CC BY
17
DOI: 10.18454/IRJ.2016.47.201 Терешкина Е.Б.1, Савушкина О.К.2, Прохорова Т.А.3, Воробьева Е.А.4, Бокша И.С.5, Бурбаева Г.Ш.6
1Кандидат биологических наук, 2ORCID:0000-0002-8629-0445, кандидат биологических наук, 3научный сотрудник, 4 кандидат биологических наук, 5ORCID: 0000-0003-1369-8658, доктор биологических наук, 6 доктор биологических наук, профессор, ФГБНУ «Научный центр психического здоровья» СНИЖЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ИЗОФОРМЫ В КРЕАТИНФОСФОКИНАЗЫ В МОЗЖЕЧКЕ
ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
Аннотация
Цель исследования - сравнение количества мозговой изоформы креатинфосфокиназы (КФК B) в мозжечке у больных болезнью Альцгеймера (БА) и в контрольной группе.
Определен уровень иммунореактивной КФК В у больных БА (n=13) и в контрольной группе (n=13) в аутопсийных образцах коры мозжечка. Образцы были подобраны по возрасту, полу и постмортальному интервалу. Количество иммунореактивной КФК В определено методом ECL-иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител. Достоверное снижение количества иммунореактивной КФК В наблюдалось во фракции водорастворимых белков мозжечка больных БА по сравнению с контролем (p< 0,01). Различий между группами в уровнях иммунореактивной КФК В во фракции мембранных белков мозжечка не выявлено.
Заключение. Значительное снижение количества центрального фермента энергетического метаболизма мозга КФК ВВ свидетельствует о существенном нарушении энергетического обмена в мозжечке при БА и является одним из аспектов нейродегенеративного процесса при БА.
Ключевые слова: креатинфосфокиназа ВВ, моноклональные антитела, ECL-иммуноблоттинг, мозжечок, болезнь Альцгеймера.
Tereshkina E.B.1, Savushkina O.K.2, Prokhorova T.A.3, Vorobyeva Е.А.4, Boksha, I.S.5, Burbaeva G.Sh.6
1PhD in Biology, 2ORCID:0000-0002-8629-0445, PhD in Biology, 3Research Scientist, 4PhD in Biology, 5ORCID: 0000-0003-1369-8658, PhD in Biology, Doctor of Natural Sciences, 6PhD in Biology, Doctor of Natural Sciences, Professor, Federal State Budgetary Scientific Institution «Mental Health Research Centre» DECREASED LEVEL OF CREATINE PHOSPHOKINASE B ISOFORM IN CEREBELLUM
IN ALZHEIMER'S DISEASE
Abstract
Aim - to compare levels of brain isoform creatine phosphokinase (CPK B) in cerebellum from patients with Alzheimer's disease (AD) and control subjects.
Levels of immunoreactive CPK B were dtermined in autopsied samples of cerebellum cortex from patients with AD (n=13) and controls (n=13). The samples were matched by age, gender and postmortem interval. Amounts of immunoreactive CPK B were determined by ECL-immunoblotting with monoclonal antibodies. Significant decrease in amounts of immunoreactive CPK B was observed in water soluble protein fraction of cerebellum from AD patients in comparison with controls (p<0.01). No differences were revealed between the groups in immunoreactive CPK B levels in membrane protein fraction.
Conclusion. Significant decrease in amount of CPK BB, the central energy metabolism enzyme, suggests a substantial impairment of energy metabolism in cerebellum in AD and represents an aspect of neurodegenerative process in AD.
Keywords: creatine phosphokinase BB, monoclonal antibodies, ECL-Western blotting, human cerebellum, Alzheimer's disease.
Введение. Процессы, лежащие в основе когнитивного функционирования, протекают со значительными затратами энергии, связанными с превращениями макроэргических соединений. Ведущий симптом болезни Альцгеймера (БА) - резкое снижение когнитивных функций вплоть до деменции. Неудивительно, что в протеомных исследованиях аутопсийного мозга больных БА обнаружены изменения уровней экспрессии генов и количества ферментов, вовлеченных в энергетический метаболизм мозга [1], в том числе, креатинфосфокиназы (КФК). КФК -фермент, играющий ключевую роль в энергетическом метаболизме и регулирующий уровень АТФ. КФК катализирует обратимую реакцию фосфорилирования/дефосфорилирования креатина (Кр), сопряженную с превращениями АТФ/АДФ. Для КФК характерна тканеспецифичность и компарментализованность. Особенно высоки концентрации КФК в тканях с большими потребностями в энергии и существенными перепадами в интенсивности ее потребления -в мозге, сердце, мышцах. В мозге человека функционируют две формы КФК: цитоплазматическая (КФК ВВ), обеспечивающая транспортировку макроэргических связей фосфатных групп (в креатинфосфате, КрФ) к местам ее потребления (например, к АТФ-зависимым переносчикам нейромедиаторов) и конверсию КрФ в АТФ, и митохондриальная Мт1, использующая макроэргическую связь АТФ, синтезируемого при окислительном фосфорилировании в митохондриях, для превращения Кр в КрФ и переноса последнего в цитоплазму. Цитоплазматическая форма КФК ВВ обнаружена в большом количестве в астроцитах и олигодендроцитах и в меньшей степени в нейронах, а митохондриальная КФК присутствует в митохондриях всех типов клеток, но самый высокий ее уровень - в нейронах.
Ранее в наших работах при сравнительном исследовании аутопсийного мозга больных БА и контрольной группы было обнаружено снижение как ферментативной активности КФК, так и количества белка КФК ВВ в лобной коре и гиппокампе больных БА [2], а в настоящей работе исследован аутопсийный материал коры мозжечка больных БА и лиц контрольной группы.
Мозжечок - это структура мозга, подвергшаяся существенным эволюционным изменениям у человека по сравнению с другими приматами, при этом эволюция этой структуры сопровождалась приобретением ею значительно большего числа функций, чем предполагалось ранее. Это контроль внимания, эмоции, настроение, познавательные
функции, социальное поведение. В связи с этими данными и свидетельствами того, что мозжечок имеет анатомические и функциональные связи с лобной корой, подкорковыми лимбическими структурами и ядрами ствола мозга, он представляет интерес при изучении БА. Участие мозжечка в когнитивном функционировании подробно освещено в обзоре [3]. B последнее время мозжечку все чаще уделяется внимание в нейрохимических исследованиях БА, при этом в мозжечке при БА обнаружено существенное изменение уровня ферментов метаболизма глутамата и ГАМК [4].
Цель настоящего исследования - сравнение уровня мозговой изоформы В КФК в мозжечке больных БА и в контрольной группе. С этой целью определялось количество иммунореативной КФК В в экстрактах коры мозжечка. В отличие от предыдущих исследований, при оценке уровня иммунореактивной изоформы КФК В использовались моноклональные антитела к КФК В, специфичные именно к этой изоформе и не дающие перекрестной реакции с Мт1 КФК. Использование иммуноблоттинга с хемилюминесцентным усилением сигнала (ECL-иммуноблоттинга) позволило провести полуколичественную сравнительную оценку данных об уровнях иммунореактивной изоформы КФК В.
Материалы и методы. Исследование проведено на образцах мозжечка из коллекции аутопсийного мозга, собранной и хранящейся при -80°С в лаборатории нейрохимии НЦПЗ РАМН. В качестве контроля использовались образцы аутопсийного мозга лиц без истории психических и неврологических расстройств из московских больниц (патологоанатомических отделений). Образцы мозга больных были получены из московских психиатрических клинических больниц №1 и №3; клинический диагноз «болезнь Альцгеймера» был подтвержден исследованиями срезов мозга, проведенными в лаборатории клинической нейроморфологии ФГБНУ НЦПЗ: обнаружены многочисленные отложения бета-амилоидного пептида, нейрофибриллярные бляшки и типичная атрофия мозга. Для исследования было отобрано 13 случаев БА и 13 контрольных образцов. Группа контроля и группа случаев БА достоверно не различались по постмортальному интервалу (ПМИ, 4-6 ч) и возрасту (в контрольной группе - 52-81 год, медиана 70 лет, в группе БА - 57-83 года, медиана 72 года). Обе группы были уравнены по числу представителей обоих полов (по 8 женщин и 5 мужчин в каждой), при этом отдельно рассматриваемые подгруппы мужчин и женщин из группы больных БА и контрольной также были уравнены по возрасту и ПМИ. Образцы мозжечка обеих групп хранились в течение сопоставимого времени перед исследованием.
Образцы ткани мозжечка (50 мг) гомогенизировали в гомогенизаторе Potter (стекло/тефлон) в 1мл 50мM TRIS-HCl буфера, pH 7,0, с добавлением 0,35 М сахарозы и коктейля ингибиторов протеаз Sigma P8340-5ml, с последующим центрифугированием при 1000 g и удалением осадка, содержащего ядерные фрагменты и осколки неразрушенных клеток, для дальнейшего анализа использовали полученные супернатант и осадок. Супернатант центрифугировали при 60000 g, 1 ч, 4 С. к полученному супернатанту (фракция водорастворимых белков) перед электрофорезом добавляли 10%-ный раствор додецилсульфата натрия (SDS, 10% объема) и ß-меркаптоэтанол (10% объема). Осадок (фракция белков, ассоциированных с мембранами) ресуспендировали в 100 мкл 50мM TRIS-HCl буфера, pH 7,0, с добавлением 4% SDS, и непосредственно перед электрофорезом добавляли ß-меркаптоэтанол (10% объема). Образцы нагревали на кипящей водяной бане 5 мин и проводили 1 -мерный электрофорез в ПААГ по Лэммли и последующий ECL-Вестерн-иммуноблоттинг.
Количество иммунореактивной КФК В определяли, используя внутренний стандарт (образец контрольного мозга) [5], с помощью конъюгированных с пероксидазой моноклональных мышиных антител в разведении 1:100000, антитела были получены совместно с сотрудниками лаборатории клинической иммунологии ФГБНУ НЦПЗ. Эти моноклональные антитела специфичны к КФК В и не дают перекрестной реакции с митохондриальной КФК.
Количество иммунореактивной КФК В оценивалось в относительных единицах (отн. ед.) после ECL-Вестерн-иммуноблоттинга, сканирования фотопленок и количественной обработки полученных изображений на установке ^DAK Image Station IS2000R.
Концентрация белка определялась спектрофотометрическим методом Лоури с использованием набора реагентов Bio-Rad DC Protein Assay (США), в соответствии с протоколом и с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве белкового стандарта для калибровки.
Все определения в каждом образце проводились трехкратно.
Для статистической обработки данных использовалась программа Statistica 6.0 (Statsoft), модуль -непараметрический анализ (поиск статистически значимых различий между группами - тест Манна-Уитни, корреляционный анализ - поиск ранговых корреляций и определение коэффициента корреляции Спирмена).
Результаты и обсуждение. На рисунке 1 приведен пример окрашивания ECL-иммуноблоттингом иммунореактивной КФК В во фракции водорастворимых белков мозжечка. Как видно из рисунка, интенсивность окрашивания зоны, соответствующей КФК В, во фракции водорастворимых белков в контрольных случаях значительно выше (нечетные дорожки), чем у больных БА (четные дорожки) (p<0,01).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Рис. 1 - Картина окраски иммунореактивной КФК В (фракции водорастворимых белков мозжечка) у лиц контрольной группы — нечетные дорожки и больных БА — четные дорожки
Одной из причин снижения уровня изоформы В КФК во фракции водорастворимых белков мозга больных БА может быть перераспределение этого фермента между субклеточными фракциями. Однако анализ уровня иммунореактивной КФК В во фракции мембранных белков не показал различий между контрольными случаями и образцами от больных БА.
На диаграмме (рис. 2) представлены результаты определения количества иммунореактивной КФК В (в отн. ед.) в образцах мозжечка больных БА и контрольной группы.
Как показал U-тест Манна-Уитни, в водорастворимой белковой фракции мозжечка количество иммунореактивной КФК В было значительно снижено у больных БА по сравнению с контрольной группой (р = 0,006) (Рис. 2), а в мембранной белковой фракции мозжечка количество иммунореактивной КФК В у больных БА и в контрольной группе достоверно не различалось (р = 0,280) (Рис. 2).
Рис. 2 - Количество иммунореактивной КФК В в образцах мозжечка контрольной группы (синие символы) и
группы больных БА (красные символы), оцененное ECL-Вестерн-иммуноблоттингом: треугольники - фракция водорастворимых белков, кружки - фракция мембранных белков
Таким образом, обнаружено значительное снижение уровня иммунореактивной КФК В во фракции водорастворимых белков мозжечка больных БА по сравнению с контролем, что могло быть обусловлено рядом причин. Одной из этих причин мог быть аутолиз. Однако, проведенные нами эксперименты показали незначительное влияние ПМИ на активность КФК в первые 18-20 ч после смерти. Тем не менее, чтобы исключить возможные артефакты, возникающие вследствие аутолиза, группа больных и контрольная группы были уравнены по ПМИ. Различия между группами в количестве иммунореактивной КФК В, вероятно, обусловлены именно патологией (БА), поскольку группы (БА и контрольная) были уравнены по возрасту, ПМИ и количеству представителей обоих полов.
Кроме того, было показано, что количество КФК В в образцах от мужчин (п=16) и женщин (п=10) не различалось (О-тест Манна Уитни показал р=0,66 и р=0,18 для водорастворимой и ассоциированной с мембранами белковых фракций, соответственно).
Заключение. Значительное снижение количества центрального фермента энергетического метаболизма мозга КФК ВВ свидетельствует о существенном нарушении энергетического обмена в мозжечке при БА, что, по-видимому, вносит вклад в нейродегенеративный процесс при БА.
Литература
1. Zahid S., Oellerich M., Asif A.R., Ahmed N. Differential expression of proteins in brain regions
of Alzheimer's disease patients. // Neurochem Res.- 2014.- Vol.39, №1, Р. 208-215. doi: 10.1007/s11064-013-1210-1.
2. Burbaeva G.Sh., Savushkina O.K., Boksha I.S. Comparative study of creatine kinase BB decrease in brain of patients with Alzheimer's disease and schizophrenia. // NATO Science Series, IOS Press; Netherlands.- 2003.- Р. 125-132.
3. Diamond A. Close interrelation of motor development and cognitive development and of the cerebellum and prefrontal cortex. // Child Dev.- 2000.- Vol. 71, № 1, P. 44-56.
4. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K., Prokhorova T.A., Vorobyeva E.A. Glutamate and GABA-metabolizing enzymes in cerebellum in Alzheimer's disease: Phosphate-activated glutaminase and glutamic acid decarboxylase. // Cerebellum, 2014, Vol.13, N3, P.607-615. doi: 10.1007/s12311-014-0573-4.
5. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K., Starodubtseva L.I., Turishcheva M.S. Glutamate metabolizing enzymes in prefrontal cortex of Alzheimer's disease patients. // Neurochemical Res.- 2005.- Vol. 30, №11, Р.1443-1451. DOI: 10.1007/s11064-005-8654-x.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАУКИ / PHARMACEUTICS
DOI: 10.18454/IRJ.2016.47.264 Коркодинова Л. М.1, Андрюков К. В.2, Курбатов Е.Р.3, Кремлева О. Б.4
1 Доктор фармацевтических наук, 2Кандидат фармацевтических наук, 3 Доктор фармацевтических наук,
4Кандидат химических наук, Пермская государственная фармацевтическая академия
ПОИСК ЗАВИСИМОСТИ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОТ КОНСТАНТ ИОНИЗАЦИИ В РЯДУ N'-АЦИЛГИДРАЗИДОВ ^АЦИЛ-5-БРОМ(5-ЙОД)АНТРАНИЛОВЫХ КИСЛОТ
Аннотация
Экспериментально определены константы ионизации (рКа и рКв) 6 соединений ряда N'-ацилгидразидов N-ацил-5-бром(5-йод)антраниловых кислот методом потенциалов полунейтрализации. Проведен регрессионный анализ и найдено 6 корреляционных уравнений, связывающих рКа и рКв с экспериментально определенной гипогликемической активностью (ГГАэксп). Рассчитаны значения прогнозируемой гипогликемической активности с использованием полученных уравнений. Экспериментально найдены значения ГГА исследуемых 2 соединений. Для оценки прогноза ГГА в сравнении с ГГАэксп., вычислен доверительный интервал индивидуального предсказанного значения.
Ключевые слова: N-ацилзамещенная антраниловая кислота, гидразиды, константа ионизации, гипогликемическая активность, структура-активность.
Korkodinova L.M.1, Andryukov K.V.2, Kurbatov E. R.3, Kremleva O.B.4
1PhD in Pharmaceutics, 2PhD in Pharmaceutics, 3PhD in Pharmaceutics, 4PhD in Chemistry,
Perm state pharmaceutical academy THE SEARCH DEPENDENCE OF HYPOGLYCEMIC ACTIVITY FROM THE IONIZATION CONSTANTS IN THE SERIES OF N'-ACYLHYDRAZIDES OF N-ACYL-5-BROMO(5-IODO)ANTHRANILIC ACIDS
Abstract
The values of ionization constants (pKa and рКв) of 6 substances of N'-acylhydrazides of N-acyl-5-bromo(5-iodo)anthranilic acids by method of potential semi-neutralization are experimentally defined. It is transacted the analysis of regression and received 6 correlation equations connecting the pKa and рКв with experimentally defined hypoglycemic activity (HGAexp). Values of HGA action with use of the made equations are calculated. It is experimentally defined HGAexp. of investigated 2 substances which by results of biological tests are active. To assess the HGA prediction compared with HGAexp., computed confidence interval of the individual prediction.
Keywords: N-acylsubstituted anthranilic acid, hydrazide, ionization constant, hypoglycemic activity, structure-activity.
Известно, что открытие и разработка нового лекарственного вещества в настоящее время требует 10-12 лет исследований и затрат до 800 млн. евро. Тенденция роста расходов не меняется. Одним из перспективных путей для решения данной проблемы является исследование количественной зависимости биологической активности от структуры и физико-химических свойств соединений. На основании этой зависимости можно прогнозировать степень биологической активности для веществ с близкой структурой и уменьшить время и затраты на разработку эффективных лекарственных средств.
Установлено, что все физико-химические факторы, оказывающие влияние на биологическую активность химических соединений, слагаются из трех компонентов: гидрофобной [1], ионизационной [2] и структурной. Вклад каждой из этих составляющих характеризуется степенью влияния на гипогликемическую активность исследуемого объекта.
В качестве объектов исследования для поиска зависимости гипогликемической активности (ГГА) от констант ионизации, мы использовали N'-ацилгидразиды N- ацил 5-бром(5-йод)антраниловых кислот (I - VI).
