CC BY
81
УДК 630.181:630.425
СОДЕРЖАНИЕ ФЕНОЛОВ В КОРЕ ЕЛИ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ТЕХНОГЕННОЙ СУКЦЕССИИ БИОГЕОЦЕНОЗОВ КОЛЬСКОГО ПОЛУОСТРОВА
© Н.А. Артемкина , Т. Т. Горбачева
Институт проблем промышленной экологии Севера Кольского НЦ УрО РАН, ул. Ферсмана, д.14а Мурманская обл., г. Апатиты, 184209 (Россия)
Е-mail: artemkina@inep.ksc.ru, gorbacheva@inep.ksc.ru
Исследованы особенности изменения общего содержания фенолов и их мономерных форм в коре ели Р(ееа оЪоуМа Ье<!еЬ на разных стадиях техногенной сукцессии. Наблюдаются существенные различия в содержании феруловой, ванилиновой и резорциловой кислот. Отмечен нелинейный характер изменения содержания фенолов в коре с максимумом на стадии дефолиирующих лесов. Полученные результаты позволяют считать изменения, происходящие в метаболизме фенолов, неспецифической реакцией растительного организма на стресс.
Ключевые слова: галловая кислота, Р-резорциловая кислота, 3,4-дигидроксиацетофенон, сиреневая кислота, ванилиновая кислота, кофейная кислота, п-гидроксибензойная, п-гидроксиацетофенон, вератровая, феруловая, фенолкарбоно-вые кислоты, низкомолекулярные фенолокислоты и производные ацетофенона.
Введение
В мониторинговых исследованиях влияния техногенного загрязнения на лесные биогеоценозы одним из наиболее приемлемых биоиндикаторов признается наружный 3-сантиметровый слой коры древесных пород [1]. Пробоотбор коры не требует больших затрат, доступен и прост в исполнении. Кроме того, кора может быть признана наиболее рациональным объектом изучения процессов трансформации биоценозов при их существенной деградации. Так, на стадии техногенного редколесья и техногенной пустоши в связи с полной деградацией лишайниково-мохового яруса могут отсутствовать другие виды широко известных биоиндикаторов, таких как мхи и лишайники, химический состав которых в целом признается более информативным параметром.
При выборе биохимических индикаторов состояния растительности в условиях влияния стрессовых факторов особое внимание уделяется общему содержанию фенолов и их мономерных форм, в частности, фе-нолкарбоновых (оксибензойных и оксикоричных) кислот и производных ацетофенона [2, 3]. Устойчивость растений к стрессовым факторам связывают с повышением уровня содержания указанных вторичных метаболитов, что дублирует функции первичного метаболизма [4]. Вопрос накопления вторичных метаболитов в растительности под влиянием стрессовых факторов весьма подробно изучен [2, 3, 5-7]. Однако практически не уделялось внимания оценке их мобильности и тенденциям трансформации в эпифитной зоне в условиях техногенной сукцессии, что в немалой степени обусловлено проблемами аналитического определения.
Цель данной работы - подбор условий разделения и хроматографического анализа отдельных фенолкарбо-новых кислот при условии выбора коры в качестве объекта исследования, а также изучение тенденций изменения содержания потенциально мобильных фенольных форм как ответной реакции на произрастание в условиях воздействия техногенных факторов разной степени интенсивности. Одними из основных групп органических соединений, наиболее мобильных на начальной стадии деградации растительности, признаются гидролизуемые фенольные формы, в частности, танины [8] и мономерные фенольные компоненты [9].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объектами исследования послужила кора ели Picea obovata Ledeb, произрастающей на территории Кольского полуострова. Работы проводились на стационарных мониторинговых площадках, соответствующих разным стадиям техногенной сукцессии еловых биогеоценозов: фон, дефолиирующие леса (ДЛ), техногенное редколесье (ТР). Детальное описание мониторинговых площадок и методов мониторинга приведено в работе [10].
Образцы наружного 1-сантиметрового слоя коры отбирали с пяти модельных деревьев на каждой из трех площадок. Отбор проб проводился на уровне 1,5 м от поверхности почвы во избежание возможного влияния на кору брызг от почвы в период ливневых осадков.
Предварительная пробоподготовка. Усредненные пробы высушивали до воздушно-сухого состояния, измельчали на механической мельнице и просеивали через сито с размером ячеек 2 мм. Расчет результатов всех перечисленных ниже анализов проводили в пересчете на абсолютно-сухую массу.
Навеску 0,2 г помещали в полипропиленовую пробирку с пробкой, заливали 10 мл этанола, настаивали 24 ч. Экстракт осторожно отделяли от твердой фазы, которую промывали этанолом еще 2 раза по 5 мл. Экстракты объединяли, растворитель удаляли. Отгонку растворителя осуществляли на ротационном испарителе ИР-1М2 под вакуумом при температуре не выше 40 °С во избежание термической деструкции соединений. Суммарный экстракт растворяли в 3 мл 70%-ного этанола, помещали в полипропиленовый шприц (10 мл) и три раза промывали гексаном (по 5 мл) для удаления липофильных примесей. Экстракт обрабатывали ди-этиловым эфиром (4 раза по 2 мл) с целью извлечения низкомолекулярных фенолкарбоновых кислот и производных ацетофенона. Эфирные фракции объединяли и отгоняли растворитель на ротационном испарителе ИР-1М2 под вакуумом при температуре не выше 20 °С. Полученный таким образом диэтиловый экстракт растворяли в 1 мл растворителя (этанол - 1%-ная уксусная кислота : 50-50). Пробы фильтровали через фторопластовые мембраны (0,45 мкм, 0 13 мм) и исследовали методом ВЭЖХ.
Хроматографическое разделение. Хроматографический анализ проводили в изократическом режиме на жидкостном хроматографе Стайер с спектрофотометрическим детектором UVV-104 (при длине волны 270 нм) и программным обеспечением «МультиХром». Колонка Luna 250x4,6 мм («Phenomenex») с сорбентом С18 (ODS), размер частиц 5 мкм. Растворители: уксусная кислота, этанол («Химреактив», С-Петербург). Элюент - 1% СН3СООН - С2Н5ОН : 83 - 17, скорость потока - 1,10 мл/мин, объем инжекции - 20 мкл. Во время разработки условий анализа использовали метод абсолютной градуировки для десяти индивидуальных соединений (табл. 1 и 2).
При построении калибровочных графиков для каждого вещества использовали четыре значения концентрации: 1; 0,5; 0,25; 0,125 мг/мл. В таблице 2 представлены хроматографические параметры разделения индивидуальных фенольных соединений. Показатель предела обнаружения рассчитывали по формуле:
ПО= а / §п,
где Q - концентрация компонента i; §п - площадь пика компонента i.
Остальные параметры разделения были рассчитаны программным обеспечением «МультиХром».
Таблица 1. Химические структуры идентифицированных фенольных соединений
Компоненты R1 R2 R3 R4 R5
п-гидроксибензойная СООН ОН
R1 Сиреневая СООН ОСН3 ОН ОСН3
Л r2 Галловая СООН ОН ОН ОН
г^Г 2 Ванилиновая СООН ОСН3 ОН
R R R Р-резорциловая СООН ОН ОН
r4 Феруловая СН=СН-СООН ОСН3 ОН
Кофейная СН=СН-СООН ОН ОН
п-гидроксиацетофенон СО-СН3 ОН
3,4-дигидроксиацетофенон СО-СН3 ОН ОН
Таблица 2. Хроматографические параметры определения фенольных соединений
Фенольные соединения ПО, нг/мл Ккорр СКО, % 1;к, мин
Галловая кислота 6,9 0,9997 3,9 3,94
Р-резорциловая кислота 64,9 0,9995 2,6 6,29
3,4-дигидроксиацетофенон 8,4 0,9996 4,0 10,28
Сиреневая кислота 8,7 0,9996 4,2 11,56
Ванилиновая кислота 9,0 0,9996 4,1 12,59
Кофейная кислота 13,4 0,9995 5,1 14,51
п-гидроксибензойная кислота 4,1 0,9997 3,4 15,13
п-гидроксиацетофенон 3,7 0,9996 2,8 18,00
Вератровая кислота 11,9 0,9995 3,7 25,56
Феруловая кислота 14,7 0,9996 4,7 28,07
Примечание. ПО - предел обнаружения; Ккорр - коэффициент корреляции; СКО - относительная величина среднеквад-
ратического отклонения; - время удерживания компонента.
Фотоколориметрический метод определения общего содержания фенольных соединений. Определение общего содержания фенолов проводили по методу Свейна-Хиллиса с реактивом Фолина-Чокальте после многократной экстракции размолотых образцов коры этанолом [11]. В основе метода лежит фотоко-лориметрирование окрашенных соединений, являющихся продуктами окислительно-восстановительной реакции [12]. Этими соединениями являются либо фосфорно-молибденовая (ФМК), либо фосфорновольфрамовая кислоты (ФВК), в восстановленной форме имеющие голубую окраску. В составе этанольного экстракта доминируют легко окисляемые соединения, включающие танины и другие, неконденсированные формы фенолов [13]. Расчет количества фенольных соединений производили по калибровочным графикам, построенным по кверцетину.
Определение содержания отдельных химических элементов. Содержание химических элементов определяли в вытяжке после мокрого озоления концентрированной азотной кислотой. Содержание К определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии; Са, М^, А1, Бе, 2п, Си, N1, Мп - методом атомноабсорбционной спектрометрии; Р - фотоколориметрическим методом по интенсивности окраски фосфорномолибденового комплекса; 8 - турбидиметрическим методом. Общее содержание С и N определяли методом Тюрина и Къельдаля соответственно.
Обсуждение результатов
Анализ общего содержания фенолов, углерода и азота проводился для предварительной оценки уровня их содержания и предположения о вероятных тенденциях в накоплении мономерных фенольных форм. Динамика общего содержания фенолов, углерода и азота представлена в таблице 3.
Четко выраженных различий в общем содержании фенолов, углерода и азота в коре ели на разных стадиях техногенной сукцессии не было обнаружено, в связи с чем указанные параметры были признаны слабо информативными для индикации состояния древостоя при выборе коры в качестве биоиндикатора. Однако исследование их взаимосвязи с минеральными компонентами коры ели, приведенное ниже, может оказаться полезной процедурой в оценке эффективности пробоподготовки, а также прогнозной оценки тенденций изменения мономерных форм при увеличении техногенной нагрузки. Содержание минеральных компонентов в образцах коры ели на разных стадиях техногенной сукцессии представлено в таблице 4.
Таблица 4. Содержание химических элементов в коре ели (мг/кг).
Стадия техногенной сукцессии Са Мg К А1 Ее Мп 7п N1 Си Р Б
ТР 11145 167 299 84 125 107 104 96 107 145 2258
ДЛ 14103 153 331 151 135 246 135 34 38 132 528
фон 11679 631 1343 231 70 630 187 7 5 426 523
Таблица 3. Динамика общего содержания фенолов, углерода и азота в коре ели
Стадия техногенной сукцессии Фенолы, мг/г Собщ, % Я мг/кг
ТР 262,73 52,86 4489
ДЛ 282,25 54,09 3749
фон 243,08 55,38 4348
Результаты корреляционного анализа (табл. 5) указывают на то, что при увеличении техногенной нагрузки, вызывающей снижение содержания элементов питания Мg, К, Мп, 2и, Р в коре, уровень содержания фенолов возрастает. В свою очередь, осаждение пылевых выбросов с высоким содержанием Са, Бе как природного, так и антропогенного происхождения, может вызывать аккумуляцию фенольных соединений на коре, на что указывает положительная корреляция этих элементов и фенолов. В коре ели отмечена статистически значимая отрицательная корреляционная зависимость между содержанием фенолов и А1. Это свидетельствует о возможном формировании очень прочных фенольных комплексов, что не позволяет классифицировать их как свободные фенольные формы при применявшейся экстракции этанолом. Чем больше содержание А1 в коре, тем меньше в ней остается наиболее реакционноспособных свободных фенольных форм. Тесная взаимосвязь фенолов с рядом элементов указывает на существенное влияние минеральной фазы в процессах аккумуляции простых фенолов в наружном слое коры.
Химический состав отдельных групп и индивидуальных фенольных соединений коры Псва вЬву^а подробно изучен [14-16]. Отмечено, что простые фенолы, молекулы которых содержат одно бензольное кольцо, представлены главным образом промежуточными и побочными продуктами биосинтеза лигнина. В исследованных нами образцах коры были идентифицированы 9 мономерных фенольных форм: ванилиновая, р-резорциловая, п-гидроксибензойная, феруловая, галловая, сиреневая и кофейная кислоты, п-гидроксиацетофенон и 3,4-дигидроксиацетофенон (табл. 6).
Состав простых фенолов в коре ели на условно-фоновой территории существенно отличается по набору химических соединений от последующих стадий техногенной сукцессии еловых биогеоценозов:
П-гидроксиацетофенон и 3,4-дигидроксиацетофенон. Обнаружены в коре ели только в фоновых условиях. Присутствие производных ацетофенона является характерным для хвои растений рода Псва (семейство Ршасеае) [17, 18]. П-гидроксиацетофену отводят важную экологическую роль, связанную с фунгистати-ческими свойствами [19]. Широко известен аллелопатический эффект данного соединения как ингибитора роста [20]. Снижение биоразнообразия эпифитной биоты может являться причиной отсутствия ацетофенона в наружном слое коры ели в условиях техногенного загрязнения.
Феруловая и ванилиновая кислоты. Ванилиновая кислота наряду с я-гидроксибензойной и соответствующими им альдегидами (я-гидроксибензальдегидом и ванилином) признается наиболее устойчивыми к биодеградации фенольными соединениями [21], поэтому она идентифицирована на всех стадиях трансформации.
На стадии дефолиации отмечается существенный рост содержания ванилиновой и феруловой кислот в коре по сравнению с фоновыми условиями, на стадии техногенного редколесья феруловая кислота не идентифицирована, а содержание ванилиновой кислоты на порядок выше фоновых значений. Ванилиновая кислота считается одним из основных продуктов биодеградации лигнина [22]. Ее наличие свидетельствует о начале деполимеризации лигниновых структур на стадии старения клетки. Причиной повышения содержания феруловой и ванилиновой кислот в коре может являться процесс фотодеструкции (окисления лигнина под действием естественного ультрафиолета) [23] в связи с существенной разреженностью кроны как следствие дефолиации.
Таблица 5. Коэффициенты корреляции между содержанием фенолов и химических элементов в коре ели
Группа С N Са Мg К А1 Ее Мп 7п N1 Си Р Б
Фенолы -0,53 -0,75 0,76 -0,89 -0,90 -0,56 0,94 -0,72 -0,63 0,31 0,33 -0,89 0,02
Таблица 6. Динамика содержания фенолов в коре ели на разных стадиях техногенной сукцессии
Содержание фенольных соединений, мг/г
Стадия техногенной сукцессии ванилиновая кислота феруловая кислота к сион * й & « 2 е 1 К й і к сн к ё рон ре ие ■ г? ,4 а 3, резорциловая кислота саа кнт 0!§0 чйо & ю яа ат § ° § и лс али 2 * І ^ Й о !§ оки кк сиреневая кислота д з § 5. ° уо о щ ен ф
ТР 0,24 - - - 2,33 0,05 0,07 0,11 0,06 2,86
ДЛ 2,17 2,22 - - 0,83 - 0,05 0,02 0,03 5,32
Фон 0,03 0,03 0,24 0,02 - - - - - 0,32
Примечание: Прочерк означает ниже предела обнаружения.
Р-резорциловая, п-гидроксибензойная, галловая, кофейная и сиреневая кислоты. При техногенной сукцессии в коре ели появляется целый ряд фенолокислот, отсутствующий в образцах коры, отобранной на фоновой территории. К этому ряду принадлежат: Р-резорциловая, и-гидроксибензойная, галловая, кофейная и сиреневая кислоты (табл. 4). Все указанные кислоты принадлежат к группе многочисленных продуктов гидролиза лигнин-целлюлозного комплекса.
Резорциловая кислота относится к группе дигидроксибензойных кислот с гидроксилом, находящимся в ортоположении по отношению к карбоксильным группам. Такого рода кислоты характеризуются относительно высокими константами диссоциации, что связывают с отрицательным индуктивным эффектом групп -OH. Диссоциация обусловливает стабилизацию фенолят-ионов и активную водную миграцию, либо необратимую сорбцию на минеральной фазе. Максимальные содержания резорциловой кислоты обнаружены на стадии техногенного редколесья. Практически полная изреженность кроны на этой стадии вызывает увеличение объема стволовых вод и активное выщелачивание органических соединений из наружного слоя коры, а осаждение минеральных частиц за счет пыления эродированных поверхностей способствует аккумуляции фенолокислот.
Сиреневая кислота относится к группе метоксибензойных кислот. Известно, что грибная микрофлора способна деметилировать метоксибензойные кислоты [20], поэтому в фоновых условиях при высоком биоразнообразии эпифитной микобиоты сиреневая кислота в коре не обнаруживается.
П-гидроксибензойная кислота под действием грибной микрофлоры трансформируется в протокатеховую кислоту, продуктом дальнейшей деградации которой являются соединения алифатического ряда, в частности, сукцинаты [24]. Отмечается также полная минерализация п-гидроксибензойной кислоты. Так, Martin и Haider показали, что в природных условиях до 95% внесенного в почву препарата этого компонента минерализуется в течение 1 недели [22]. П-гидроксибензойная кислота обнаружена только на стадии техногенного редколесья. Ее присутствие в коре ели на этой стадии может быть связано с фотодеструкцией высокомолекулярных фенольных форм либо с десорбцией с минеральной фазы.
В динамике суммы простых фенолов прослеживается нелинейная зависимость с максимумом содержания суммы фенолокислот в дефолиирующих лесах, когда эффективно действуют адаптационные механизмы древостоя. На стадии техногенного редколесья происходит разрушение биогеоценозов, нарушение питательного режима почв. Характерными особенностями этой стадии трансформации являются резкое снижение биоразнообразия, снижение аллелопатического эффекта, вымывание фенолов из коры за счет агрессивных стволовых вод, снижение свободных форм фенолов за счет взаимодействия с пылевыми компонентами эродированных поверхностей (Al, Fe). На данной стадии абиогенные факторы могут становиться преобладающими в динамике содержания фенолов.
Заключение
Ответом на воздействие такого стрессового фактора как техногенное загрязнение является изменение состава и повышение содержания веществ вторичного метаболизма (фенолокислот и производных ацетофено-на) в коре Picea obovata. Отмечен нелинейный характер изменения содержания индивидуальных фенольных соединений в коре на разных стадиях техногенной сукцессии еловых биогеоценозов и существенная роль абиогенных факторов в аккумуляции фенолов. Для индикации состояния биоценоза содержание мономерных форм фенолов, переходящих в эфир, признано более информативным параметром, чем общее содержание фенольных соединений.
Список литературы
1. Wolterbeek H.Th., Bode P. Strategies in sampling and sample handling in the context of large-scale plant biomonitoring surveys of trace element air pollution // The Science of the Total Environment. 1995. C. 33-43.
2. Wild A., Schmitt V. Diagnosis of damage to Norway spruce (Picea abies) through biochemical criteria // Physiologia Plantarium. 1995. V. 93. №2. P. 375-382.
3. Фуксман И.Л., Новицкая Л.Л., Исидоров В.А., Рощин В.И. Фенольные соединения хвойных деревьев в условиях стресса // Лесоведение. 2005. №3. С. 4-10.
4. Носов А.М. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro // Физиология растений. 1994. Т. 41. №6. С. 873-878.
5. Фуксман И.Л., Исидоров В.А., Рощин В.И., Артемкина Н.А. и др. Использование вторичных метаболитов для характеристики физиологического состояния хвойных растений в стрессовых условиях // Проблемы сохране-
ния биоразнообразия в наземных и морских экосистемах: Тез. докл. межд. конф. и выездной сессии отделения общей биологии РАН. Апатиты, 2001. С. 97.
6. Фуксман И. Л., Рощин В.И., Артемкина Н.А., Исидоров В.А. и др. Вторичные метаболиты хвойных растений в условиях стресса при техногенном загрязнении и поражении деревьев грибными заболеваниями // Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке: Тез. докл. междунар. конф. Сыктывкар, 2001. С. 358-359.
7. Калачева Н.В., Кашулин П.А., Артемкина Н.А. Биологически активные вещества хвойных пород Европейского севера // Материалы I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. СПб, 2006. С. 247-248.
8. Kraus T.E.C., Yu Z., Preston C.M., Dahlgren R.A., Zasoski R.J. Linking chemical reactivity and protein precipitation to structural characteristics of foliar tannins // J. Chem. Ecol. 2003. V. 29. №3. P. 703-730.
9. Gallet C., Pellissier F. Phenolic compounds in natural solutions of a coniferous forest // J. Chem. Ecol. 1997. V. 23. P. 2401-2412.
10. Лукина Н.В., Никонов В.В. Биогеохимические циклы в лесах Севера в условиях аэротехногенного загрязнения: В 2-х ч. Апатиты, 1996. Ч. 1. 213 с.; Ч. 2. 192 с.
11. Swain J., Hillis W.E. The phenolic constituents of Prunus domestica. The quantitative analysis of phenolic constituents // J. Sci. Food and Agr. 1959. V.10. P. 63-68.
12. Waterman P.G., Mole S. Analysis of Phenolic Plant Metabolites. Blackwell Scientific Publications. London. 1994.
13. Schofield J.A., Hagerman A.E., Harold A. Loss of tannins and other phenolics from willow leaf litter // J. Chem.Ecol. 1998. V. 24. P. 1409-1421.
14. Громова А.С., Луцкий В.И., Тюкавкина Н.А. Сложные эфиры фенолокислот коры Picea ajanensis, Picea koraen-sis, Picea obovata // Химия природных соединений. 1976. №2. С. 259-260.
15. Громова А.С., Луцкий В.И., Тюкавкина Н.А. Фенолокислоты и их производные из коры некоторых видов пихты, ели и сосны // Химия древесины. 1978. №4. С. 99-102.
16. Шибанова Г.И., Громова А.С., Кислицина Л.А., Тюкавкина Н.А. Фенольные соединения внутренней и внешней коры Picea obovata // Изв. СО АН СССР, Серия химическая. 1977. Вып. 5. С. 153-155.
17. Иванова С.3., Медведева С.А., Тюкавкина Н.А. Ацетофеноны хвои некоторых видов семейства Ртасеае // Химия древесины. 1978. №1. С. 103-108.
18. Hoque E. Norway spruce die back: isolation, biologikal activity, measurement on concentration of p-hydroxyacetophenone and its O-glucoside (picein) by gas-chromatography // Eur. J. Forest. Pathol. I984. V. 14. №6. P. 377-382.
19. Osswald W.F., Zieboll S., Schutz W., Firl J., Elstner E.F. p-hydroxyacetophenone- a fungi toxic compound in spruce needles // J. Plant Dis. Protect. 1987. V. 94. P. 572-577.
20. Биохимия фенольных соединений / Под ред. Д. Харборна. М., 1968. 452 с.
21. Morita H. Changes in phenolic composition of peat soil due to cultivation // Soil Sci. 1981. V. 131. P. 30-33.
22. Martin J.P., Haider K. Microbial degradation and stabilization of 14C-labeled lignins, phenols, and phenolic polymers in relation to soil humus formation / Eds. Kirk T.K. et al. / Lignin biodegradation: Microbiology, chemistry and potential applications. Florida: CRC Press, Boca Raton, 1980. P. 77-100.
23. Ковалева Н.О., Ковалев И.В. Ароматические структуры лигнина в органическом веществе серых лесных почв // Почвоведение. 2002. №2. С. 23-29.
24. Barz W., Weltring K. M. Biodegradation of aromatic extractives of wood / Ed. Higuchi T. / Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components. San Diego, California: Academic Press, 1985. P. 607-662.
Поступило в редакцию 29 мая 2008 г.
