CC BY
66
BicHUK ,fl,mnponeTpoBCBKoro ymBepcmeTy. Bionoria, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology.
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2014. 22(2), 169-177.
doi:10.15421/011424
ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online
www.ecology.dp.ua
УДК 616.37-002+616.881/589.1+51.082+599.288
Содержание NCAM в головном мозге и поджелудочной железе крыс в условиях эндогенной интоксикации при экспериментальном
хроническом панкреатите
В.А. Макарчук1, Г.А. Ушакова2
'ГУ «Институт гастроэнтерологии НАМН Украины», Днепропетровск, Украина 2Днепропетровский национальный университет имени Олеся Гончара, Днепропетровск, Украина
В эксперименте на лабораторных крысах воспроизведена модель хронического панкреатита. Окклюзия панкреатического протока привела к значительной атрофии ацинарных клеток, развитию фиброза поджелудочной железы, нарушению функции данного органа и снижению антиоксидантной защиты организма животных. У экспериментальны« крыс развивалась эндогенная интоксикация, проявившаяся достоверным увеличением в плазме крови животных концентрации молекул средней массы вследствие активации процессов липопероксидации. В результате развития моделируемой патологии поджелудочной железы происходит достоверное перераспределение содержания растворимой и мембранной форм нейрональной молекулв1 клеточной адгезии (NCAM), наиболее выраженное в мозжечке и таламусе экспериментальных животных, что влечет за собой изменение межклеточной адгезии в указанных отделах мозга. Разнонаправленный характер распределения NCAM в мозжечке и таламусе свидетельствует о специфической адаптации нейропластичности в условиях эндотоксикации при развитии хронического панкреатита в зависимости от функциональной нагрузки отделов мозга.
Ключевые слова: молекулв1 средней массы; ТБК-активные соединения; хронический панкреатит, головной мозг; поджелудочная железа; нейрональная молекула клеточной адгезии
Content of NCAM in the brain and pancreas of rats in response to endointoxication under conditions of experimental chronic pancreatitis
V.A. Makarchuk1, G.A. Ushakova2
!SI «Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine», Dnipropetrovsk, Ukraine 2Oles Gonchar Dnipropetrovsk National University, Dnipropetrovsk, Ukraine
The study was undertaken to examine the influence of chronic pancreatitis on the distribution of neuronal cell adhesion molecule (NCAM) in the pancreas and various brain regions of rats under the conditions of endogenous intoxication. The study was conducted using 36 white nonlinear male rats (6 months old, 190-220 g). To develop the state of chronic pancreatitis, animals were subjected to laparotomy under general anesthesia and prolonged occlusion of the pancreatic duct. The morphological examination of pancreatic tissue has been performed to confirm the chronic pancreatitis development in animals. Biochemical evaluation of the pancreatic fibrosis has been performed by measuring plasma levels of hyaluronic acid, hydroxyproline and protein-free hydroxyproline. The intensity of free radical oxidation has been assessed by the change in the concentration of TBA-active products in plasma. The level of endotoxemia has been determined by the content of average weight molecules in plasma. Protein fractions were extracted from the pancreas and various parts of the rat brain and the
1ГУ «Институт гастроэнтерологии НАМН Украины», пр. имени Газеты «Правда», 96, Днепропетровск, 49074, Украина
SI «Institute of Gastroenterology of National Academy of Medical Sciences of Ukraine», Gazety «Pravda» Ave., 96, Dnipropetrovsk,
49074,Ukraine
2Днтропетровський нацюнальний утверситет iM. Олеся Гончара, пр. Гагарта, 72, Днтропетровськ, 49010, Украша Oles' Honchar Dnipropetrovsk National University, Gagarin Ave., 72, Dnipropetrovsk, 49010, Ukraine
Те1.: +38-067-966-48-43, E-mail: [email protected]
levels of soluble (sNCAM) and membrane (mNCAM) proteins were studied with the use of the competitive ELISA. Total protein in the obtained fractions was measured by the Bradford assay. Occlusion of the pancreatic duct resulted in significant atrophy of acinar tissue, fibrosis and disfunction of the pancreas along with the decreasing in the antioxidant defense of animals. The present study shows developing of endointoxication in experimental rats, signified by considerable increase of molecules with average weight in plasma due to the activation of lipid peroxidation. It was established that, as a result of the experimental pancreas dysfunction, significant redistribution of soluble and membrane forms of NCAM took place, more especially in the cerebellum and thalamus of rats; it caused changing of cell-cell adhesion in these brain regions. Multidirectional NCAM distribution in the cerebellum and thalamus gives evidence of neuroplasticity as specific adaptation under conditions of chronic pancreatitis.
Keywords: molecules with average weight; TBA-active products; chronic pancreatitis; brain; pancreas; neuronal cell adhesion molecule
Введение
Во всем мире возрастает распространенность и заболеваемость панкреатитами, что связано с увеличением потребления алкоголя, ростом частоты курения, широким распространением ожирения среди населения развитых стран (ОиЬег^Б, 2013). Хронический панкреатит является воспалительным заболеванием, которое характеризуется прогрессирующим разрушением ткани поджелудочной железы и приводит к ее экзокринной и эндокринной недостаточности (Grigsby е! а1., 2012).
Свободнорадикальное окисление, с одной стороны, является неотъемлемой частью нормальной жизнедеятельности организма, а с другой - нарушение этих процессов служит ранним неспецифическим фактором повреждения, лежащим в основе развития различных заболеваний, в том числе острого и хронического панкреатита. Если учитывать, что уровень антиоксидантной активности ткани поджелудочной железы один из самых низких в организме, то высвобождение в кровь продуктов свобод-норадикального окисления и эндотоксинов будет способствовать формированию синдрома эндогенной интоксикации (Тгорта е! а1., 2010; £61 е! а1., 2010).
В настоящее время все большее значение приобретает изучение маркеров эндотоксикоза различного происхождения (Б1ееуа, 2013). Основная часть эндогенных токсинов принадлежит к молекулам средней массы (МСМ), повышение которых в крови, а также продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) при снижении активности системы биотранспорта и биотрансформации эндотоксинов является неспецифическим тестом эндогенной интоксикации (Б1ееуа, 2013; Shk1ovsky е! а1., 2011; Жоккауа е! а1., 2013). Под МСМ следует понимать пул веществ со средней молекулярной массой от 300 до 5000 Да (фрагменты нуклеиновых кислот и ароматические аминокислоты). Накопление их происходит при нарушении функциональной активности систем детоксикации и усиленном катаболизме белков. Нарушение физико-химических свойств клеточных мембран делает их более доступными для разного рода повреждающих воздействий, включая процессы ПОЛ (Б1eeva, 2013). Многие компоненты из МСМ проявляют нейро-токсическую активность, способны присоединяться к рецепторам и блокировать их, неадекватно изменяя метаболизм и функции клетки. Они вызывают изменение проницаемости гематоэнцефалического барьера, инги-бируют митохондриальное окисление, нарушают процессы транспорта аминокислот, ионов калия и натрия в центральную нервную систему, связанные с ингибиро-ванием №+,К+-АТФ-азы, структурно-функциональную организацию мембран клеток крови и эндотелия сосудов, угнетают фагоцитоз и др. (КОепко е! а1., 2012;
Catala, 2009; Tereshenko et al., 2012). Так как МСМ способны приобретать свойства вторичных токсинов и оказывать влияние на жизнедеятельность всех систем и органов, их накопление в дальнейшем усугубляет течение патологического процесса (Tereshenko et al., 2012). В результате многочисленных исследований установлено, что повышение уровня МСМ в крови наблюдается при патологических состояниях различной этиологии и степени тяжести, в том числе при остром панкреатите, панкреонекрозе, ряде хирургических заболеваний (Ni-kolskaya et al., 2013).
Ранним и тяжелым осложнением острого панкреатита является панкреатическая энцефалопатия, патогенез и механизм которой по-прежнему исследуются. В результате ее развития может изменяться проницаемость гема-тоэнцефалического барьера (Zhen et al., 2012). Патологические изменения в тканях головного мозга при панкреатической энцефалопатии связаны в основном с отеками нейронов и геморрагическими очагами. Li et al. (2003) предполагают, что липаза и фосфолипаза А2 могут привести к повреждению структуры центральной нервной системы и играют важную роль в патологическом процессе панкреатической энцефалопатии, а низкое содержание натрия и фосфора, гипоксия, азотемия, нарушение углеводного обмена в крови и инфекции могут быть триггерами. Патогенез данной патологии остается до конца не ясен (Xi-Ping and Hua, 2007). Вопрос о развитии панкреатической энцефалопатии при хроническом панкреатите на сегодняшний день недостаточно освещен и представляет значительный интерес для исследователей.
Нейрональная молекула клеточной адгезии (NCAM) является членом суперсемейства иммуноглобулинов, представляет собой гликопротеин, который опосредует гомофильное взаимодействие между соседними клетками и гетерофильное - между клетками и компонентами внеклеточного матрикса (Campodonico et al., 2010). Развитие и поддержание морфологии нейронов имеет большое значение для нормального развития и функционирования мозга. NCAM играет важную роль в этих процессах, участвуя в регуляции миграции нейронов и их дифференциации, принимает участие в механизме регулирования мембранного потенциала, который определяет возбудимость этих клеток (Campodonico et al., 2010, Kleene et al., 2010), взаимодействует с факторами роста и рецепторами факторов роста (Hübschmann and Skladchikova, 2010). NCAM помимо участия в развитии нервной системы также в значительной степени вовлечен в синаптическую пластичность и в когнитивные процессы в зрелом мозге. NCAM принимает участие как в кратковременной пластичности при уже существующих синапсах, так и в длительной пластичности, связан-
ной с синаптическим образованием или элиминацией. По современным представлениям о функциональной роли NCAM, блокировка функций данного белка может привести к когнитивным нарушениям и эмоциональным изменениям, в том числе нарушению пространственного восприятия и памяти, нарушению слуха, усилению тревожности, нарушению восприимчивости запаха и др. (Bisaz et al., 2009).
NCAM существует в трех основных изоформах (NCAM-180, NCAM-140 и NCAM-120), отличающихся по молекулярному весу, а также по распределению и функциям (Bisaz et al., 2011). В то время как NCAM-120 не имеет цитоплазматического домена и прикрепляется к мембране посредством ковалентно связанного фосфати-дилинозитол-заякоривающего соединения, NCAM-140 и NCAM-180 представлены трансмембранными и интраци-топлазматическими доменами (Campodonico et al., 2010).
Целью нашего исследования была оценка влияния хронического панкреатита на распределение NCAM в поджелудочной железе и различных отделах головного мозга крыс в условиях эндогенной интоксикации.
Материал и методы исследований
В работе использовали альциан голубой (Fluka, Швейцария), гиалуроновую кислоту (Sigma, США), моноспецифические поликлональные антитела против NCAM, очищенные антигены NCAM (Santa Cruze, США), вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (Sigma, США).
Эксперимент проводили на белых лабораторных крысах-самцах (6 месяцев, 190-210 г) согласно Закону Украины № 3447-IV от 21.02.06 г. «О защите животных от жестокого обращения». Крысы находились в стандартных условиях с естественной сменой освещения и соблюдением общего рациона вивария. За сутки до эксперимента крыс не кормили, доступ к воде оставался свободным. Для моделирования хронического панкреатита животным под наркозом (кетамин гидрохлорид, 110 мг/кг) проводили лапаротомию и окклюзию протока поджелудочной железы лигатурой «Prolene» 5/0 (Page et al., 2000).
Экспериментальных животных разделили на две группы: I группа (n = 6) - ложнооперированные крысы, которым проводили лапаротомию и сразу же разрез кожного покрова на брюхе зашивали (контрольная группа); II группа (n = 6) - крысы с хроническим панкреатитом. После окончания эксперимента животных на 30-е сутки декапитировали после предварительного введения наркоза (110 мг/кг). Гепаринизированную кровь разделяли на плазму и эритроциты.
Для подтверждения развития у животных хронического панкреатита проводили морфологическое исследование ткани поджелудочной железы, включающее стандартную фиксацию кусочков ткани в жидкости Буе-на, проводку и заливку их в парафиновые блоки, приготовление срезов и окраску гематоксилином-эозином (по общепринятому в гистологии методу), 2% кислым пикрофуксином и трехцветную качественную окраску по Маллори - Слинченко (Sapozhnikov and Dorosevich, 2000) с последующим изучением препаратов с помощью
светового микроскопа XSP-139TP и фотографированием фотоаппаратом Canon A630 (Japan).
Концентрацию гиалуроновой кислоты оценивали по оптической плотности раствора, содержащего комплекс, образованный этим гликозаминогликаном (ГАГ) с красителем альцианом голубым (Gold, 1981). Щелочной раствор (рН 8,6), который используется для окраски не-сульфатированных ГАГ, содержит 0,5 М CHCOONa и 1% раствор альциана голубого. Микрометод определения гиалуроновой кислоты: 20 мкл пробы приливают в лунку планшета и добавляют 200 мкл красителя. Через 15 мин. проводят измерение на спектрофотометре «An-thos 2010» (Финляндия) при 480 нм. Концентрацию ок-сипролина белковосвязанного и свободного определяли по методу М. А. Осадчук (Osadchuk, 1979).
Интенсивность свободнорадикального окисления оценивали по изменению концентрации ТЪК-активных продуктов в плазме крови. Последнюю определяли по методу Л.М. Овсянниковой и соавт. (Ovsyannikova et al., 1999). Уровень эндотоксемии определяли по содержанию МСМ в плазме крови в соответствии со стандартизованной методикой, предложенной В.В. Николайчиком (Nykolaychik et al., 1991). Концентрацию МСМ по белку определяли по методу Лоури (Loury et al., 1951). Результаты определения МСМ по белку представлены в мг/л, результаты для каждой длины волны - в опт. ед.
Для получения белковых фракций из поджелудочной железы и мозга крыс мозг очищали от поверхностной пленки и капилляров, изымали отдельно мозжечок, гип-покамп и таламус. Гомогенизацию ткани поджелудочной железы и отделов мозга проводили в буфере А, который содержал трис-НСУ - 25 мМ (рН 7,4), ЭДТА -1 мМ, р-меркаптоэтанол - 2 мМ, фенилметилсульфо-нилфторид - 0,2 мМ, мертиолят - 0,01%, в соотношении 1:10 при +4 °С. В ходе последовательных стадий центрифугирования (I стадия - центрифугирование 60 мин. при 20 000 g, II стадия - инкубация осадка 24 часа после первого центрифугирования в буфере А, который дополнительно содержал Тритон Х-100 - 2%, и центрифугирование 90 мин. при 100 000 g) выделены фракции, содержащие растворимые NCAM (soluble - sNCAM, выделенные на I стадии центрифугирования) и мембранные NCAM белки (membrane - mNCAM, выделенные на II стадии центрифугирования).
Полученные фракции белков использовали для количественного определения содержания в них NCAM методом твердофазного иммуноферментного анализа (Ngo et al., 1988) с использованием моноспецифических поликлональных антител против NCAM, а также вторичных антител против IgG кроликов, меченых перок-сидазой хрена. Для построения калибровочных кривых использовали очищенные антигены NCAM. Оценку результатов проводили в спектрофотометре «Anthos 2010» при длине волны 492 нм. Содержание NCAM определяли как отношение его количества в пробе к количеству общего белка (ОБ) в данной пробе (мкг NCAM/мг ОБ). Количество общего белка в полученных фракциях мозга определяли методом Бредфорд (Bradford, 1985).
Статистическую обработку результатов осуществляли методами вариационной статистики с использованием стандартного пакета прикладных программ SPSS 13.0 for Windows. Для показателя определяли выборочное
среднее значение (М) и ошибку среднего (m). Исследуемые соотношения считали достоверными при Р < 0,05, Р < 0,01 и Р < 0,001. Корреляционный анализ проводили по Пирсону (для данных, выраженных в интервальной шкале) (Petri and Sabin, 2003).
Результаты и их обсуждение
Морфологический анализ. Развитие хронического панкреатита у животных с 30-суточной окклюзией панкреатического протока подтверждалось морфологическим анализом ткани поджелудочной железы. С помощью окраски по Ван-Гизону в образцах из хвостовой части органа, где и осуществлялась окклюзия панкреатического протока, был выявлен междольковый и внутридольковый фиброз, а также внутридольковая фибробластическая
реакция в виде узких и широких разветвленных междоль-ковых тяжей вокруг сосудов. Хронизация панкреатита сопровождалась значительной атрофией ацинарной ткани поджелудочной железы и замещением ее фиброзной тканью. Мелкие протоки органа расширены, наблюдались признаки гиперплазии эпителия. В сохранившейся части протоковой структуры имела место парциальная атрофия ацинарных клеток. Вокруг магистральных и внутридоль-ковых протоков наблюдалась плотная фиброзная ткань, а рыхлая фиброзная ткань заполняла междольковое пространство и содержала остатки разрушенных частиц островков, протоки и сосуды (рис. 1 а, б). Анализ образцов из железы контрольных крыс изменений не выявил: среди экзокринной ткани находились островки Лангерганса различной формы и размера, ацинарная ткань без особенностей (рис. 1 в).
а б в
Рис. 1. Образцы ткани поджелудочной железы крыс при экспериментальном хроническом панкреатите (30 суток): атрофия ацинарной ткани, гиперплазия островков, рыхлый (а) и плотный (б) вокругдольковый и внутридоль-ковой фиброз; образец ткани нормальной структуры поджелудочной железы (в); окраска по Маллори - Слинченко, х40
Анализ содержания маркеров фиброза. К малоин-вазивным методам диагностики фиброза поджелудочной железы следует отнести определение молекулярных соединений, участвующих в патогенезе процесса образования внеклеточного матрикса, в том числе гиалуроно-вой кислоты. Содержание ее в плазме крови отражает степень прогрессирования фиброза органа при хроническом панкреатите. В опытной группе крыс содержание гиалуроновой кислоты в крови увеличилось на 46,9% (Р < 0,001) по сравнению с контролем. Изменение в плазме крови концентрации оксипролина белковосвя-
занного и оксипролина свободного рассматривается как показатель метаболизма коллагена и дает важную информацию о биохимических и патологических особенностях фиброгенеза. С прогрессированием панкреатита и фиброзной трансформацией данного органа концентрация оксипролина белковосвязанного увеличилась на 38,5% (Р < 0,001) при одновременном снижении концентрации оксипролина свободного на 30,0% (Р < 0,01) относительно контроля, что свидетельствует о нарушении метаболизма коллагена в сторону фиброгенеза (табл.).
Таблица
Значения биохимических показателей крови экспериментальных крыс
Показатель Контрольная группа, n = 6 Хронический панкреатит, n = 6
Гиалуроновая кислота, мкг/мл 1,28 ± 0,06 1,88 ± 0,10***
Оксипролин белковосвязанный, мкмоль/л 166,7 ± 9,2 230,8 ± 8,8***
Оксипролин свободный, мкмоль/л 9,96 ± 0,60 6,97 ± 0,39**
ТБК-активные продукты, нмоль/мл 4,50 ± 0,23 6,16 ± 0,18*
МСМ, мг/л 781,3 ± 31,7 1228,3 ± 109,5**
МСМ-230, опт. ед. 0,394 ± 0,012 0,647 ± 0,070**
МСМ-254, опт. ед. 0,031 ± 0,004 0,039 ± 0,002
МСМ-280, опт. ед. 0,042 ± 0,002 0,062 ± 0,003***
Примечание: * - Р < 0,05, ** - Р < 0,01, *** - Р < 0,001 - различия достоверны по сравнению с группой контроля.
Анализ показателей перекисного окисления ли-пидов и эндотоксикации. Деструктивный процесс в поджелудочной железе сопровождался увеличением в плазме крови концентрации ТЪК-активных продуктов на
36,9% (Р < 0,05) по сравнению с контрольным значением (табл.). Проведенные исследования позволили установить, что при развитии патологии поджелудочной железы у крыс определяется статистически значимое увели-
чение концентрации МСМ в плазме крови (на 57,2%, Р < 0,05) относительно группы контроля (табл.). При определении взаимосвязи между процессами избыточной липопероксидации и образованием продуктов распада протеинов в группе крыс с хроническим панкреатитом выявлена умеренная положительная корреляционная связь между соответствующими показателями (уровнем ТБК-активных продуктов и МСМ, г = 0,529, Р < 0,05), которая не отмечалась в контроле.
Анализ спектров поглощения света кислотораство-римой фракции сыворотки крови в диапазоне 230280 нм показал, что все исследованные фракции МСМ в опытной группе крыс превышали контрольные показатели. Средняя концентрация МСМ-230, содержащая преимущественно эндогенные патогены в виде белков-гистонов, продуктов разрушения ДНК, вышедшими из цитозоля в межклеточную среду, лимфоток и кровь при нарушении целостности клеточных мембран (нуклеар-ная фракция) и измеряемая при длине волны 230 нм, увеличивалась в группе крыс с хроническим панкреатитом на 63,5% (Р < 0,01) относительно контрольной группы. Токсическая фракция, определяемая при длине волны 254 нм, состоит из гидрофобных токсинов, обладающих высоким сродством к биологическим структурам, находящимся в плазме в практически полностью связанном состоянии в виде комплексов с альбумином или липопротеинами низкой плотности, изменяется в меньшей степени. Концентрация пептидной фракции МСМ-254 в группе крыс с окклюзией панкреатического протока имела тенденцию к увеличению на 25,8% по сравнению с контролем. Средняя концентрация МСМ-280 (фракция ароматических хромафоров, которая измерялась при длине волны 280 нм) у группы крыс с
хроническим панкреатитом на 47,6% (Р < 0,001) превышала таковую контрольной группы (табл.).
Анализ содержания нейрональной молекулы клеточной адгезии NCAM во фракциях поджелудочной железы и отделов мозга. Количественный анализ нейрональной молекулы клеточной адгезии ЫСАМ в ткани поджелудочной железы и различных отделах мозга исследуемых крыс показал специфичность перераспределения растворимой и мембранной форм ЫСАМ только в мозге при развитии хронического панкреатита.
На 30-е сутки окклюзии панкреатического протока у крыс не происходит достоверного изменения концентрации как растворимой, так и мембранной форм исследуемого нейроспецифического белка в экстракте из поджелудочной железы относительно контрольной группы. При развитом хроническом панкреатите наблюдалось наиболее выраженное изменение уровня данного белка в мозжечке: увеличение растворимой бЫСАМ на 19,7% (Р < 0,05) до 2,18 ± 0,14 мкг/мг ОБ по отношению к контрольной группе животных 1,75 ± 0,14 мкг/мг ОБ (рис. 2 а) и достоверное снижение содержания тЫСАМ (на 46,0%, Р < 0,01) с 212,5 ± 29,2 мкг/мг ОБ (контроль) до 114,8 ± 9,5 мкг/мг ОБ (рис. 2 б).
В таламусе отмечено противоположно направленное изменение уровня ЫСАМ по сравнению с мозжечком. Отмечена тенденция к снижению бЫСАМ (но не достоверно значимая) и увеличение тЫСАМ на 34,2% (Р < 0,05) с 153,8 ± 7,6 мкг/мг ОБ (контрольная группа) до 206,5 ± 21,7 мкг/мг ОБ (рис. 2 а, б). В гиппокампе исследуемых крыс достоверных различий в содержании как растворимой, так и мембранной формы ЫСАМ при панкреатите не установлено.
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Водорастворимая фракция
I I I
мозжечок гиппокамп таламус
Контроль ХП
300
й 250
Мембранная фракция
О
200
и 150 Е 100
50
б
. I I
мозжечок гиппокамп таламус
Контроль ХП
Рис. 2. Концентрация NCAM в водорастворимой (а) и мембранной (б) фракциях, экстрагированной из различных отделов головного мозга крыс: контроль - псевдооперированные крысы, ХП - крысы с экспериментальным хроническим панкреатитом,* - Р < 0,05, ** - Р < 0,01 - различия достоверны по сравнению с группой контроля, п = 6
Корреляционный анализ в группе крыс с хроническим панкреатитом показал высокую положительную связь между концентрациями БУТСАМ в экстракте из мозжечка и МСМ-230 в плазме крови (г = 0,943, Р < 0,01) и между тЫСАМ в экстракте из таламуса и МСМ-280 в плазме крови (г = 0,829, Р < 0,05), а также отрицательную среднюю связь между содержанием тЫСАМ в экстракте из мозжечка и МСМ в плазме крови (г = -0,600, Р < 0,05). Отмечена обратная связь между уровнем растворимой и
мембранной фракции ЫСАМ, которые экстрагированы из мозжечка, БЫСАМ/тЫСАМ (г = -0,886, Р < 0,05).
Таким образом, в данном эксперименте у животных наблюдались признаки хронического панкреатита, развитие которого подтверждалось морфологическими и биохимическими исследованиями. На 30-е сутки исследования происходило замещение ацинарных структур соединительной тканью, поджелудочная железа уменьшалась в размере и становилась более плотной. Ранее
а
нами было показано, что с потерей значительной части паренхимы поджелудочной железы и развитием в ней фиброза у крыс с экспериментальным хроническим панкреатитом происходит нарушение внешнесекреторной функции органа (Makarchuk et al., 2013).
При панкреатите происходит изменение содержания гиалуроновой кислоты в экстрацеллюлярном матриксе (Masamune et al., 2009; Madro et al., 2011; Venkatasubra-manian, 2012). Рост концентрации данного ГАГ в плазме крови обусловлен увеличением его продукции панкреатическими звездчатыми клетками и нарушением деградации гиалуронидазой (El-Shabrawi Mortada et al., 2012; Duterme et al., 2009). Высокое содержание гиалуроновой кислоты, которое определялось в крови крыс на 30-е сутки эксперимента, свидетельствует о значительной степени фиброзной трансформации поджелудочной железы при хроническом панкреатите. Еще один малоин-вазивный метод оценки фиброза ткани - определение концентрации оксипролина свободного и белковосвя-занного в плазме крови - подтвердил развитие фиброза. Достоверное повышение концентрации оксипролина белковосвязанного и снижение содержания оксипролина свободного в опытной группе крыс означало, что на стадии хронизации панкреатита превалируют процессы активного коллагенообразования над его деградацией.
Интегральная оценка выраженности эндогенной интоксикации получена с помощью комплекса биохимических тестов, включающих определение МСМ и ТБК-активных продуктов. По уровню ТЪК-активных продуктов в плазме крови можно косвенно судить о степени риска мембранной патологии клеток при хроническом панкреатите. В эксперименте нами установлено достоверное увеличение (Р < 0,05) данного показателя в плазме крови крыс с длительной лигатурой панкреатического протока, свидетельствующее об активации процессов липопероксидации у этих животных, что может вызвать окислительное повреждение мембран ацинарных клеток поджелудочной железы.
Реактивные кислородные метаболиты являются ре-докс-активными соединениями, и в зависимости от их концентрации они могут оказывать как положительный (пролиферация клеток), так и отрицательный (остановка клеточного роста, клеточная гибель) эффект на нервные клетки (Durackova, 2010). Активные формы кислорода увеличивают реактивность нейрональной ткани в отношении возбуждающих нейротрансмиттеров. Эти молекулы атакуют глиальные клетки и нейроны, а последние, являясь постмитотическими клетками, оказываются особенно уязвимыми к действию свободных радикалов (Gomazkov, 2011).
Высвобождение в системный кровоток продуктов свободнорадикального окисления и эндотоксинов способствует развитию эндогенной интоксикации, которая, вызывая дисбаланс многочисленных биохимических и нейрофизиологических процессов, может влиять на тяжесть течения заболевания (Tropina et al. 2010; Alfyorova et al., 2011). Накопление МСМ и ТЪК-активных продуктов в плазме крови крыс с хроническим панкреатитом, вероятно, является взаимосвязанным процессом, что подтверждается положительной корреляционной связью (r = 0,529, Р < 0,05).
Анализ результатов показал определяющее влияние поражения поджелудочной железы на уровень МСМ, что выражалось достоверным увеличением данного показателя (Р < 0,01) в плазме крови крыс с хроническим панкреатитом и свидетельствовало о высоком уровне эндотоксикации организма. Не исключено, что изменение фракций МСМ имеет непосредственное отношение к развитию патологического процесса. Поэтому спектр МСМ-230, МСМ-254 и МСМ-280 можно рассматривать в качестве объективного критерия метаболических нарушений при хроническом панкреатите. В ходе исследования МСМ у опытных крыс выявлено достоверное увеличение (Р < 0,05) нуклеарной фракции МСМ-230 относительно контроля. Возможно, повышение содержания данной фракции МСМ вызвано увеличением в крови остатков нуклеиновых кислот, что связано с усилением апоптоза панкреацитов, которому в последние годы отводится существенная роль в патогенезе хронического панкреатита (Меппоуа, 2013). Наблюдалась тенденция увеличения токсической фракции МСМ-254, состоящей из гидрофобных токсинов, и достоверно повышался (Р < 0,001) уровень фракции ароматических хромафоров МСМ-280.
Многие компоненты из МСМ характеризуются ней-ротоксической активностью, вызывают изменение проницаемости гематоэнцефалического барьера (Кго!епко е! а1., 2012). По данным клинических исследований, увеличение МСМ в плазме крови при различной соматической патологии, а также при ряде заболеваний центральной нервной системы является неблагоприятным прогностическим признаком. Корреляцию увеличения МСМ и неблагоприятного исхода заболевания связывают с выраженным цито- и нейротоксическим действием МСМ (ШЬекоу е! а1., 2010).
На сегодняшний день имеется очень мало информации о перераспределении ЫСАМ в различных отделах головного мозга при хронических заболеваниях внутренних органов. В нашем исследовании проанализировано распределение растворимой и мембранной формы ЫСАМ в поджелудочной железе, мозжечке, гиппокампе и таламусе крыс с экспериментальным хроническим панкреатитом в условиях эндогенной интоксикации. Сбалансированное содержание трансмембранных и растворимых изоформ данного белка имеет большое значение для нормального развития и функционирования мозга (Foge1 е! а1., 2011; Мао е! а1., 2012; Ишк1е е! а1., 2006).
Полученные данные указывают на зависимость распределения исследуемых адгезивных молекул в мозжечке от увеличения концентрации эндотоксинов в крови, вызванное развитием патологии поджелудочной железы, что выражалось отрицательной корреляционной связью между содержанием тЫСАМ в экстракте из данного отдела мозга и содержанием МСМ в плазме крови (г = -0,600, Р < 0,05) и положительной корреляционной связью между концентрацией БУТСАМ в экстракте из мозжечка и концентрацией МСМ-230 в плазме крови (г = 0,943, Р < 0,01). Мишенью негативного влияния эндотоксинов в головном мозге в первую очередь являются мембраносвязанные белки, в том числе ЫСАМ, что проявилось достоверным снижением концентрации этих молекул (Р < 0,01) во фракции, выделенной из мозжечка.
Параллельно с этим наблюдалось достоверное увеличение (Р < 0,05) в мозжечке относительно контроля содержания растворимой формы NCAM за счет энзиматиче-ского расщепления мембраносвязанных NCAM, «срезания» этих молекул с мембраны клеток. Эти результаты в группе крыс с хроническим панкреатитом подтверждались высокой обратной корреляционной связью между концентрациями растворимой и мембранной формы NCAM в экстрактах из мозжечка (r = -0,886, Р < 0,05). Развитие данной патологии приводит к снижению межклеточной адгезии в мозжечке, который имеет огромное значение для координации и регуляции двигательной активности, поддержания равновесия тела и его ориентации в пространстве.
Основная функция растворимой формы NCAM заключается в регуляции внеклеточного сигнализирования (Hagiyama et al., 2009). NCAM регулирует межклеточную адгезию, миграцию нейронов (Zecchini et al., 2011). Трансмембранные адгезивные молекулы не только являются посредниками в процессе распознавания между клетками, но еще и могут преобразовывать сигналы внутри клетки и таким образом вызывать клеточный ответ, регулирующий онтогенез и синаптическую пластичность (в том числе при обучении и памяти) (Kleene et al., 2010, Nielsen et al., 2009). Поэтому в результате перераспределения NCAM между фракциями при экспериментальном хроническом панкреатите, когда в мозжечке наблюдалось увеличение количества растворимых и снижение мембранных молекул, нарушается нормальное функционирование как sNCAM, так и mNCAM.
Чувствительная реакция таламуса, принимающего ноцицептивные сигналы, на токсикацию организма вследствие заболевания поджелудочной железы подтверждалась прямой корреляционной связью между содержанием mNCAM в данном отделе и МСМ-280 в плазме крови (r = 0,829, P < 0,05) и выражалась достоверным (Р < 0,01) ростом концентрации mNCAM относительно контроля. Содержание sNCAM во фракции, экстрагированной из этого же отдела, имело тенденцию к снижению. Определенный дисбаланс содержания NCAM в мозжечке и таламусе свидетельствует о перераспределении этого протеина между указанными отделами головного мозга, благодаря чему, возможно, обеспечивается пластичность нервной системы в условиях развития хронического панкреатита у крыс. Концентрация как mNCAM, так и sNCAM во фракциях, выделенных из гиппокампа, имела только тенденцию к снижению, что свидетельствует о нормальном функционировании отдела мозга, ответственного за познавательную деятельность. Как видно из представленных результатов, развитие хронического панкреатита наиболее существенно влияет на функционирование мозжечка и таламуса.
Мы также определяли концентрацию sNCAM и mNCAM в экстракте из поджелудочной железы крыс с экспериментальным хроническим панкреатитом. Достоверных различий в концентрации как растворимой, так и мембранной форм NCAM не наблюдалось по сравнению с контрольными животными.
Выводы
У крыс с экспериментальным хроническим панкреатитом происходит достоверное увеличение в плазме крови уровня ТЪК-активных продуктов (Р < 0,05) и МСМ (Р < 0,01), свидетельствующее о развитии неспецифической эндогенной интоксикации, и наблюдается достоверное увеличение нуклеарной фракции МСМ-230 (Р < 0,01) и фракции ароматических хроматофоров МСМ-280 (Р < 0,001). В результате эндогенной интоксикации при развитии хронического панкреатита происходит достоверное противоположно направленное перераспределение растворимой и мембранной форм NCAM в мозжечке и таламусе экспериментальных крыс, что свидетельствует о пластичности центральной нервной системы при данных условиях.
Библиографические ссылки
Alfyorova, V.V., Uzbekov, M.G., Misionzhnik, E.Y., Loukyanyuk, E.V., Geht, A.B., Shklovsky, V.M., Shikhov, S.N., 2011. Serologicheskie markeri endogennoj intoksikacii v kompleksnoj ocenke reabilitacionnogo potenciala bol'nih, perenesshih ishemicheskij insyl't [Serological markers of endogeneous intoxication in determining rehabilitation potential for the patients after ischemic stroke]. Soc. Klin. Psihiatriia 11(3), 54-57 (in Russian). Bisaz, R., Conboy, L., Sandi, C., 2009. Learning under stress: A role for the neural cell adhesion molecule NCAM. Neuro-biol. Learn. Mem. 91, 333-342. Bisaz, R., Schachner, M., Sandi, C., 2011. Causal evidence for the involvement of the neural cell adhesion molecule, NCAM, in chronic stress-induced cognitive impairments. Hippocampus 21, 56-71. Bradford, M., 1985. Rapid and sensitive methods for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254. Campodonico, P.B., Bal de Kier Joffe, E.D., Urtreger, A.J., Lauria, L.S., Lastiri, J.M., Puricelli, L.I., Todaro, L.B., 2010. The neural cell adhesion molecule is involved in the metastatic capacity in a murine model of lung cancer. Mol. Car-cinog. 49, 386-397. Catala, A., 2009. Lipid peroxidation of membrane phospholipids generates hydroxy-alkenals and oxidized phospholipids active in physiological and/or pathological conditions. Chem. Phys. Lipids 157, 1-11. Qol, C., Dinler, K., Hasdemir, O., Buyuka^ik, O., Bugdayci, G., 2010. Oxidative stress and lipid peroxidation products: Effect of pinealectomy or exogenous melatonin injections on biomarkers of tissue damage during acute pancreatitis. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 9(1), 78-82. Ding, Z., Liu, J., Lin, R., Hou, X.H., 2012. Experimental pancreatitis results in increased blood-brain barrier permeability in rats: A potential role of MCP-1. J. Dig. Dis. 13, 179-185. Durackova, Z., 2010. Some current insights into oxidative stress.
Physiol. Res. 59, 459-469. Duterme, C., Mertens-Strijthagen, J., Tammi, M., Flamion, B., 2009. Two novel functions of hyaluronidase-2 (Hyal2) are formation of the glycocalyx and control of CD44-ERM interactions. J. Biol. Chem. 284(48), 33495-33508. Eleeva, M.A-K., 2013. Sostojanie prooksidantnoj sistemi krovi i uroven' molekul srednej massi u bol'nyh s insul'tom [The condition of prooxidant blood system and medium mass molecules level in the patients under insult]. Vestnik Novih Med. Tehnologij (Elektronnij Zh.) 1 (in Russian).
El-Shabrawi Mortada, H.F., Zein El Abedin, M.Y., Omar, N., Kamal, N.M., Elmakarem, A.S., Khattab, S., El-Sayed, H.M., El-Hennawy, A., Ali Ali, S.M., 2012. Predictive accuracy of serum hyaluronic acid as a non-invasive marker of fibrosis in a cohort of multi-transfused Egyptian children with b-thalassaemia major. Arab J. Gastroenterol. 13, 45-48.
Fogel, A.I., Stagi, M., Arce, K.P., Biederer, T., 2011. Lateral assembly of the immunoglobulin protein SynCAM 1 controls its adhesive function and instructs synapse formation. EMBO J. 30(23), 4728-4738.
Gold, E.W., 1981. The quantitative spectrophotometric estimation of total sulfated glycosaminoglican levels. Biochem. Biophys. Acta 673, 408-415.
Gomazkov, O.A., 2011. Starenie mozga i nejrotroficheskaja terapija [The aging of the brain and neurotrophic therapy]. Izdatel'stvo ICAR, Moscow (in Russian).
Grigsby, B., Rodriguez, H., Khan, K., 2012. Antioxidants and chronic pancreatitis: Theory of oxidative stress and trials of antioxidant therapy. Dig. Dis. Sci. 57, 835-841.
Gubergrits, N.B., 2013. Sovremennye dostizhenija evropejskoj pancreatologii [Modern achievements of european pancrea-tology]. Gastroenterologija 47(1), 65-71 (in Russian).
Hagiyama, M., Ichiyanagi, N., Kimura, K.B., Murakami, Y., Ito, A., 2009. Expression of a soluble isoform of cell adhesion molecule 1 in the brain and its involvement in directional neurite outgrowth. Am. J. Pathol. 174(6), 2278-2289.
Hinkle, C.L., Diestel, S., Lieberman, J., Maness, P.F., 2006. Metalloprotease-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule (NCAM). J. Neurobiol. 66, 1378-1395.
Hubschmann, M.V., Skladchikova, G., 2010. The role of ATP in the regulation of NCAM function. Ed. V. Berezin. Springer Science + Business Media, LLC, 663, pp. 81-89.
Kleene, R., Cassens, C., Bahring, R., Theis, T., Xiao, M.-F., Dityatev, A., Schafer-Nielsen, C., Doring, F., Wischmeyer, E., Schachner, M., 2010. Functional consequences of the interactions among the neural cell adhesion molecule NCAM, the receptor tyrosine kinase TrkB, and the inwardly rectifying K+ channel KIR3.3. J. Biol. Chem. 285(37), 2896828979.
Kleene, R., Mzoughi, M., Joshi, G., Kalus, I., Bormann, U., Schulze, C., Xiao, M.-F., Dityatev, A., Schachner, M., 2010. NCAM-induced neurite outgrowth depends on binding of calmodulin to NCAM and on nuclear import of NCAM and fak fragments. J. Neurosci. 32(30), 10784-10798.
Krotenko, N.M., Boiko, A.S., Yepanchintseva, Y.M., Ivanova, S.A., 2012. Pokazateli okislitel'nogo stressa i endogennoj in-toksikacii v perifericheskoj krovi u bol'nih s ekzogenno-organicheskimi rasstrojstvami v dinamike farmakoterapii [Parameters oxidative stress and endogenous intoxication of peripheral blood in patients with exogenous organic disorders in dynamic of the pharmacotherapy]. Bjulleten' Sibir-skoj Medicini 1, 179-185 (in Russian).
Loury, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, R.L., Randall, R.J., 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193(2), 265-275.
Madro, A., Slomka, M., Celinski, K., 2011. Can we expect progress in the treatment of fibrosis in the course of chronic pancreatitis? Adv. Med. Sci. 56, 132-137.
Makarchuk, V.A., Ushakova, G.A., Krylova, O.O., 2013. Stan sistemi glutationu in krovi schuriv ta osoblivosti morfologichnih zmin tkanini pidshlunkovoi zalozi za umov eksperimentalnogo gostrogo ta hronichnogo pancreatitu [The state of glutathione system in the rat blood and peculiarities of morphological changes of the pancreas under experimental acute and chronic pancreatitis]. Ukr. Biohim. Zh. 85(1), 45-52 (in Ukrainian).
Mao, X., Schwend, T., Conrad, G.W., 2012. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic
acid during chick corneal development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53(3), 1234-1243.
Masamune, A., Watanabe, T., Kikuta, K., Shimosegawa, T., 2009. Roles of pancreatic stellate cells in pancreatic Inflammation and fibrosis. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 48-54.
Merinova, N.I., Kozlova, N.M., Kolsnichenko, L.S., Suslov, A.I., Leonov, Z.A., 2013. Pokazateli perekisnogo okislenija lipidov i glutationovoj antioksidantnoj zasshiti u bol'nih s obostreniem chronicheskogo pankreatita [Indicators of lipid peroxidation and glutathione antioxidant defense in patients with exacerbation of chronic pancreatitis]. Saratov J. Med. Sci. Res. 9(2), 259-262 (in Russian).
Ngo, T.T., Lenhoff, H.M., Yaklich, A., 1988. Immunofermentnij analiz [Enzyme immunoassay]. Ed. T.T. Ngo, G. Lenhoff. Mir, Moscow (in Russian).
Nielsen, J., Gotfryd, K., Li, S., Kulahin, N., Soroka, V., Ras-mussen, K.K., Bock, E., Berezin, V., 2009. Role of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)-neural cell adhesion molecule (NCAM) interactions in induction of neurite outgrowth and identification of a binding site for NCAM in the heel region of GDNF. J. Neurosci. 36(29), 11360-11376.
Nikolskaya, V., Danilchenko, U., Memetova, Z., 2013. Bio-himicheskij aspekt rassmotrenija roli molekul srednej massi v organizme [Biochemical aspects of the consideration of the role of high molecular mass in the body]. Uchenie Zapiski Tavricheskogo Nac. Univ. im. V.I. Vernadskogo Serija Biologija, Himija 26(1), 139-145 (in Russian).
Nykolaychik, V.V., Moyn, V.M., Kirkovskiy, V. Mazur, L.I., Lobacheva, G.A., Bychko, T.N., 1991. Sposob opredelenija «Srednih molekul» [Method for determining «average molecules»]. Lab. Delo 10, 13-18 (in Russian).
Osadchuk, M.A., 1979. Metodi issledovanija oksiprolina v krovi i moche [Methods of hydroxyproline in blood and urine]. Lab. Delo 8, 456-458 (in Russian).
Ovsyannikova, L.M., Alekhin, S.M., Drobinska, A., 1999. Bio-chimichni i biofizychni metodi ocinky porushen' okislju-val'nogo gomeostazu v osib, scho zaznali radiacijnogo vplivu vnaslidok avarii na ChAES [Biochemical and biophysical methods for assessing violations of oxidative ho-meostasis in individuals exposed to radiation exposure due to the Chernobyl accident]. Chornobilinterinform, Kyiv (in Ukrainian).
Page, B.J., Toit, D.F., Muller, C.J.F., Mattysen, J., Lyners, R., 2000. An immunocytochemical profile of the endocrine pancreas using an occlusive duct ligation model. Journal of the Pancreas 4(1), 191-203.
Petri, A., Sabin, K., 2003. Nagljadnaja statistika v medicine [Visual statistics in medicine]. Geotar-Med, Moscow (in Russian).
Sapozhnikov, A.G., Dorosevich, A.E., 2000. Histologicheskaja i mikroskopicheskaja tehnika [The histological and microscopic technique], Izdatel'stvo SAU, Smolensk (in Russian).
Shklovsky, V.M., Alfyorova, V.V., Misionzhnik, E.Y., Krasnov, V.N., Gusev, E.I., Uzbekov, M.G., Gekht, A.B., Lukyanyuk, E.V., 2011. Znachenie sindroma endogennoj intoksikacii dlja vosstanovlenija narushennih funkcij posle ishemicheskogo insul'ta [The role of autointoxication in functional rehabilitation after ischemic stroke]. Nevrologija 63(4), 27-30 (in Russian).
Tereshenko, O.A., Botashev, A.A., Pomeshik, Y.V., Petrosyan, E.A., Sergienko, V.I., 2012. Sindrom endogennoj intoksi-kacii i sistemnoj vospalitel'noj reakcii pri zhelchnom peritonite, oslozhnennom abdominal'nim sepsisom [Endogenous intoxication syndrome and system inflammatory reaction in choleperitonitis, complicated by abdominal sepsis]. Vestnik Eksp. i Klin. Hirurgii 5(4), 722-726 (in Russian).
Tropina, I.V., Morozov, S.V., Dolgih, V.T., Poluektov, V.L., Ershov, A.V., 2010. Endogennaja intoksikacija u bol'nih s postnekroticheskimi kistami podzheludochnoj zhelezi [En-
dogenous intoxication in patients with postnecrotic pancreatic cysts]. Vestnik VolGMY 33(1), 97-98 (in Russian).
Uzbekov, M.G., Alferova, V.V., Gekht, A.B., Misionzhnik, E.Y., 2010. K voprosu o patohimicheskih izmenenijah sis-temi metabolicheskogo gomeostaza v ostrom periode ishemicheskogo insyl'ta [About pathochemical changes of the system of metabolic homeostasis in acute period of ischemic stroke]. Ross. Mediko-Biologicheskij Vestnik im. I.P. Pavlova 3, 72-76 (in Russian).
Venkatasubramanian, P.N., 2012. Imaging the pancreatic ECM. Ed. P.J. Grippo, H.G. Munshi. Transworld Research Network, pp. 11-27.
Zecchini, S., Bombardelli, L., Decio, A., Bianchi, M., Mazzarol, G., Sanguineti, F., Aletti, G., Maddaluno, L., Berezin, V., Bock, E., Casadio, C., Viale, G., Colombo, N., Giavazzi, R., Cavallaro, U., 2011. The adhesion molecule NCAM promotes ovarian cancer progression via FGFR signaling. EMBO Mol. Med. 3(8), 480-494.
Zhang, X.-P., Hua, T., 2007. Pathogenesis of pancreatic encephalopathy in severe acute pancreatitis. Hepatobiliary Pan-creat. Dis. Int. 6(2), 134-140.
Hadiumna do редкonегii 23.08.2014
