеток, интенсивность флуоресценции Annexin V-FITC (FL1) и PI (FL3). После исключения дебриса (по показателям прямого и бокового светорассеяния) и выделения лимфоцитарного гейта определяли количество Annexin+- и PI+-клеток в режиме DotPlot (двумерная гистограмма). Количество апоптотических Annexin+-клеток определяли в нижнем правом квадранте, клетки в позднем апоптозе (Annexin+PI+-клетки) оценивали в верхнем правом квадранте гистограммы.
Сбор данных и компьютерную обработку посуществляли с использованием программы FloMax.
Результаты исследования. Содержание липидов, аполипопротеинов А-1, В и ли-попротеина (а) представлены в табл. 1.
Таблица 1
Показатели липидного обмена у больных с острым коронарным синдромом, М ± m
Показатель Контроль (N = 14) Больные с нестабильной стенокардией (N = 47) Больные с острым инфарктом миокарда (N=36)
Общий холестерин 3,62 ± 0,62 5,97 ± 1,19 6,89 ± 0,86*
Триглицериды 1,96 ± 0,21 2,51 ± 0,14 3,03 ± 0,19
а-холестерин (ЛПВП) 1,92 ± 0,11 0,71 ± 0,15 0,57 ± 0,13*
Аполипопротеин А1 2,93 ± 0,91 2,41 ± 1,09 2,37 ± 0,15
Аполипопротеин В 1,19 ± 0,22 3,18 ± 0,72 3,99 ± 0,33*
Липопротеин (а) Lp(a) 14,1 ± 2,1 32,5 ± 5,61* 33,7 ± 6,92*
* Результат статистически достоверно отличается от контроля (р < 0,05).
Как видно из данных, представленных в табл. 1, у больных с острым коронарным синдромом отмечались нарушения липидного обмена, степень выраженности ко -торых увеличивалась по мере нарастания тяжести заболевания. Обращает на себя внимание достоверное повышение в крови больных общего холестерина, аполипопротеина В и липопротеина (а) и снижение содержания холестерина ЛПВП (а-холестерина). Уро -вень триглицеридов и аполипопротеина А-1 у больных с острым коронарным синдромом практически не отличался от контрольной группы. При оценке особенностей липидного спектра в зависимости от вариантов ИМ достоверной связи с его локализацией не было выявлено. Также не было обнаружено достоверных различий в содержании липидов и аполипопротеинов у больных ИМ с зубцом Q и без него.
Установлено, что липопротеины высокой плотности, основная антиатерогенная фракция липопротеинов, защищают эндотелиальные клетки от апоптоза, тем самым обеспечивая важный и новый аспект своей антиатерогенной активности [8]. Интерес представляет изучение процесса апоптоза мононуклеаров периферической крови в условиях гиперлипопротеинемии и низкого уровня холестерина липопротеинов высокой плотности.
С помощью метода проточной цитофлуориметрии можно выявить самые ранние события процесса апоптоза, уловив стадию, когда «принимается решение» о переходе границы жизнеспособности и самом пути клеточной смерти [9].
Известно, что пропидиум иодид является маркером клеток, находящихся в позднем апоптозе или некрозе (при некрозе происходит нарушение целостности клеточной мембраны, что позволяет Р1 войти в клетку и связаться с ДНК). Существуют также флуоресцентные красители, способные пометить клетки, «решившие» идти по пути апоптоза. Наиболее ранним событием, предваряющим такое решение, является окисление липидов клеточных мембран, происходящее под влиянием избыточной продукции активных форм кислорода. При этом особенно уязвимы ненасыщенные жирно-кислотные хвосты кислых фосфолипидов, представленные в мембранах в основном фосфатидилсерином. Образование гидроперекисей фосфатидилсерина нарушает его взаимодействие с белками цито скелета аннексинами и облегчает миграцию окисленного фосфатидилсерина с внутренней стороны мембранного бислоя на наружную. По этой причине фосфатидилсерин, который в нормальной клетке практически полностью локализован с внутренней стороны бислоя, при индукции апоптоза начинает появляться и с внешней стороны мембраны [10, 11]. Экспрессия фосфатидилсерина на наружной поверхности мембраны наблюдается, начиная с ранней стадии апоптоза до полной деградации клетки. Этим обстоятельством и пользуются исследователи для того, чтобы отличить нормальные жизнеспособные клетки от тех, у которых выявляется готовность к апоптозу.
В качестве соединения, маркирующего апоптозные клетки, используют реком-бинантный белок аннексин V, конъюгированный с флуоресцентным красителем. Обычно с этой целью применяют флуоресцеинизотиоционат, Р1ТС. Таким образом, внесение в клеточную суспензию двух меток — Р1 (для выявления некроза) и аннексина V—Б1ТС (для выявления апоптоза) — позволяет одновременно оценить количество интактных, апоптотических и некротических клеток в данной суспензии (жизнеспособные клетки — отрицательные и по аннексину V, и по Р1; клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза,— положительные по аннексину V и отрицательные по Р1; клетки на поздней стадии апоптоза или уже погибшие — положительные и по аннексину V, и по Р1; погибшие клетки — отрицательные по аннексину V и положительные по Р1.
На рисунке приведены примеры исследования спонтанного апоптоза мононуклеаров периферической крови у здорового донора и у больного с острым инфарктом миокарда.
Дискриминационный анализ типа клеточной смерти: 1-й квадрант — клетки, негативные по аннексину V и позитивные по Р1 — некроз; 2-й квадрант — клетки, позитивные по Р1 и аннексину V-FITC — поздняя стадия апоптоза или некроз; 3-й квадрант — клетки, негативные по Р1 и аннексину V-FITC — жизнеспособные клетки;
Распределение апоптотических и жизнеспособных клеток в режиме Б^Р^ (двумерная гистограмма). По оси абсцисс — интенсивность флуоресценции аннексина V—FITC. По оси ординат —интенсивность флуоресценции Р1.
а — контроль, б—острый коронарный синдром.
1000
100 -=
0,1
! Оа1е: ;01: 1,0 Lympho 1 % 02: 0,12 %
!.д3: 95 ,66 % 04: 3,22 %
0,1
1
1000
100 п
10 100 1000
0,1
! \ 01: 0,3 ЬутрИо 5 % 02: 0,97 %
! (&.::59Х6 38,92 % ......4......... ......... ........
0,1
FL1 Аппехт V
1 10 100 1000 FL1 Аппехт V
4-й квадрант — клетки, позитивные по аннексину У-Р1ТС и негативные по Р1 — ранняя стадия апоптоза.
На приведенных в качестве примера гистограммах распределения клеток в зависимости от их жизнеспособности видно, что в контроле исследуемая клеточная популяция характеризовалась преимущественно живыми и небольшой группой апоп-тотических клеток (95,66 и 3,22 % соответственно) (рис. 1, а). В целом в контрольной группе процент аннексин У+-мононуклеаров составил 4,99 ±1,78 %. У больного с острым инфарктом миокарда выявлено достоверное (р < 0,01) по сравнению с контролем увеличение количества клеток в области, соответствующей ранней стадии апоптоза (квадрант Q4), что отражается в их усиливающейся способности прокрашиваться аннексином V—РГТС (59,76 % живых клеток и 38,9 2% клеток, находящихся в раннем апоптозе) (рис. 1,б). У больных с острым коронарным синдромом содержание мононуклеаров периферической крови, связанных с аннексином V, составило 39,4 ± 8,4%. При этом выявлено достоверное (р < 0,05) увеличение количества апоптотических клеток в группе больных с острым инфарктом миокарда по сравнению с группой больных с нестабильной стенокардией (42,6 ± 4,1 % и 24,9 ± 6,3 % соответственно).
При изучении содержания циркулирующих аннексин ^-мононуклеаров у больных с разной локализацией ИМ были выявлены достоверные различия в значениях при передней и задненижней локализации ИМ, что объясняется, по-видимому, более выраженной активацией каскада иммуновоспалительных процессов, которая происходит в остром периоде локально в миокарде, а также на системном уровне при передних инфарктах миокарда (20,7 ± 5,22 и 33,1 ± 7,86 % соответственно, р< 0,05) [5, 12-15].
При сравнении значений содержания количества апоптотических мононуклеаров при инфаркте миокарда с зубцом Q и без зубца Q нами была отмечена тенденция к их увеличению при ИМ без зубца Q, что, возможно, объясняется более частым развитием данной формы у больных с передней локализацией ИМ (22,4 ± 6,18 и 39,8 ± 9,84 % соответственно, р < 0,05).
При изучении содержания растворимых маркеров апоптоза было установлено, что у больных острым коронарным синдромом отмечается повышение в крови Вс1-2, Лро-1/Ба8 и аннексина А5, нарастающее в зависимости от тяжести заболевания (табл. 2)
Таблица 2
Содержание растворимых маркеров апоптоза при остром коронарном синдроме
Исследуемый показатель Контроль N = 14) Больные нестабильной стенокардией N=47) Больные с острым инфарктом миокарда N=36)
Лро-1/Ра8, пг/мл 1664,01 ± 209,28 1980,41 ± 112,62* 2670,01 ± 162,34**
Вс1-2, МЕ/мл 13,76 ± 3,15 29,10 ± 8,16* 57,83 ± 11,41**
Аннексин А5, нг/мл 0,89 ± 0,11 4,96 ± 0,22* 6,13 ± 1,02*
* Результат статистически достоверно отличается от нормы (р < 0,05). ** Результат статистически достоверно различается между группами больных (р < 0,05).
Из представленных в таблице данных видно, что в контрольной группе содержание Лро-1/Ра8, представляющего собой гликозилированный поверхностный белок, относящийся к суперсемейству рецепторов ФНО-а, составило 1664,01 ± 209,28 пг/мл. В группе больных нестабильной стенокардией отмечалось достоверное нарастание данного показателя (1980,41 ± 112,62 пг/мл). Подобный характер носили изменения содержания в крови Вс1-2, который является внутриклеточным мембраносвязанным белком, блокирующим апоптоз. Уровень данного маркера в крови больных нестабильной
стенокардией составил 29,10 ± 8,16 МЕ/мл. При сравнении уровня Вс1-2 и Лро-1/Ба8, полученных в группах пациентов и в контроле, статистически достоверные различия установлены как в группе пациентов с нестабильной стенокардией (29,10 ± 8,16 МЕ/мл и 1980,41 ± 112,62 пг/мл соответственно, р < 0,05), так и у больных острым инфарктом миокарда (57,83 ± 11,41 МЕ/мл и 2670,01 ± 162,34 пг/мл, р < 0,05). При сравнении содержания Вс1-2 и Лро-1/Ра8 между группами больных выявлены статистически достоверные различия (р < 0,05). При анализе содержания в крови аннексина А5 по сравнению с контролем выявлено достоверное (р < 0,05) повышение данного показателя во всех группах больных и без существенных различий между ними (4,96 ± 0,22 нг/мл у больных нестабильной стенокардией и 6,13 ± 1,02 нг/мл при остром инфаркте миокарда). При изучении содержания маркеров апоптоза у больных с разной локализацией ИМ были установлены достоверные различия в значениях Вс1-2, Лро-1/Ба8 и аннексина А5 при передней и задненижней локализации ИМ, что объясняется, по-видимому, более распространенным поражением миокарда при передних ИМ. Так, содержание Вс1-2 при передней локализации инфаркта составило 59,13 ± 9,67 МЕ/мл, Лро-1/Ба8—2879,01 ± 102,18 пг/мл, аннексина А5—9,12 ± 2,11 нг/мл, при задненижней локализации содержание данных маркеров было следующим: Вс1-2—45,03 ± 8,21 МЕ/мл, Лро-1/Ба8 — 2509,21 ± 72,12 пг/мл, аннексина А5 — 5,42 ± 1,03 нг/мл. При сравнении значений в группах больных с зубцом Q и без зубца Q нами была отмечена тенденция к увеличению содержания данных показателей при ИМ без зубца Q, что, возможно, объясняется более частым развитием данной формы у больных с передней локализацией ИМ.
В целом по группе отмечена положительная корреляция аннексина А5 с уровнем общего холестерина, аполипопротеина В и липопротеина (а) (г = 0,59, р < 0,05; г = 0,63, р < 0,05 и г = 0,69, р < 0,05 соответственно) и отрицательная — с а-холестерином (г = -0,47, р < 0,05). Также установлена положительная корреляция между уровнем аполипопротеина В и содержанием Лро-1/Ра8 и Вс1-2 (г = 0,62, р < 0,05 и г = 0,57, р < 0,05 соответственно). Вместе с этим выявлена положительная корреляция между Вс1-2 и Лро-1/Ра8 с липопротеином (а) (г = 0,49, р < 0,05 и г = 0,67, р < 0,05 соответственно). Кроме того, в наших исследованиях установлена положительная корреляционная связь между уровнем триглицеридов, аполипопротеина В и липопротеина (а) с количеством циркулирующих апоптотических клеток (г = 0,46, р < 0,05; г = 0,64, р < 0,05 и г = 0,71, р < 0,05 соответственно) и отрицательная с уровнем а-холестерина (холестерина липо-протеинов высокой плотности) (г = -0,62, р < 0,05). Наряду с этим нами выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем Лро-1/Ра8 и количеством циркулирующих мононуклеаров в ранней стадии апоптоза (г = 0,64, р < 0,05).
Обсуждение результатов. В результате проведенных исследований у больных ишемической болезнью сердца выявлены свойственные атеросклерозу специфические нарушения липидного обмена, характеризующиеся повышением уровня общего холестерина, триглицеридов, аполипопротеина В и липопротеина (а) и снижением уровня холестерина липопротеинов высокой плотности. При оценке особенностей липидного спектра в зависимости от вариантов ИМ достоверной связи с его локализацией не было установлено. Также не было обнаружено достоверных различий в содержании ли-пидов и аполипопротеинов у больных ИМ с зубцом Q и без него.
При изучении содержания растворимых маркеров апоптоза было установлено, что у больных острым коронарным синдромом отмечается повышение в крови Вс1-2, Лро-1/Ра8 и аннексина А5, а также увеличивается количество циркулирующих ^-мононуклеаров.
При сравнении уровня Bcl-2 и Apo-1/Fas, полученных в группах пациентов и в контроле, статистически достоверные различия выявлены как в группе пациентов с нестабильной стенокардией, так и у больных острым инфарктом миокарда. При сравнении содержания Bcl-2 и Apo-1/Fas между группами больных выявлены статистически достоверные различия. При анализе содержания в крови аннексина А5 по сравнению с контролем обнаружено достоверное повышение данного показателя во всех группах больных независимо от формы ИБС и без существенных различий между ними. Отмечалось достоверное по сравнению с контролем увеличение содержания мононуклеаров периферической крови, находящихся в состоянии апоптоза. При этом констатируется увеличение количества апоп-тотических клеток в группе больных острым инфарктом миокарда по сравнению с группой больных нестабильной стенокардией, также носившее достоверный характер. При изучении содержания маркеров апоптоза у больных с разной локализацией ИМ были выявлены достоверные различия в количестве циркулирующих апоптотических клеток и значениях Bcl-2, Apo-1/Fas и аннексина А5 при передней и задненижней локализации ИМ, что объясняется, по-видимому, более выраженной активацией каскада имму-новоспалительных процессов, которая происходит в остром периоде локально в миокарде, а также на системном уровне при передних инфарктах миокарда [16-18]. При сравнении значений содержания количества аннексин У+-мононуклеаров и растворимых маркеров апоптоза при инфаркте миокарда с зубцом Q и без зубца Q нами была отмечена тенденция к их увеличению при ИМ без зубца Q, что, возможно, объясняется более частым развитием данной формы у больных с передней локализацией ИМ.
Если апоптоз рассматривать как некую альтернативу клеточному делению, обеспечивающую клеточный гомеостаз в сосудистой стенке, то, даже исходя из общих соображений, необходимо допустить, что апоптоз участвует в патогенезе атеросклероза коронарных сосудов сердца. При этом апоптоз должен «работать» практически на всех уровнях процесса: элиминации поврежденных эндотелиальных клеток сосудов, удаления мигрировавших в интиму гладкомышечных клеток, устранения нагруженных липидами пенистых клеток и т. д. И действительно, на финальных стадиях эволюции атеромы, особенно в ядре атеросклеротической бляшки, состояние гиперплазии сменяется гипоплазией [19]. Однако на начальных этапах развития атеросклероза этого не происходит. Martinet W. и соавт. считают, что апоптоз является ключевым фактором в патогенезе атеросклероза. Хотя значение апоптоза для атеросклероза остается неясным, было высказано предположение, что клеточная гибель имеет отношение к нестабильности бляшки, ее разрыву и образованию тромба [13, 19, 20].
Благодаря многим исследованиям в культуре клеток было установлено, что окисленные липопротеины низкой плотности (окисленные ЛПНП) могут стимулировать апоптоз эндотелиоцитов артерий, что включает как митохондриальный, так и рецепторный пути (Fas/FasL, фактора некроза опухолей рецепторы I и II), активирующие каспазный каскад и другие протеазы. Когда апоптоз ингибируется оверэкспрессией Bcl-2, oxLDL могут вызывать некроз через кальцийзависимый путь. В принципе, апоптоз, имеющий место в областях атеросклеротического поражения, играет роль в устранении дефектных эндотели-альных клеток и в дестабилизации бляшки. Этот сложный «патогенетический каркас» может способствовать коронарным атеротромботическим событиям [21]. Наиболее часто апоптозу внутри атеромы подвергаются макрофаги, эндотелиоциты и гладкомышечные клетки. Очень небольшой процент апоптотических клеток приходится на T- и B-лимфо-циты, и апоптоз полностью отсутствует среди нейтрофилов [16, 22].
Растворимая форма Apo-1/Fas образуется в результате протеолиза мембранной формы или альтернативного сплайсинга мРНК, приводящего к образованию укороченного
транскрипта, не содержащего трансмембранного участка. Вс1-2 является внутриклеточным белком, локализующимся на митохондриях, поэтому появление его растворимой формы в крови связано с повреждением клеточной мембраны в результате процесса апоптоза. Источником поступления в кровь при остром коронарном синдроме маркеров апоптоза Вс1-2 и Аро-1^а8 являются, по-видимому, различные типы клеток (кардиомиоциты, моноциты, макрофаги, эндотелиоциты). Поскольку аннексин А5 в большом количестве образуется в эндотелии, можно предположить, что причиной увеличения аннексина А5 в крови является повреждение эндотелиоцитов [23]. Аннексин А5, как и другие аннексины, не выделяется из нормальных клеток; источником внеклеточного аннексина А5 являются апоптоти-ческие и разрушенные клетки. Одним из ранних признаков апоптоза служит экспозиция на клеточной мембране фосфатидилсерина (ФС). Этот процесс является неотъемлемой частью апоптоза, независимо от типа клеток и пускового механизма активации программы клеточной гибели. На поверхности апоптотических клеток при участии ФС активируются прокоагулянтные реакции: образование протромбиназного комплекса и тромбиноге-нез [15]. Аннексин А5 (возможно, и другие аннексины) связывается с ФС, формирует «антитромботический щит» и снижает риск тромбоза, обусловленного апоптозом.
Выявленные нами положительная корреляционная зависимость между уровнем ан-нексина А5, Вс1-2, Аро-1^а8 и общим холестерином, аполипопротеином В и липопротеи-ном (а) и отрицательная—с а-холестерином свидетельствуют о том, что увеличение содержания данных маркеров апоптоза при остром коронарном синдроме может быть связано с дисфункцией эндотелия, развивающейся при атеросклерозе. Определение уровня липопротеина (а) позволяет косвенно оценить состояние эндотелия, поскольку данный показатель относится к факторам, повреждающим эндотелий, и коррелирует с эндотелиаль-ной дисфункцией [12, 24]. Поражение сосудов может быть обусловлено липопротеином (а), конкурирующим за места связывания с плазминогеном, что способствует снижению синтеза плазмина и подавлению фибринолиза. К другим эффектам липопротеина (а) относятся усиленное отложение холестерина в артериальной стенке, продукция свободных кислородных радикалов моноцитами, пролиферация гладкомышечных клеток [24]. Известно, что через активацию опосредованного Аро-1^а8 апоптоза эндотелиальных клеток реализуется атерогенное действие окисленных липопротеинов низкой плотности [14, 25, 26].
Выяснение роли белков семейства Вс1-2 занимает центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза [9]. Эти белки локализованы во внутренних клеточных мембранах: митохондрии, эндоплазматической сети, ядерной мембране. Растворимая форма Вс1-2 не может взаимодействовать с мембраной. В данном случае сохраняется способность белков взаимодействовать с другими белками этого семейства, особенно с белками — индукторами апоптоза, нейтрализуя их эффект. Противовоспалительная функция белков Вс1-2 и Вс1х1 заключается в защите эндотелиальных клеток путем ин-гибирования ядерного фактора NFkВ и снижения выработки провоспалительных генов. Таким образом, Вс1-2 и Вс1х1 обеспечивают цитопротективные реакции, противодействующие проапоптотическим и провоспалительным повреждениям, и восстанавливают физиологический противовоспалительный фенотип эндотелиальных клеток [27].
Предполагается, что растворимый Аро-1^а8 выступает в качестве ингибитора Fas-опосредованного апоптоза [27]. Повышение в крови растворимой формы антиапоп-тотического белка Вс1-2, препятствующего экспрессии сосудистой молекулы адгезии 1-го типа на активированном эндотелии и аннексина А5, обладающего антитромбо-тическими свойстами, также можно расценивать как защитный механизм, направленный на уменьшение активации эндотелия и снижение тромбогенного потенциала крови при остром коронарном синдроме.
Установленная нами положительная корреляционная связь между количеством мононуклеаров, подвергшихся апоптозу, и содержанием триглицеридов, аполипопро-теина В и липопротеина (а) и отрицательная с уровнем а-холестерина (холестерина липопротеинов высокой плотности) свидетельствует о системном характере апоптоза при атеросклерозе и позволяет расценивать липиды в качестве индукторов апоптоза, стимулирующих локализованный на активированных мононуклеарах универсальный Fas-рецептор, что подтверждается наличием взаимосвязи между уровнем Aро-1/Fas и количеством апоптотических клеток.
Эти клетки, циркулируя в крови, повышают ее тромбогенный потенциал благодаря экспрессии на их поверхности тканевого фактора [20]. Вместе с тем апоптоз активированных мононуклеаров можно расценивать как защитную реакцию, направленную на уменьшение количества клеток имунной системы, участвующих в процессе воспаления при остром коронарном синдроме [22].
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о системном характере апоптоза при остром коронарном синдроме, обусловленном, по-видимому, индукцией универсального Fas-рецептора окисленными липопротеинами низкой плотности и направленного на уменьшение активации эндотелия и снижение тромбогенного потенциала крови при остром коронарном синдроме.
Summary
PetrishchevN. N., VasтаL.V., LugovayaA.V. Content of soluble markers of apoptosis and circulating V annexin-connected apoptosistic cells in the blood of patients with acute coronary syndrome.
It is shown that an increase of apoptosis Bcl-2, and Apo-1/Fas markers and that of A5 annexin in blood is determined in patients with acute coronary syndrome, as well as increasing the number of circulating annexin V-related mononuclears. We detected a positive correlation between the A5, Bcl-2, Apo-1/Fas annexin level, the number of mononuclears subjected to apoptosis and overall cholesterol, B apolipopro-tein, (a) lipoprotein and negative — with а-holesterin that certify systematic patterns of apoptosis in atherosclerosis, allowing lipids seen as apoptosis inducers, enabling universal Fas-receptor localized on activated mononuclears, with a link between the level and quantity of circulating Aro-1/Fas apoptosistic cells. Thus, we have received evidence of systematic patterns of apoptosis in acute coronary syndrome likely to be conditioned by the induction of universal Fas receptors and directed to decreasing endotelium activation and lowering trombogenic blood capacity with this disease.
Key words: acute coronary syndromes, atherosclerosis, apoptosis, lipids.
Литература
1. Панченко Е. П. Механизмы развития острого коронарного синдрома // Рос. мед. журн. 2000. Т. 8. № 8. С.18-21.
2. Badimon L., Badimon J., Fuster V. Pathogenesis of thrombosis // Thrombosis in cardiovascular disease / Eds. V. Fuster, M. Verstraete. Philadelphia, 1992. P. 17-39.
3. Libby P. Molecular basis of the acute coronary syndromes // Circulation. 1995. Vol. 91. P. 2844-2850.
4. Пальцев М. А., Иванов А. А., Северин С. Е. Межклеточные взаимодействия. 2-е изд., пе-рераб. и доп. М., 2003. 288 с.
5. Reutelingsperger C. P. M., van Heerde W. L. Annexin V, the regulator of phosphatidylserinecata-lyzed inflammation and coagulation during apoptosis // Cell. Mol. Lafe Sci. 1997. Vol. 53. P. 527-532.
6. SwairjoM. A., Concha N. O., KaetzelM. A. et al. Cabridging mechanism and phospholipid head group recognidon in the membrane-binding protein annexin V // Nat. Struct. Biol. 1995. № 2. P. 968-974.
7. Vanags D. M., Coppola S., Burgess D. H. Protease involvement in fodrin cleavage and phosphatidylserine exposure in apoptosis // Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 31075-31085.
8. Suc I., Escargueil-Blanc I., TrolyM. et al. HDL and ApoA prevent cell death of endothelial cells induced by oxidized LDL // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1997. Vol. 17. P. 2158-2166.
9. Harada-ShibaM., KinoshitaM., Kamido H., Shimokado K. Oxidized low density lipoprotein induces apoptosis in cultured human umbilical vein endothelial cells by common and unique mechanisms // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 9681-9687.
10. Fadok V. A., Bratton D. L., WarnerM. L., Henson P.M. The role of phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes // Cell Death Dyjer. l998. № 5. P. 551-562.
11. Fadok V., Rose D.M., Pearson A. et al. A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells // Nature. 2000. Vol. 405. P. 85-90.
12. Дисфункция эндотелия: Причины, механизмы, фармакологическая коррекция / Под ред. Н. Н. Петрищева. СПб., 2003. 184 с.
13. Bombeli T., Karsan A., Harlan J. M. Apoptotic vascular endothelial cells become procoagulant // Blood. 1997. Vol. 89. P. 2429-2442.
14. Gotto A. M. Contemporary diagnosis and management of lipid disorders. Pennsylvania,
2001. P. 238.
15. Simak J., Holada K., Vostal J. G. Release of annexin A5-binding membrane microparticles from cultured human umbilical vein endothelial cells after treatment with camptothecin // BMC Cell. Biol. 2002. № 3. P. 11.
16. Bjorkerud S., BjorkerudB. Apoptosis is abundant in human atherosclerotic lesions, especially in inflammatory cells (macrophages and T-cells), and may contribute to the accumulation of gruel and plague instability // Amer. J. Pathol. 1996. Vol. 149. P. 367-380.
17. Libby P., Ridker P.M., Maseri A. et al. Inflammation and atherosclerosis // Circulation.
2002. Vol. 105. P. 1135-1139.
18. Stefanadis C., Diamantopoulos L., Dernellis J. et al. Heat production of atherosclerotic plaques and inflammation assessed by the acute phase proteins in acute coronary syndromes // J. Mol. Cel. Cardiol. 2000. Vol. 32. P. 43-52.
19. Martinet W., KockxM. M. Apoptosis in atheroclerosis: implications for plaque destabiliza-tion // Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 2004. Vol. 66. № 1. P. 61-79.
20. Berckmans R. J., Neiuwland R., Boing A. N. et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation // Thromb. Haemost. 2001. № 85 (4). Р 639-646.
21. Napoli C. Oxidation of LDL, atherogenesis, and apoptosis // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. № 1010. P. 698-709.
22. Kiener P.A., Davis P.M., Starling G. C. et al. Differential induction of apoptosis by Fas-Fas ligand interactions in human monocytes and macrophages // J. Exp. Med. 1997. Vol. 185. P. 1511-1516.
23. Петрищев Н. Н., Васина Л. В. Аннексин А5 и дисфункция эндотелия // Учёные записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. академика И. П. Павлова. 2004. Т. XI. № 3. Приложение. С. 45-47.
24. Rhoads G. G., Dahlen G., Berg K. et al. Lp(a) lipoprotein as a risk factor for myocardial infarction // JAMA. 1986. Vol. 256. P. 2540-2544.
25. Griffith T. S., Brunner T., Fletcher S. M. et al. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege // Science. 1995. Vol. 270. P. 1189-1192.
26. Grundy S. M., Vega G. L. Two different views of the relationship of hypertriglyceridemia to coronary heart disease. Implications for treatment // Arch. Intern. Med. 1992. Vol. 152. P. 28-34.
27. Strasser A., Harris A. W., Huang D. C. S. et al. Bcl-2 and Fas/APO-1 regulates distinct pathways to lymphocyte apoptosis // Eur. Mol. Biol. Organ. J. 1995. Vol. 14. P. 6136-6147.
Статья принята к печати 19 декабря 2007 г.
