CC BY
34
А.А. Иванов1, А.С. Симбирцев2, В.Н. Мальцев1, Л.Н. Петров2, И.Е. Андрианова1, Н.М. Ставракова1, А.М. Уланова1, Г.А. Шальнова1
Снижение опасности носительства условно-патогенной микрофлоры при радиационном поражении с помощью пробиотика витафлор и антибиотиков
1 ФГБУ Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицин-
ский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, г. Москва
2 ФГУП Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов
ФМБА России, г. Санкт-Петербург
А.А. Ivanov1, A.S. Simbircev2, V.N. Maltsev1, L.N. Petrov2, I.E. Andrianova1, N.M. Stavrakova1, А.М. Ulanova1, й.А. Shal'nova1
Lowering risck of being a carrier of opportunistic infections in case of radiation damage by using probiotic vitaflor and antibiotics
1 FGBU «State Research Centre of Russian Federation — Burnasyan Federal Medical Biophysical
Centre» of the FMBA of Russia, Moscow 2 FGUE «State Research Institute of highly pure biopreparations» of the FMBA of Russia,
Saint-Petersburg
Ключевые слова: острая лучевая болезнь, антибио- Keywords: acute radiation disease, antibiotics, Vitaflor,
тики, Витафлор, смертность, продолжительность mortality, life expectancy, microbiotic flora, Proteus
жизни, микрофлора,протейная инфекция. infection.
Цель: оценка эффективности действия пробиотика Витафлор и антибиотиков (гентамицина, нистатина) на течение острой лучевой болезни у здоровых мышей и носителей протейной инфекции. Материалы и методы: в экспериментах использовали мышей-самцов Б1 (СВА*С57В1), клинически здоровых и с протейной инфекцией. Животных подвергали одностороннему воздействию у-лучей на установке РОКУС в дозах 6,5 Гр (ЛД 0) и 10,0 Гр (ЛД 8) при мощности дозы 1,0 Гр/мин или равномерному воздействию на установке ИГУР в дозах 8,5 Гр (ЛД 0) и 12,0 Гр (ЛД 8) при мощности дозы 0,4 Гр/мин, вызывающему костномозговую или кишечную форму острой лучевой болезни (ОЛБ).
Антибиотики гентамицин и нистатин применяли в виде растворов в охлажденной кипяченой водопроводной воде. Витафлор вводили вну-трижелудочно.
Результаты: изолированное применение антибиотиков оказало благоприятное действие на течение ОЛБ у исходно клинически здоровых животных, но было неэффективно у носителей протейной инфекции. Сочетанное назначение Витафлора (до облучени ) и антибиотиков (после облучения) позволило получить положительный результат при лечении костномозговой и кишечной форм ОЛБ у мышей с протейной инфекцией. Применение гентамицина и нистатина сопровождалось увеличением энтерококков в кале, что является проявлением постантибиотикового дисбактериоза.
Выводы: пробиотик Витафлор можно рассматривать в качестве дополнительного средства для профилактики и лечения ОЛБ у людей, занятых на предприятиях атомной промышленности и энергетики.
We studied the efficacy of antibiotics (gentamycin, nistatin), probiotic Vitaflor and their combination on bone marrow and intestinal forms of acute radiation disease. Material and methods: 150 mice male F1(CBA*C57Bl) weighing 18-23 g Proteus infection carriers were irradiated on ROCUS unit by y-rays in doses 6,5 Gy (LD 80/30), 10,0 Gy (LD ) (dose rate 1 Gy/min),100 healthy mice were irradiated on IGUR unit 137Cs sourse in doses 8,5 Gy (LD3S/30) and 12,0 Gy (LD ) ( dose rate 0,4 Gy/min). Results: In experiment: antibiotics decreased mortality in healthy mice, increased survival time and decreased amount of Esch. coli in excrements after irradiation versus irradiated control. In mice carriers of Proteus infection, the positive effect after irradiation was achieved only when antibiotics were administered in combination with Vitaflor.
Conclusion: probiotic Vitaflor may be used as an additional remedy for prevention and treatment in case of radiation disease among personnel of nuclear industry and power engineering.
76 A.A. Иванов, A.C. Симбирцев, В.Н. Мальцев, Л.Н. Петров,
И.Е. Андрианова, Н.М. Ставракова, A.M. Уланова, F.A. Шальнова
Введение
Микрофлора тела человека на фоне развивающегося пострадиационного иммунодефицита имеет большое значение в патогенезе острой лучевой болезни (ОЛБ) [6; 13]. Носительство бактерий, относящихся к группе условно-патогенных, таких как протей, является распространенным у человека и животныгх. При нарушении иммунного статуса это может привести к развитию дисбактериоза и эндогенной инфекции. Для профилактики и лечения возникающих осложнений применяют антибиотики и бактериальные препараты.
В литературе имеются сообщения о способности пробиотиков ( лактобацилл и бифи-добактерий) оказывать лечебный эффект у облученных животных при энтеральном введении [5; 7; 8]. Результаты экспериментальных исследований нашли практическое применение. Препарат Биобактон сухой, в состав которого входят лактобактерии, рекомендован для лечения и профилактики дисбакте-риозов и кишечныгх инфекций у работников радиационно-опасных производств [11]. В последние годы в ГосНИИ ОЧБ ФМБА России разработан препарат Витафлор, содержащий живые лактобациллы [12].
Цель исследования — в экспериментальных условиях испытать эффективность применения препарата Витафлор совместно с антибиотиками для профилактики и лечения ОЛБ на фоне спонтанной протейной инфекции у мышей.
Материалы и методы
В опытах использовано 250 мышей гибридов П (СВА*С57В1), самцов массой тела 18—23 г. Животные быши получены в разное время двумя партиями — 100 голов здо-ровыгх животныгх и 150 голов с протейной инфекцией — с интервалом в несколько месяцев. Исследования выполняли с учетом Приложения Е «Правил проведения опытов с использованием экспериментальных животныгх» (утв. приказом МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755). Условия содержания подопыггных и контрольные мышей быши одинаковыми.
Первую группу практически здоровых мышей (100 голов) подвергали тотальному равномерному воздействию у-лучей в дозах 8,5 Гр (ЛД35/30) и 12,0 Гр (ЛД100/8)
на аппарате ИГУР при мощности дозы 0,4 Гр/ мин. Затем назначали антибиотики с 1-х по 21-е сутки после облучения или до гибели. Антибиотики [9]: гентами-цин и нистатин во всех опытах применяли в виде растворов в охлажденной кипяченой водопроводной воде. Каждая мышь выпивала в сутки по 2—3 мл смеси, что соответствовало 15 000—22 500 ЕД нистатина, 3,2—4,8 мг гентамицина. Контрольные животные получали охлажденную кипяченую водопроводную воду без антибиотиков.
Животныгх с протейной инфекцией (вторая группа) подвергали тотальному одностороннему воздействию у-лучей на установке РОКУС в дозах, вызывающих костномозговую — 6,5 Гр (ЛД35/30) или кишечную формы ОЛБ — 10,0 Гр (ЛД100/8) при мощности дозы 1,0 Гр/мин. Для лечения применяли препарат Витафлор и антибиотики.
Витафлор — отечественный пробиотик, выпускаемый в виде лиофилизата, содержит живые Lactobacillus acidophilus штамм Д № 75 и Д № 76 (100 млн микробных клеток/мл). Содержимое флакона (230 мг) разводили в 25 мл охлажденной кипяченой водопроводной воды и вводили мышам внутри-желудочно в объеме 0,2 мл (20 млн микроб-ныгх клеток) 1 раз в сутки.
При дозе излучения 6,5 Гр мыши получали Витафлор внутрижелудочно за 1 сут до воздействия и далее ежедневно до 6-х суток ОЛБ, антибиотики — с 6-х по 21-е сутки ОЛБ вместе с питьевой водой.
При дозе излучения 10,0 Гр Витафлор назначали внутрижелудочно за 1 сут до воздействия, антибиотики — с 1-х суток после облучения и затем ежедневно до гибели.
Мыши из группы биологического контроля получали для питья в свободном режиме охлажденную кипяченую водопроводную воду и дополнительно по 0,2 мл воды внутри-желудочно в сроки применения Витафлора у леченыгх мышей.
Микрофлору кала изучали по общепринятой методике [3] на 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после воздействия излучения в дозе 6,5 Гр и на 2-е, 5-е и 7-е сутки при дозе 10,0 Гр, на 10-е и 14-е сутки при дозе 8,5 Гр и на 3-и сутки при дозе 12,0 Гр. Суммарную пробу кала от 5 мышей каждой группы взве-
шивали и разводили в стерильном физиологическом растворе при десятичном шаге разведения от 10-4 до 10-9. Затем 0,01 мл каждого разведения засевали на чашки Петри с твердой средой Эндо. После 24—48 часов инкубации посевов в термостате при 37С подсчитывали число колониеобразующих единиц микробов (КОЕм). Идентификацию выщеленных микробов проводили по биохимической активности и морфологии после окраски по Граму [3].
Микрофлору мочи и слюны мышей изучали по оригинальной методике с помощью стерильных бумажных дисков диаметром 10 мм. Диски фиксировали стерильным пинцетом, промокали 2-й каплей выделяемой мочи или слюной, помещали на поверхность твердой питательной среды Эндо в чашках Петри. После 24 часов инкубации посевов в термостате при 37С подсчитывали число проросших дисков и идентифицировали выделенные микробы.
Массу тела мышей определяли во всех группах на весах с ценой деления 1 г.
Полученные результаты обрабатывали по стандартным методам вариационной статистики [9] с использованием компьютерной программы Биостат.
Результаты
Животные были получены несколькими партиями. В одной партии (150 мышей) имела место гибель 50% животныгх (из группы биологического контроля) в течение 30 дней, что заставило предположить наличие у них латентной инфекции. Следует отметить, что в группу биоконтроля были отобраны наиболее слабые животные. При бактериологическом
исследовании у этих мышей был выделен протей: в слюне — в 53% случаев, в моче — в 60% случаев, в кале — в 30% случаев при использовании высокого разведения 10-6. При взвешивании мышей в процессе наблюдения было установлено, что они практически не прибавляют в весе. Эти данные делают обоснованным предположение о наличии у мышей хронической протейной инфекции.
Во второй партии животных в группе биоконтроля гибель не отмечена, протей из мочи и кала не выделялся (табл. 1).
Мыши — носители протея были использованы в качестве модели спонтанного инфекционного процесса для изучения эффективности применения антибактериальных средств в условиях облученного организма.
В первой серии экспериментов, выполненных на клинически здоровых животных, показано, что применение антибиотиков повышало выживаемость мышей с 65% в контроле до 85% (8,5 Гр) (табл. 2).
Содержание кишечных палочек до облучения — ^ КОЕм/г кала = 6,7. На 10-е сутки после облучения в дозе 8,5 Гр число микробов возрастало до ^ КОЕм/г = 7,4 в группе контроль облучения, а на фоне применения антибиотиков практически сохранялось на исходном уровне. Количество энтерококков у всех животных, получавших антибиотики, возрастало до >9,0 при исходном уровне ^ КОЕм/г = 6,0.
При дозе облучения 12,0 Гр, вызывающей кишечную форму ОЛБ, применение антибиотиков увеличивало продолжительность жизни с 5,9±0,2 до 6,9±0,5 сут (табл. 3). Разница показателей между группами ста-
Таблица 1 Характеристика мышей Fj (CBA*C57Bl) — группа биоконтроля
Показатели Группы мышей
Клинически здоровые С протейной инфекцией
Число мышей 20 20
Исходная масса тела, М±т, г 19,2±0,5 20,0±0,5
Гибель за 30 сут в группе биоконтроля, % 0 50
Микрофлора Кишечная палочка, ^ КОЕм/г, Ме 7,4 6,7
кала Энтерококк, ^ КОЕм/г, Ме 4 6
Протей, % + проб 0 30
Микрофлора Кишечная палочка, КОЕм/диск, Ме 0 10
мочи Протей, % + проб 0 60
Микрофлора Кишечная палочка, КОЕм/диск, Ме 4 12
слюны Протей, % + проб 0 53
A.A. Иванов, A.C. Симбирцев, В.Н. Мальцев, Л.Н. Петров, И.Е. Андрианова, Н.М. Ставракова, A.M. Уланова, Г.А. Шальнова
Влияние предварительного введения пробиотика Витафлор и антибиотиков на исход костномозговой формы ОЛБ у мышей Р1 (СВА*С57В1) Таблица 2
Группа мышей Аппарат Доза излучения, Гр Антибиотики Витафлор Число мышей Из них выжило
Абс. ч. %
Клинически здоровые ИГУР 8,5 + - 20 17 85
- - 20 13 65
С протейной нфекцией РОКУС 6,5 + + 20* 9 45
+ - 20 0 0
- - 20 4 20
Примечание: * — статистически значимая разница по сравнению с группой мышей, получавших одни антибиотики, х2 = 9,2; р < 0,001.
тистически значима, критерий Стьюдента, /=2,3; р=0,03. Содержание кишечных палочек на 3-и сутки после облучения составило КОЕм/г кала = 6,5 в группе контроль облучения и мало изменялось при назначении антибиотиков.
Во второй серии опытов у животных со спонтанной протейной инфекцией выживаемость после воздействия излучения в дозе 6,5 Гр в группе контроль облучения составила 20% (см. табл. 2). Все облученные животные, получавшие антибиотики, погибли. Сочетанное применение Витафлора и антибиотиков повышало выживаемость до 45%. Разница между выживаемостью в группах, получавших одни антибиотики и Витафлор в сочетании с антибиотиками, статистически значима, х2=12,6; р<0,001.
Микрофлора кала до облучения в дозе 6,5 Гр была представлена в основном кишечными палочками, ^ КОЕм/г кала=6,2±0,1. После облучения их число в среднем за период наблюдения (1—21-е сутки ОЛБ) возрастало до КОЕм/г кала=6,8±0,05. При назначении антибиотиков изолированно или в сочетании с Витафлором содержание кишечных палочек на 14-е сутки ОЛБ опускалось ниже разрешающей способности методики < 4,0. Применение
антибиотиков не предотвращало появления энтерококков, которые отсутствовали до облучения, и даже способствовало увеличению их количества в кале мышей: на фоне антибиотиков их число возрастало до КОЕм/г кала > 9,0. В моче мышей этой группы протей обнаружен на 69% дисков. После сочетанного применения антибиотиков и Витафлора высеваемость протея снижалась до 14%.
В опытах по изучению влияния комплекса препаратов на кишечную форму ОЛБ, вызванную воздействием у-излучения в дозе 10,0 Гр (см. табл. 3), было установлено, что в контрольной группе продолжительность жизни составила 5,3±0,3 сут. При применении антибиотиков она сократилась до 4,5±0,3 сут, при сочетанном назначении Витафлора и антибиотиков возросла до 6,6±0,3 сут. Разница между группами животных, получавших одни антибиотики или антибиотики совместно с Витафлором, статистически значима, критерий Стьюдента, /=4,9, р<0,001.
Микрофлора кала до воздействия излучения в дозе 10 Гр в основном была представлена кишечными палочками (7,6) и энтерококками (7,3), КОЕм/г кала. После облучения, судя по средним данным (медиана),
Влияние предварительного введения пробиотика Витафлор и антибиотиков на течение кишечной формы ОЛБ у мышей Таблица 3
Группа мышей Аппарат Доза излучения, Гр Антибиотики Витафлор Число мышей Продолжительность жизни, М±т, сут
Клинически здоровые ИГУР 12 + - 19 6,9±0,4*
- - 21 5,9±0,2
С протейной инфекцией РОКУС 10 + + 22 6,6±0,3
+ - 20 4,5±0,3**
- + 20 5,2±0,3
- - 20 5,3±0,3
Примечани : * - статистически значимая разница по сравнению с группой мышей, не получавших антибиотики, по критерию Стьюдента, /=2,3; р=0,03; ** - статистически значимая разница по сравнению с группой мышей, получавших Витафлор и антибиотики, критерий Стьюдента, /=4,9; р<0,001.
за период наблюдения (2—7-е сутки) содержание в кале кишечных палочек увеличивалось, ^ КОЕм/г = 8,3. Изолированное применение антибиотиков или Витафлора по тесту микрофлоры кала было малоэффективно, содержание кишечных палочек в этих группах — ^ КОЕм/г = 7,0 или 7,9. Комплексное применение Витафлора и антибиотиков приводило к снижению количества кишечных палочек (^ КОЕм/г кала) с 7,6 до < 4. Содержание энтерококков было повышено во всех группах мышей, получавших антибиотики.
Применение Витафлора и антибиотиков снижало содержание в моче кишечных палочек с 15 КОЕм/диск (контроль облучения) до 5, протея — со 100 до 50% положительных посевов.
Обсуждение
В ходе опытов на клинически здоровых животных установлено: назначение антибиотиков с 1-х суток ОЛБ повышает выживаемость животных, увеличивает продолжительность их жизни и препятствует постлучевому увеличению кишечных палочек в кале, что соответствует литературным данным [5; 7; 8]. Отсутствие эффекта от изолированного применения антибиотиков у мышей — носителей протейной инфекции можно объяснить возможным наличием у них антибиотикорезистентной микрофлоры. На этом фоне антибиотики, вероятно, в силу своей токсичности при отсутствии антибактериального действия отягощают течение лучевого поражения. Антибиотики проявляли свое положительное влияние только в сочетании с Витафлором, подавлявшим условно-патогенную микрофлору, в том числе анти-биотикорезистентную [12].
По нашим данным [2], полученным на интактных животных, Витафлор нивелирует отдельные проявления побочного действия антибиотиков на гемопоэз, чем также можно объяснить его благоприятный эффект при радиационном поражении на фоне дисбиоза, вызванного условно-патогенной микрофлорой.
Механизм лечебного действия про-биотиков при заболеваниях желудочно-кишечного тракта связан с нормализацией микрофлоры кишечника за счет антагонистического действия лактобацилл на кишечную
палочку, стафилококки, сальмонеллы, ши-геллы, протей, дрожжеподобные грибки [1], а также их иммуномодулирующего действия [15; 16]. Пробиотики стимулируют деятельность дендритных клеток, фагоцитов (ней-трофилов, моноцитов), Т- и В-лимфоцитов, активируют синтез иммуноглобулинов и образование провоспалительных цитокинов клетками пейеровых бляшек [4; 14].
Пробиотик Витафлор содержит живые лактобациллы, устойчивые ко многим антибиотикам: гентамицину, оксациллину, кана-мицину, амикацину, мономицину, тетрациклину и др. Эти лактобациллы резистентны к действию желудочного сока, обладают высокой адгезивной и антагонистической активностью [12]. Полученные данные подтверждают возможность применения пробиотиков для профилактики кишечных инфекций и повышения эффективности антибиотикоте-рапии в случае воздействия ионизирующего излучения у работников атомной промышленности. С этой целью наряду с препаратом Биобактон сухой [11] может быть использован препарат Витафлор.
Заключение
После воздействия у-излучения на аппарате ИГУР в дозе 8,5 Гр применение антибиотиков у клинически здоровых мышей подавляло постлучевое увеличение кишечных палочек в кале, повышало выживаемость и увеличивало продолжительность жизни облученных животных. При дозе 12,0 Гр отмечено только увеличение продолжительности жизни.
Иные результаты были получены после воздействия на мышей с протейной инфекцией у-излучения на аппарате РОКУС в дозах 6,5 Гр или 10,0 Гр. В этих опытах только совместное применение Витафлора до и после облучения в сочетании с антибиотиками после облучения снижало смертность животных и увеличивало продолжительность их жизни за счет подавления протейной инфекции и нормализации содержания кишечных палочек в кале и моче. Использование одних антибиотиков для лечения ОЛБ в этих опытах было неэффективно. Их применение способствовало увеличению в кале энтерококков у всех мышей.
A.A. Иванов, A.C. Симбирцев, В.Н. Мальцев, Л.Н. Петров, И.Е. Aндрuанова, Н.М. Ставракова, A.M. Уланова, r.A. Шальнова
Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что препарат Витафлор, учитывая его антиинфекционную эффективность, можно рассматривать в качестве дополнительного средства для профилактики и лечения кишечных инфекций, а также повышения эффективности антибиотикотерапии в случае ОЛБ у лиц, занятых на предприятиях атомной промышленности, и профессионалов, контактирующих с ионизирующим излучением.
Литература
1. Андреева И.В. Доказательства обоснованности профилактического применения пробиотиков //Фарматека. 2006. № 6 (121). С. 56-62.
2. Андрианова И.Е., Мальцев В.Н., Уланова А.М. и др. Гематологический статус мышей, получавших пре-, про-, сим- и антибиотики // Медицина экстремальных ситуаций. 2012. № 3 (41). С. 109-116.
3. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина, 1982. С. 142-153.
4. Зорина В. В., Николаева Т.Н., Наровлинский А.Н. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитоки-нов клетками пейеровых бляшек экспериментальных животных / / Иммунология. 2004. № 5. С. 288-290.
5. Иванов А.А., Ханыков А.В., Насонова Т.А. и др. Микрофлора кишечника у облученных мышей при энтераль-ном введении малоадсорбируемых антибиотиков // Радиобиология. 1982. Т. 22. № 2. С. 280-283.
6. Иванов А.А., Шальнова Г. А., Уланова А.М. и др. Инфекционные осложнения у больных острой лучевой болезнью, пострадавших в результате аварии на ЧАЭС // Медицина труда и промышленная экология. 2005. № 3. С. 1-7.
7. Коршунов В.М., Пинегин Б.В., Иванова Н.П. Влияние сочетанного применения антибиотикоустойчивых бифидо-бактерий и соответствующих антибиотиков на выживаемость облученных мышей // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1982. № 5. С. 50-53.
8. Коршунов В.М., Пинегин Б. В., Мальцев В.Н. и др. Изучение влияния бифидобактерий и лактобацилл на восстановление микрофлоры кишечного тракта облученных мышей // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1980. № 7. С. 25-29.
9. Лакин Т.Ф. Биометрия. М.: Наука, 1964.
10. Машковский. М.Д. Лекарственные средства. Ч. 2. М.: Медицина, 1984. С. 242, 266.
11. Методические рекомендации «Медицинские аспекты применения биологической добавки Биобактон и медицинского иммунобиологического препарата Биобактон сухой у работников радиационно-опасных производств». ФУ МЗ РФ «Медбиоэкстрем». Государственный научный центр -Институт биофизики. М., 2001.
12. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Добрица В.П. и др. Бактериальные про-биотики, биотехнология, клиника, алгоритм выбора. СПб.: Бастион, 2008.
13. Радиационная медицина / Под ред. Л.А. Ильина. Т. 2. М., 2001. С. 137.
14. Хорошилова Н.В. Иммуномодулирующее и лечебное действие пробиотиков // Иммунология. 2003. № 6. С. 352-356.
15. Bin-Nun A., Bromicer R., Wilschanski et all. Oral probiotics prevent necrotizing enterocolitis in very lowbrith weight neonates // The Journal of Pediatrics. 2005. Vol. 147. № 2. P. 192-196.
16. de Vreze M., Wincler P., Rautenberg P. et all. Effect of lactobacillus PA 16/8, bifidumbacterium longum SP 07/3 D/ bifidum MF 20/5 on common cold episodes: a double blind, randomized, controller trail // Clinical Nutrition. 2005. Vol. 24. № 4. P. 481-491.
Контакты:
Иванов Александр Александрович зав. лабораторией радиационной иммунологии и экспериментальной терапии ГНЦ РФ — ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, доктор медицинских наук, профессор. Тел.: 8 (499)-190-96-35; факс: 8 (499) 193-11-11; e-mail: а1931192@ mail.ru
