CC BY
34
2017, Т. 159, кн. 2 С.206-216
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
УДК 576.32/.36
СНИЖЕНИЕ ОСТЕОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ МИКРОГРАВИТАЦИИ
А.Ю. Ратушный, О.В. Григорьева, Л.Б. Буравкова
Институт медико-биологических проблем Российской академии наук, г. Москва, 123007, Россия
Аннотация
Снижение минерализации костной ткани во время длительных космических полетов требует понимания клеточных механизмов данного процесса. Изучение влияния 30-дневного моделирования микрогравитации с помощью 2D-клиностатирования показало снижение остеогенного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромаль-ных клеток in vitro. Обнаружено подавление экспрессии генов остеогенеза и увеличение экспрессии PPARy - ключевого регулятора адипогенеза. Предполагается, что сдвиг дифференцировочного потенциала может быть обусловлен увеличением уровня активных форм кислорода, регулирующих ряд внутриклеточных сигнальных каскадов.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), моделированная микрогравитация, остеогенная дифференцировка, активные формы кислорода (АФК)
Введение
Полувековой период освоения космоса человеком убедительно показал, что одной из уязвимых функциональных систем в условиях микрогравитации (невесомости) является опорно-двигательный аппарат. Особый интерес представляет регулирование костного гомеостаза, так как во время космических полетов происходит потеря костной массы со скоростью 1-2% в месяц [1-4]. В последние десятилетия было показано, что действие микрогравитации обнаруживается на уровне не только ткани или организма, но и отдельных клеток. Микрогравитация или ее моделирование могут приводить к изменениям клеточной пролиферации, дифференцировки, экспрессии генов, адгезии, а также влиять на трансдукцию клеточных сигналов и продукцию паракринных факторов [5-10].
Особый интерес представляет влияние микрогравитации на мультипотент-ные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), которые являются одной из популяций стволовых клеток взрослого организма. Работы с данной популяцией начались в 70-х годах прошлого столетия, когда клетки фибробластопо-добной морфологии были выделены из костного мозга. На сегодняшний день ММСК обнаружены практически во всех тканях. Показано, что они обладают
способностью к мультилинейной дифференцировке, а также способны выделять биологически активные медиаторы, влияющие на функционирование соседних клеток. Таким образом, ММСК вовлечены в поддержание тканевого гомеостаза, включая регенерацию повреждений и адаптацию к изменяющимся факторам среды [11-16]. Являясь механочувствительными клетками, ММСК способны изменять функциональное состояние в условиях микрогравитации, что может являться одной из причин развития в длительных космических полетах характерных отклонений, таких как остеопения [3, 17].
Так как возможности проведения экспериментов на околоземной орбите ограничены, исследователи применяют различные способы моделирования микрогравитации на Земле. Одним из таких широко используемых подходов при работе с клеточными культурами является метод клиностатирования, который позволяет постоянно изменять положение клеточного монослоя относительно вектора гравитации. Целью данного метода является поддержание стабильной локализации внутриклеточных частиц в цитоплазме, не позволяя им «оседать» [18-20].
Цель настоящей работы заключалась в изучении остеогенного потенциала ММСК в условиях продолжительной моделированной микрогравитации.
1. Материалы и методы
При проведении экспериментов использовали ММСК, полученные из жировой ткани человека по методике П.А. Зак с соавторами [21] с модификациями, описанными в работе [22]. Культивирование осуществляли в среде а-МЕМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина. Иммунофенотип (CD73+, CD90+, CD105+) [12] подтверждали при помощи специфических антител (IO Test, Beckman Coulter) методом проточной цитофлуориметрии на приборе Accuri C6 (BD, США).
Моделирование условий микрогравитации осуществляли с помощью метода 2D-клиностатирования на протяжении 30 дней. Клетки, предварительно посаженные во флаконы за 72 ч до эксперимента в стандартной плотности 3000 кл/см , помещали на платформы клиностата и шейкера (для анализа вклада перемешивания среды), третий флакон являлся статическим контролем.
Тотальную РНК выделяли с использованием лизирующего реагента QIAzol (Qiagen, США). Обратную транскрипцию проводили с помощью набора QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, США). Относительную экспрессию определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров (Qiagen, США) на приборе MX3000P (Stratagene, США).
Индуцированную (при добавлении в среду индукторов дифференцировки -Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis Kit (Millipore, США) и спонтанную (без индукторов) дифференцировки осуществляли после пересева клеток из флаконов в чашки Петри, после завершения клиностатирования. Степень дифферен-цировки культур в остеогенном направлении оценивали окрашиванием на минерализованный внеклеточный матрикс ализариновым красным. Для количественной оценки связавшийся краситель растворяли в ДМСО, после чего измеряли оптическую плотность при длине волны 405 нм.
Детекцию активных форм кислорода в ММСК проводили с помощью 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетата (H2DCFDA) (Sigma, США). Для окрашивания клеток H2DCFDA, растворенный в ДМСО, вносили в среду культивирования ММСК в конечной концентрации 20 мкМ. Инкубацию клеток с H2DCFDA проводили 30 мин при 37 °С и 5%-ном CO2. Анализировали клетки на проточном цитофлуориметре Accuri C6 (BD, США).
Достоверность различий подтверждали при помощи непараметрического критерия Манна - Уитни. Звездочкой обозначены значимые отличия от контроля, p < 0.05.
2. Результаты
После 30-дневного клиностатирования был подтвержден иммунофенотип ММСК - CD73+, CD90+, CD105+. Затем клетки были рассеяны на отдельные чашки для изучения индуцированной и спонтанной дифференцировок. Окрашивание ализариновым красным через 21 день выявило уменьшение количества минерализованного матрикса в ряду «статический контроль - шейкер - клино-стат (рис. 1). Количественная оценка показала снижение оптической плотности связавшегося красителя на 25% (рис. 2).
Статический
Шейкер 2-D клиностат
контроль
Рис. 1. Остеодифференцировка, окрашивание минерализованного матрикса ализариновым красным, световая микроскопия. Увеличение: 100*
Анализ транскрипционной активности ключевого гена остеогенной диффе-ренцировки ММСК выявил снижение количества мРНК ЯиЫХ2 в два раза сразу после клиностатирования. Уменьшалась также экспрессия регулируемых им генов-маркеров остеодифференцировки - ЛЬРЬ-1 (щелочная фосфатаза) и Со1-1 (коллаген I типа). С другой стороны, исследования показали, что происходит увеличение экспрессии гена PPARy (рис. 3).
Исследование уровня активных форм кислорода (АФК) проводили с применением специфического флуоресцентного зонда H2DCFDA. Согласно полученным данным 30-дневное клиностатирование приводило к увеличению среднего уровня флуоресценции H2DCFDA в клетках в 2 раза (рис. 4).
Рис. 2. Количественная оценка уровня минерализации внеклеточного матрикса ММСК путем измерения оптической плотности связавшегося красителя - ализаринового красного, растворенного в ДМСО
2,5
Нстатический контроль
к
и 2 ишейкер
<и |
0 20-клиностат Т ЕЕ
(}иЫХ2 АЬРЫ С01.-1 РРАИС
Рис. 3. Дифференциальная экспрессия генов дифференцировки. Данные представлены как средние значения ± стандартные отклонения. Звездочкой обозначены значимые отличия от контроля, р < 0.05
интенсивность флуоресценции
Рис. 4. Интенсивность флуоресценции Н2ОСБОА, отражающая уровень активных форм кислорода в клетках
3. Обсуждение
В последнее время появляется все больше данных о воздействии микрогравитации на клетки, изменение функциональной активности которых влечет за-собой значительные сдвиги тканевого гомеостаза. Известно, что при моделировании микрогравитации наблюдаются изменения, во многом опосредуемые перестройками цитоскелета, альтернативной экспрессией поверхностных молекул адгезии и интегринов, которые выступают в качестве гравирецепторов [16, 23]. Многими исследователями, изучавшими дифференцировочный потенциал ММСК при коротких экспозициях (6-48 ч), установлено снижение их остео-генного потенциала [3, 19]. Данный эффект связывают именно с перестройками цитоскелета и уменьшением активности RhoA ГТФаз, регулирующих актино-вую динамику клетки [24-26]. Тем не менее в более длительных экспериментах (120 ч) показано частичное или полное восстановление актиновой архитектоники [16], что наводит на мысль о существовании дополнительных механизмов поддержания сниженного остеогенного потенциала ММСК при долговременных экспозициях.
В настоящей работе длительное моделирование эффектов микрогравитации вызывало снижение остеогенного потенциала, на что указывало уменьшение плотности минерализованного матрикса. Анализ экспрессии ключевых диффе-ренцировочных генов RUNX2 и PPARy, а также генов-маркеров остеогенеза выявил характерный сдвиг потенциала в сторону адипогенеза. Известно, что RUNX2 и PPARy являются транскрипционными факторами, которые определяют направление дифференцировки клеток. Так, RUNX2 индуцирует экспрессию генов остеогенного пути, а PPARy - адипогенного. Причем известно, что активация PPARy подавляет RUNX2-опосредованную транскрипцию, направляя диффе-ренцировку по адипогенному пути и ингибируя остеодифференцировку [26, 27]. Одной из причин переключения направлений дифференцировки с остеогенного на адипогенный может быть изменение уровня АФК, которые могут выступать в качестве сигнальных молекул или повреждающих агентов одновременно [28].
АФК являются участниками некоторых сигнальных каскадов, включающих Wnt-, Hedgehog- и FOXO-пути, влияя на многие клеточные процессы. Известно, что умеренное увеличение уровня АФК способствует адипогенной дифференци-ровке через активацию PPARy, ингибируя при этом остеогенный путь [29, 30].
В in vivo исследованиях обнаружено, что увеличение уровня АФК, происходящее с возрастом, приводит к снижению экспрессии генов, регулируемых каноническим ф-катенин-зависимым) Wnt-сигналингом, - Axin2 (axis inhibition protein 2) и Opg (Osteoprotegerin). Axin2 участвует в регуляции стабильности Р-катенина, а Opg может ингибировать активность остеокластов, что увеличивает плотность и объем костной ткани [31]. В присутствии АФК активируется FOXO, после чего происходит его транслокация в ядро, где он запускает транскрипцию ряда антиоксидантов. При этом происходит конкурентное переключение Р-катенина с Wnt-сигналинга на FOXO-опосредованную транскрипцию, что ведет к ингибированию остеогенеза [32]. В клетках-предшественниках остеобластов FOXO нарушает формирование костей посредством ингибирова-ния Wnt-сигналинга [31]. Изучение роли Hedgehog-сигналинга в процессе остео-дифференцировки ММСК, выделенных из костного мозга мышей, показало, что
данный каскад позитивно регулирует остеогенез, но может быть заблокирован высоким уровнем АФК [33].
Таким образом, выявлено снижение остеогенного потенциала ММСК после продолжительного моделирования микрогравитации посредством клиностатирования. Показано, что одной из причин ингибирования остеогенного пути может быть увеличение уровня внутриклеточных АФК.
Благодарности. Работа выполнена при поддержке гранта НШ-7479.2016.4.
Литература
1. Zayzafoon M., Meyers V.E., McDonald J.M. Microgravity: The immune response and bone // Immunol. Rev. - 2005. - V. 208, No 1. - P. 267-280. - doi: 10.1111/j.0105-2896.2005.00330.x.
2. Berg-Johansen B., Liebenberg E.C., Li A., Macias B.R., Hargens A.R., Lotz J.C. Spaceflight-induced bone loss alters failure mode and reduces bending strength in murine spinal segments // J. Orthop. Res. - 2016. - V. 34, No 1. - P. 48-57. - doi: 10.1002/jor.23029.
3. Shi D., Meng R., Deng W., Ding W., Zheng Q., Yuan W., Liu L., Zong C., Shang P., Wang J. Effects of microgravity modeled by large gradient high magnetic field on the osteogenic initiation of human mesenchymal stem cells // Stem Cell Rev. - 2010. - V. 6, No 4. -P. 567-578. - doi: 10.1007/s12015-010-9182-x.
4. Оганов В.С. Костная система, невесомость и остеопороз. - Воронеж: Науч. кн., 2014. - 291 с.
5. Jha R., Wu Q., Singh M., Preininger M.K., Han P., Ding G., Cho H.C., Jo H., Maher K.O., Wagner M.B., Xu C. Simulated microgravity and 3D culture enhance induction, viability, proliferation and differentiation of cardiac progenitors from human pluripotent stem cells // Sci. Rep. - 2016. - V. 6 - Art. 30956, P. 1-14. - doi: 10.1038/srep30956.
6. Lin S.C., Gou G.H., Hsia C.W., Ho C.W., Huang K.L., Wu Y.F., Lee S.Y., Chen Y.H. Simulated microgravity disrupts cytoskeleton organization and increases apoptosis of rat neural crest stem cells via upregulating CXCR4 expression and RhoA-ROCK1-p38 MAPK-p53 signaling // Stem Cells Dev. - 2016. - V. 25, No 15. - P. 1172-1193. - doi: 10.1089/scd.2016.0040.
7. WehlandM., Aleshcheva G., Schulz H., Saar K., Hübner N., Hemmersbach R., Braun M., Ma X., Frett T., Warnke E., Riwaldt S., Pietsch J., Corydon T.J., Infanger M., Grimm D. Differential gene expression of human chondrocytes cultured under short-term altered gravity conditions during parabolic flight maneuvers // Cell Commun. Signaling. - 2015. -V. 13, No 18. - P. 1-13. - doi: 10.1186/s12964-015-0095-9.
8. He L., Pan S., Li Y., Zhang L., Zhang W., Yi H., Song C., Niu Y. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity // Int. Endod. J. - 2016. - V. 49, No 2. - P. 161-173. - doi: 10.1111/iej.12441.
9. Buravkova L.B., Romanov Yu.A., Konstantinova N.A. Buravkov S.V., Gershovich Yu.G., Grivennikov I.A. Cultured stem cells are sensitive to gravity changes // Acta Astronaut. -2008. - V. 63, No 5-6. - P. 603-608. - doi: 10.1016/j.actaastro.2008.04.012.
10. Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. Продукция интерлейкинов в культуре мезенхималь-ных стромальных клеток человека при моделировании эффектов микрогравитации // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2009. - Т. 43, № 3. - С. 44-50.
11. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs // Exp. Hematol. - 1976. - Vol. 4. No 5. - P. 267-274.
12. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. - 2006. - V. 8, No 4. - P. 315-317. - doi: 10.1080/14653240600855905.
13. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells // J. Orthop. Res. - 1991. - V. 9, No 5. -P. 641-650. -doi: 10.1002/jor. 1100090504.
14. Richardson S.M., Kalamegam G., Pushparaj P.N., Matta C., Memic A., Khademhosseini A., Mobasheri R., Poletti F.L., Hoyland J.A., Mobasheri A. Mesenchymal stem cells in regenerative medicine: Focus on articular cartilage and intervertebral disc regeneration // Methods. - 2016. - V. 99. - P. 69-80. - doi: 10.1016/j.ymeth.2015.09.015.
15. Caplan A.I., Dennis J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators // J. Cell Bio-chem. - 2006. - V. 98, No 5. - P. 1076-1084. - doi: 10.1002/jcb.20886.
16. Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. Цитоскелет и адгезия культивируемых стромальных клеток-предшественников костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации // Цитология. - 2009. - Т. 51, № 11. - С. 896-904.
17. Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. Морфофункциональное состояние и остеогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток-предшественников человека при моделировании эффектов микрогравитации in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 4. - С. 196-202.
18. Dedolph R.R., Dipert M.H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation // Plant Physiol. - 1971. - V. 47, No 6. - P. 756-764. - doi: 10.1104/pp.47.6.756.
19. Yan M., Wang Y., YangM., Liu Y., Qu B., Ye Z., Liang W., Sun X., Luo Z. The effects and mechanisms of clinorotation on proliferation and differentiation in bone marrow mesenchymal stem cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2015. - V. 460, No 2. - P. 327-332. -doi: 10.1016/j.bbrc.2015.03.034.
20. Chen Z., Luo Q., Lin C., Song G. Simulated microgravity inhibits osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells through down regulating the transcriptional co-activator TAZ // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2015. - V. 468, No 1-2. - P. 21-26. - doi: 10.1016/j.bbrc.2015.11.006.
21. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies // Tissue Eng. - 2001. - V. 7, No 2. - P. 211-228. - doi: 10.1089/107632701300062859.
22. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Жамбалова А.П., Козионова М.П. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода // Цитология. - 2009. -Т. 51, № 1. - С. 5-11.
23. Corydon T.J., Kopp S., Wehland M., Braun M., Schütte A., Mayer T., Hülsing T., Olt-mann H., Schmitz B., Hemmersbach R., Grimm D. Alterations of the cytoskeleton in human cells in space proved by life-cell imaging // Sci. Rep. - 2016. - V. 6. - Art. 20043, P. 1-14. - doi: 10.1038/srep20043.
24. Meyers V.E., ZayzafoonM., Douglas J.T., McDonaldJ.M. RhoA and cytoskeletal disruption mediate reduced osteoblastogenesis and enhanced adipogenesis of human mesen-chymal stem cells in modeled microgravity // J. Bone Miner. Res. - 2005. - V. 20, No 10. - P. 1858-1866. - doi: 10.1359/JBMR.050611.
25. Chen Z., Luo Q., Lin C., Kuang D., Song G. Simulated microgravity inhibits osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells via depolymerizing F-actin to impede TAZ nuclear translocation // Sci. Rep. - 2016. - V. 6. - Art. 30322, P. 1-11. - doi: 10.1038/srep30322.
26. Буравкова Л.Б., Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Григорьев А.И. Механизмы гравитационной чувствительности остеогенных клеток-предшественников // Acta Naturae. -
2010. - Т. 2, № 1. - С. 30-39.
27. Jeon M.J., Kim J.A., Kwon S.H., Kim S.W., Park K.S., Park S.W., Kim S.Y., Shin C.S. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma inhibits the Runx2-mediated transcription of osteocalcin in osteoblasts // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278, No 26. - P. 23270-23277. - doi: 10.1074/jbc.M211610200.
28. Denu R.A., Hematti P. Effects of oxidative stress on mesenchymal stem cell biology // Oxid. Med. Cell. Longevity. - 2016. - V. 2016. - Art. 2989076, P. 1-9. - doi: 10.1155/2016/2989076.
29. Atashi F., Modarressi A., Pepper M.S. The role of reactive oxygen species in mesenchymal stem cell adipogenic and osteogenic differentiation: A review // Stem Cells Dev. -2015. - V. 24, No 10. - P. 1150-1163. - doi: 10.1089/scd.2014.0484.
30. Tormos K. V., Anso E., Hamanaka R.B., Eisenbart J., Joseph J., Kalyanaraman B., Chan-del N.S. Mitochondrial complex III ROS regulate adipocyte differentiation // Cell Metab. -
2011. - V. 14, No 4. - P. 537-544. - doi: 10.1016/j.cmet.2011.08.007.
31. Almeida M., Han L., Martin-Millan M., O'Brien C.A., Manolagas S.C. Oxidative stress antagonizes Wnt signaling in osteoblast precursors by diverting beta-catenin from T cell factor- to forkhead box O-mediated transcription // J. Biol. Chem. - 2007. - V. 282, No 37. - P. 27298-27305. - doi: 10.1074/jbc.M702811200.
32. Iyer S., Ambrogini E., Bartell S.M., Han L., Roberson P.K., de Cabo R., Jilka R.L., Weinstein R.S., O'Brien C.A., Manolagas S.C., Almeida M. FOXOs attenuate bone formation by suppressing Wnt signaling // J. Clin. Invest. - 2013. - V. 123, No 8. - P. 3409-3419. -doi: 10.1172/JCI68049.
33. Kim W.K., Meliton V., Bourquard N., Hahn T.J., Parhami F. Hedgehog signaling and osteogenic differentiation in multipotent bone marrow stromal cells are inhibited by oxi-dative stress // J. Cell. Biochem. - 2010. - V. 111, No 5. - P. 1199-1209. - doi: 10.1002/jcb.22846.
Поступила в редакцию 30.01.17
Ратушный Андрей Юрьевич, аспирант, младший научный сотрудник Институт медико-биологических проблем Российской академии наук
Хорошевское шоссе, д. 76 А, г. Москва, 123007, Россия E-mail: Ratushkin@mail.ru
Григорьева Ольга Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Институт медико-биологических проблем Российской академии наук Хорошевское шоссе, д. 76 А, г. Москва, 123007, Россия
Буравкова Людмила Борисовна, доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией клеточной физиологии
Институт медико-биологических проблем Российской академии наук Хорошевское шоссе, д. 76 А, г. Москва, 123007, Россия
214
A.M. PATymHblH h gp.
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
UCHENYE ZAPISKI KAZANSKOGO UNIVERSITETA. SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI (Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)
2017, vol. 159, no. 2, pp. 206-216
Osteogenic Potential Reduction in Mesenchymal Stem Cells under Prolonged Simulated Microgravity
A.Y. Ratushnyy , O.V. Grigorieva, L.B. Buravkova
Institute ofBiomedical Problems, Russian Academy of Sciences, Moscow, 123007 Russia
*
E-mail: Ratushkin@mail.ru Received January 30, 2017
Abstract
Increasing the duration of orbital space flights up to 6-12 months and planning interplanetary missions actualizes the need for a better understanding of the mechanisms of osteopenia caused by microgravity. Investigation of mesenchymal stem cells (MSCs) that support the tissue homeostasis under microgravity conditions allows a deeper insight into the processes underlying bone loss. The purpose of this study was to investigate the osteogenic potential of MSCs under prolonged simulated microgravity by clinorotation. Using the method of mineralized matrix detection, it has been found that MSCs osteogenic potential decreased after long-term clinorotation. The investigation of major osteogenic gene expression has showed decreased transcriptional activity in RUNX2, ALPL-1, Col-1, but increased expression of PPARy. One of the reasons for the decreased osteogenic potential of MSCs may be an increased level of reactive oxygen species (ROS) after 30 days of clinorotation. ROS may affect cellular signaling cascades, such as Wnt, Hedgehog and FOXO pathways, thereby leading to a shift of the differentiation potential to adipogenesis.
Keywords: mesenchymal stem cells (MSCs), simulated microgravity, osteogenic differentiation, reactive oxygen species (ROS)
Acknowledgments. The study was supported by the project no. NSh-7479.2016.4.
Figure Captions
Fig. 1. Osteogenic differentiation, alizarin red staining of mineralized matrix, light microscopy. Magnification: 100x.
Fig. 2. Quantitative evaluation of the mineralization level of extracellular MSC matrix by measuring the
optical density of cohered color material (alizarin red) dissolved in DMSO. Fig. 3. Differential expression of differentiation genes. Data are presented as mean values ± standard deviations. Asterisk indicates significant differences (p < 0.05) from control.
Fig. 4. Fluorescence intensity of H2DCFDA showing the level of reactive oxygen species in cells.
References
1. Zayzafoon M., Meyers V.E., McDonald J.M. Microgravity: The immune response and bone. Immunol. Rev., 2005, vol. 208, no. 1, pp. 267-280. doi: 10.1111/j.0105-2896.2005.00330.x.
2. Berg-Johansen B., Liebenberg E.C., Li A., Macias B.R., Hargens A.R., Lotz J.C. Spaceflight-induced bone loss alters failure mode and reduces bending strength in murine spinal segments. J. Orthop. Res., 2016, vol. 34, no. 1, pp. 48-57. doi: 10.1002/jor.23029.
3. Shi D., Meng R., Deng W., Ding W., Zheng Q., Yuan W., Liu L., Zong C., Shang P., Wang J. Effects of microgravity modeled by large gradient high magnetic field on the osteogenic initiation of human mes-enchymal stem cells. Stem Cell Rev, 2010, vol. 6, no. 4, pp. 567-578. doi: 10.1007/s12015-010-9182-x.
4. Oganov V. S. Bone System, Weightlessness, and Osteoporosis. Voronezh, Nauchn. Kn., 2014. 291 p. (In Russian)
5. Jha R., Wu Q., Singh M., Preininger M.K., Han P., Ding G., Cho H.C., Jo H., Maher K.O., Wagner M.B., Xu C. Simulated microgravity and 3D culture enhance induction, viability, proliferation and differentiation of cardiac progenitors from human pluripotent stem cells. Sci. Rep., 2016, vol. 6, art. 30956, pp. 1-14. doi: 10.1038/srep30956.
6. Lin S.C., Gou G.H., Hsia C.W., Ho C.W., Huang K.L., Wu Y.F., Lee S.Y., Chen Y.H. Simulated microgravity disrupts cytoskeleton organization and increases apoptosis of rat neural crest stem cells via upregulating CXCR4 expression and RhoA-ROCK1-p38 MAPK-p53 signaling. Stem Cells Dev., 2016, vol. 25. no. 15, pp. 1172-1193. doi: 10.1089/scd.2016.0040.
7. Wehland M., Aleshcheva G., Schulz H., Saar K., Hübner N., Hemmersbach R., Braun M., Ma X., Frett T., Warnke E., Riwaldt S., Pietsch J., Corydon T.J., Infanger M., Grimm D. Differential gene expression of human chondrocytes cultured under short-term altered gravity conditions during parabolic flight maneuvers. Cell Commun. Signaling, 2015, vol. 13, no. 18, pp. 1-13. doi: 10.1186/s12964-015-0095-9.
8. He L., Pan S., Li Y., Zhang L., Zhang W., Yi H., Song C., Niu Y. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Int. Endod. J., 2016, vol. 49, no. 2, pp. 161-173. doi: 10.1111/iej.12441.
9. Buravkova L.B., Romanov Yu.A., Konstantinova N.A. Buravkov S.V., Gershovich Yu.G., Grivennikov I.A. Cultured stem cells are sensitive to gravity changes. Acta Astronaut., 2008, vol. 63, nos. 5-6, pp. 603-608. doi: 10.1016/j.actaastro.2008.04.012.
10. Gershovich Yu.G., Buravkova L.B. Effects of microgravity simulation on the production of inter-leukins in culture of human mesenchymal stromal cells. Hum. Physiol., 2011, vol. 37, no. 7, pp. 860-865. doi: 10.1134/S0362119711070139.
11. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp. Hematol., 1976, vol. 4, no. 5, pp. 267-274.
12. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, vol. 8, no. 4, pp. 315-317. doi: 10.1080/14653240600855905.
13. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells. J. Orthop. Res., 1991, vol. 9, no. 5, pp. 641-650. doi: 10.1002/jor.1100090504.
14. Richardson S.M., Kalamegam G., Pushparaj P.N., Matta C., Memic A., Khademhosseini A., Mobasheri R., Poletti F.L., Hoyland J.A., Mobasheri A. Mesenchymal stem cells in regenerative medicine: Focus on articular cartilage and intervertebral disc regeneration. Methods, 2016, vol. 99, pp. 69-80. doi: 10.1016/j.ymeth.2015.09.015.
15. Caplan A.I., Dennis J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J. CellBiochem., 2006, vol. 98, no. 5, pp. 1076-1084. doi: 10.1002/jcb.20886.
16. Gershovich P.M., Gershovich Iu.G., Buravkova L.B. Cytoskeleton structures and adhesion properties of human stromal precursors under conditions of simulated microgravity. Tsitologiia, 2009, vol. 51, no. 11, pp. 896-904. (In Russian)
17. Gershovich Yu.G., Buravkova L.B. Morphofunctional status and osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stromal precursor cells during in vitro modeling of microgravity effects. Kletochnye Tekhnol. Biol. Med., 2007, no. 4, pp. 196-202. (In Russian)
18. Dedolph R.R., Dipert M.H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiol., 1971, vol. 47, no. 6, pp. 756-764. doi: 10.1104/pp.47.6.756.
19. Yan M., Wang Y., Yang M., Liu Y., Qu B., Ye Z., Liang W., Sun X., Luo Z. The effects and mechanisms of clinorotation on proliferation and differentiation in bone marrow mesenchymal stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015, vol. 460, no. 2, pp. 327-332. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.03.034.
20. Chen Z., Luo Q., Lin C., Song G. Simulated microgravity inhibits osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells through down regulating the transcriptional co-activator TAZ. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015, vol. 468, nos. 1-2, pp. 21-26. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.11.006.
21. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng., 2001, vol. 7, no. 2, pp. 211-228. doi: 10.1089/107632701300062859.
22. Buravkova L.B., Grinakovskaia O.S., Andreeva E.P., Zhambalova A.P., Kozionova M.P. Characteristics of human lipoaspirate-isolated mesenchymal stromal cells cultivated under a lower oxygen tension. Tsitologiia, 2009, vol. 51, no. 1, pp. 5-11. (In Russian)
23. Corydon T.J., Kopp S., Wehland M., Braun M., Schütte A., Mayer T., Hülsing T., Oltmann H., Schmitz B., Hemmersbach R., Grimm D. Alterations of the cytoskeleton in human cells in space proved by life-cell imaging. Sci. Rep., 2016, vol. 6, art. 20043, pp. 1-14. doi: 10.1038/srep20043.
24. Meyers V.E., Zayzafoon M., Douglas J.T., McDonald J.M. RhoA and cytoskeletal disruption mediate reduced osteoblastogenesis and enhanced adipogenesis of human mesenchymal stem cells in modeled microgravity. J. Bone Miner. Res., 2005, vol. 20, no. 10, pp. 1858-1866. doi: 10.1359/JBMR.050611.
25. Chen Z., Luo Q., Lin C., Kuang D., Song G. Simulated microgravity inhibits osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells via depolymerizing F-actin to impede TAZ nuclear translocation. Sci. Rep., 2016, vol. 6, art. 30322, pp. 1-11. doi: 10.1038/srep30322.
26. Buravkova L.B., Gershovich P.M., Gershovich J.G., Grigor'ev A.I. Mechanisms of gravitational sensitivity of osteogenic precursor cells. Acta Nat., 2010, vol. 2, no. 1, pp. 28-36.
27. Jeon M.J., Kim J.A., Kwon S.H., Kim S.W., Park K.S., Park S.W., Kim S.Y., Shin C.S. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma inhibits the Runx2-mediated transcription of osteocalcin in osteoblasts. J. Biol. Chem., 2003, vol. 278, no. 26, pp. 23270-23277. doi: 10.1074/jbc.M211610200.
28. Denu R.A., Hematti P. Effects of oxidative stress on mesenchymal stem cell biology. Oxid. Med. Cell. Longevity, 2016, vol. 2016, art. 2989076, pp. 1-9. doi: 10.1155/2016/2989076.
29. Atashi F., Modarressi A., Pepper M.S. The role of reactive oxygen species in mesenchymal stem cell adipogenic and osteogenic differentiation: A review. Stem Cells Dev., 2015, vol 24, no. 10, pp. 1150-1163. doi: 10.1089/scd.2014.0484.
30. Tormos K.V., Anso E., Hamanaka R.B., Eisenbart J., Joseph J., Kalyanaraman B., Chandel N.S. Mitochondrial complex III ROS regulate adipocyte differentiation. Cell Metab., 2011, vol. 14, no. 4, pp. 537-544. doi: 10.1016/j.cmet.2011.08.007.
31. Almeida M., Han L., Martin-Millan M., O'Brien C.A., Manolagas S.C. Oxidative stress antagonizes Wnt signaling in osteoblast precursors by diverting beta-catenin from T cell factor- to forkhead box O-mediated transcription. J. Biol. Chem., 2007, vol. 282, no. 37, pp. 27298-27305. doi: 10.1074/jbc .M702811200.
32. Iyer S., Ambrogini E., Bartell S.M., Han L., Roberson P.K., de Cabo R., Jilka R.L., Weinstein R.S., O'Brien C.A., Manolagas S.C., Almeida M. FOXOs attenuate bone formation by suppressing Wnt signaling. J. Clin. Invest., 2013, vol. 123, no. 8, pp. 3409-3419. doi: 10.1172/JCI68049.
33. Kim W.K., Meliton V., Bourquard N., Hahn T.J., Parhami F. Hedgehog signaling and osteogenic differentiation in multipotent bone marrow stromal cells are inhibited by oxidative stress. J. Cell. Biochem., 2010, vol. 111, no. 5, pp. 1199-1209. doi: 10.1002/jcb.22846.
Для цитирования: Ратушный А.Ю., Григорьева О.В., Буравкова Л.Б. Снижение остео-генного потенциала мультипотентных мезенхимальных клеток в условиях длительного моделирования микрогравитации // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2017. -Т. 159, кн. 2. - С. 206-216.
For citation: Ratushnyy A.Y., Grigorieva O.V., Buravkova L.B. Osteogenic potential reduction in mesenchymal stem cells under prolonged simulated microgravity. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2017, vol. 159, no. 2, pp. 206-216. (In Russian)
