CC BY
27
Для корреспонденции
Сопова Юлия Викторовна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Центра трансгенеза и редактирования генома ИТБМ СПбГУ, научный сотрудник лаборатории генетического моделирования болезней человека СПбФ ИОГен РАН
Адрес: 199034, Российская Федерация, г. Санкт-Петербург,
Университетская наб., д. 7/9
Телефон: (812) 363-69-39
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0002-7825-273X
Маркова Е.В.1, Леонова Е.И.1, Сопова Ю.В.1, 2
Сладкий белок браззеин как перспективный
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет», 199034, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
2 Санкт-Петербургский филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, 199034, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
1 St. Petersburg State University, 199034, St. Petersburg, Russian Federation
2 St. Petersburg Branch, Vavilov Institute of General Genetics, 199034, Saint Petersburg, Russian Federation
Неумеренное употребление сахаросодержащих продуктов способствует развитию целого ряда заболеваний, включая ожирение, сахарный диабет и пр. В качестве замены сахара чаще всего используются подсластители. Сладкие белки, в частности браззеин, - это альтернатива синтетическим подсластителям, которая имеет природное происхождение, расщепляется в кишечнике вместе с белками пищи и не влияет на уровни глюкозы и инсулина в крови. Цель обзора - проанализировать имеющиеся данные относительно сладкого белка браззеина, его физико-химических свойств, существующих биотехнологических способов получения и перспектив применения в пищевой промышленности для дальнейшего создания оптимизированной гетерологичной системы экспрессии.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта СПбГУ № 94030690 «Разработка методики направленной интеграции трансгена в локус ROSA26 для получения гуманизированных животных и создания тест-системы для экспресс-генотипирования с использованием Cas нуклеаз».
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
Вклад авторов. Дизайн исследования - Маркова Е.В.; сбор и обработка материала - Маркова Е.В., Сопова Ю.В.; написание текста, редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы. Для цитирования: Маркова Е.В., Леонова Е.И., Сопова Ю.В. Сладкий белок браззеин как перспективный подсластитель // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 1. С. 61-71. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-1-61-71 Статья поступила в редакцию 17.08.2023. Принята в печать 19.01.2024.
Funding. The research was carried out at the expense of the research grant No. 94030690 from the Saint-Petersburg State University "Development of a method for targeted integration of a transgene into the ROSA26 locus to obtain humanized animals and create a test system for rapid genotyping using Cas nucleases".
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution: Research design - Markova E.V.; collection and processing of material - Markova E.V. and Sopova Ju.V.; manuscript writing, editing, adoption of the final article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
For citation: Markova E.V., Leonova E.I., Sopova Ju.V. Sweet protein brazzein as a promising sweetener. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (1): 61-71. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-1-61-71 (in Russian) Received 17.08.2023. Accepted 19.01.2024.
подсластитель
Sweet protein brazzein as a promising sweetener
Markova E.V.1, Leonova E.I.1, Sopova Ju.V.1, 2
Материал и методы. Для сбора и анализа информации были использованы базы данных Google Scholar, Scopus, Web of Science, PubMed, РИНЦ, eLibrary.Ru. Глубина поиска - 30 лет.
Результаты. Многочисленные исследования физико-химических свойств браззеина продемонстрировали его высокий потенциал для использования в пищевой промышленности. В частности, короткая аминокислотная последовательность, термостабильность, способность сохранять свою структуру и сладкие свойства в широком диапазоне pH, гипоаллергенность, отсутствие генотоксичности и высокий уровень сладости по сравнению с сахарозой позволяют сделать вывод о перспективности его использования. Были получены мутантные варианты браззеина, самый сладкий из которых (с 3 аминокислотными заменами H31R/E36D/E41A) превосходит уровень сладости сахарозы в 22 500 раз. На сегодняшний день уже разработаны различные системы экспрессии рекомбинантного браззеина, в качестве продуцентов в которых использовали бактерии (Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus licheniformis), дрожжи (Komagataella phaffii, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae), растения (Zea mays, Oryza sativa, Lactuca sativa, Nicotiana tabacum, Daucus carota) и животных (Mus musculus).
Заключение. Благодаря своей высокой сладости, органолептическим свойствам и длительной истории потребления человеком, браззеин можно рассматривать как многообещающий натуральный подсластитель. Несмотря на короткую пептидную последовательность, производство рекомбинантного белка столкнулось с рядом проблем, включая низкий выход белка (например, в молоке мышей его можно было обнаружить только с помощью вестерн-блот гибридизации) и потерю сладости. Таким образом, для широкого использования в пищевой промышленности необходима дальнейшая оптимизация процесса, включающая в себя выбор адекватного продуцента и использование систем внеклеточной экспрессии для снижения конечной стоимости продукта.
Ключевые слова: подсластители; браззеин; сладкие белки; рецепторы сладкого вкуса; экспрессия браззеина; мутантные варианты браззеина
The excessive consumption of sugar-containing foods contributes to the development of a number of diseases, including obesity, diabetes mellitus, etc. As a substitute for sugar, people with diabetes mellitus and obesity most often use sweeteners. Sweet proteins, in particular brazzein, are an alternative to synthetic sweeteners that have natural origin, are broken down in the intestines along with food proteins, and do not affect blood sugar and insulin levels.
The purpose of the review was to analyze the available data on the sweet protein brazzein, its physical and chemical properties, existing biotechnological methods of production, and prospects for application in the food industry in order to further develop an optimized heterologous expression system.
Material and methods. Google Scholar, Scopus, Web of Science, PubMed, RSCI and eLibrary.ru databases were used for collecting and analyzing literature. Search depth -30 years.
Results. Numerous studies of the physical and chemical properties of brazzein have demonstrated its high potential for use in the food industry. In particular, a short amino acid sequence, thermal stability, the ability to maintain its structure and sweet properties in a wide pH range, hypoallergenicity, lack of genotoxicity, and an extremely high level of sweetness compared to sucrose allow us to conclude that its use is promising. Mutant variants of brazzein have been generated, the sweetest of which (with three amino acid substitutions H31R/E36D/E41A) exceeds sucrose sweetness by 22 500 times. To date, various systems for the expression of recombinant brazzein have already been developed, in which bacteria (Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus licheniformis), yeast (Komagataella phaffii, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae), plants (Zea mays, Oryza sativa, Lactuca sativa, Nicotiana tabacum, Daucus carota) and animals (Mus musculus) have been used.
Conclusion. Due to its high sweetness, organoleptic properties and long history of human consumption, brazzein can be considered as a promising natural sweetener. Despite the short peptide sequence, the production of the recombinant protein faced a number of problems, including low protein yield (for example, it could only be detected in mouse milk by Western blot hybridization) and loss of sweetness. Thus, further optimization of the process is necessary for widespread brazzein use in the food industry, which includes the selection of an adequate producer and the use of extracellular expression systems to reduce the final cost of the product.
Keywords: sweeteners; brazzein; sweet proteins; sweet taste receptors; brazzein expression; brazzein mutant variants
Входе эволюции у наших предков сформировалась способность ощущать сладкий вкус, а также получать удовольствие от его восприятия. Предполагается, что такая реакция обусловлена наличием легкоусвояемых моно- и дисахаридов, таких как глюкоза, в сладких продуктах, которые представляли собой выгодные энергоемкие источники питания, а возможность их эффективно обнаруживать за счет вкусового анализатора имела эволюционное значение для выживания вида [1].
В современном мире большинство людей без труда могут ежедневно обеспечивать себя достаточным количеством энергии. Однако в силу того, что предпочтение сладкого вкуса присутствует уже у новорожденных [2] и обусловлено активацией путей вознаграждения в мозге [3-5], оно может привести к аддиктивному поведению [3]. В частности, из-за чрезмерного потребления сладких продуктов в XXI в. во множестве стран мира как никогда актуальна проблема избыточной массы тела и ожирения среди всех возрастных групп населения [6]. По данным ВОЗ, на 2016 г. более 1,9 млрд людей старше 18 лет (39% популяции) имели избыточную массу тела (индекс массы тела >25 кг/м2). Из этого числа более 650 млн имели ожирение (индекс массы тела >30 кг/м2), что составило 13% от общего числа взрослых людей в мире. В России, по данным ВОЗ, на 2016 г. ожирение было диагностировано у 23,1% совершеннолетнего населения [7]. Помимо риска увеличения массы тела, избыточное или даже умеренное употребление сахаросодержащих пищевых продуктов может повлечь за собой ряд других патологий, среди которых сахарный диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания, гипертония, онкологические заболевания (ассоциированные с ожирением), кариес, а также когнитивные нарушения и эмоциональные расстройства [8]. Вопросы об изменении потребления сахара также активно обсуждаются в научном сообществе [9]. Для решения такой важной проблемы разрабатываются различные программы, в частности сфокусированные на устранении психологических аспектов чрезмерного потребления сахара [10] либо предлагающие увеличить потребление сахарозаменителей [11]. По причинам, изложенным выше, в наше время очень актуальны исследования веществ с пониженной калорийностью и сладким вкусом.
Рецепторы сладкого вкуса и их лиганды
Рецепторы сладкого вкуса, расположенные во вкусовых сосочках на языке, представляют собой молекулярные комплексы, состоящие из вкусового рецептора 1 типа 2 подтипа (Т1Я2) и вкусового рецептора 1 типа 3 подтипа (Т1Я3), которые формируют гетеродимеры Т1Р2-Т1Я3 [12]. Эти рецепторы принадлежат к классу С семейства рецепторов, сопряженных с G-белками ^РСЯ), и могут осуществлять передачу сигнала не только при связывании моно- и дисахаридов
(глюкоза, сахароза, фруктоза), но и различных природных и синтетических сахарозаменителей и подсластителей за счет множественных сайтов связывания рецептора с лигандами [13].
Каждая субъединица рецепторов, входящих в состав гетеродимера, состоит из 3 основных структурных доменов. Внеклеточный лиганд-связывающий домен (домен «венериной мухоловки» - Venus flytrap module, VFTM) состоит из 2 долей, которые могут быть в открытой или закрытой конформации. В закрытой конформации между нижней частью доли 1 и вершиной доли 2 каждого домена VFTM образуется полость для связывания лиганда. Было высказано предположение, что в субъединице T1R2 эта полость является орто-стерическим сайтом связывания природных сахаров и сайтом связывания дипептидных искусственных подсластителей, таких как аспартам и неотам (рис. 1). Домен, богатый цистеином (cysteine rich domain, CRD), содержит 9 консервативных цистеиновых остатков и выполняет роль линкера между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом TMD, состоящим из 7 а-спиралей. Активация рецептора после связывания лиганда запускает сигнальный каскад через G-белки, что приводит к высвобождению внутриклеточных ионов Ca2+, деполяризации мембраны клетки, экзоцитозу аденозинтрифосфата и активации пуринергических рецепторов на афферентных волокнах [14-17]. На основании знаний о строении рецептора сладкого вкуса был сконструирован биоэлектронный сенсор сладкого, успешно детектирующий микроколичества сладкого в образцах [18].
Характеристика сладкого белка браззеина
История промышленного применения подсластителей восходит к 1878 г., когда Константин Фальберг синтезировал очень сладкое вещество (примерно в 300 раз слаще сахарозы), орто-сульфобензойную кислоту, которое стало первым синтетическим подсластителем и получило торговое название «сахарин» [19]. Впоследствии в течение XX-XXI вв. были синтезированы и открыты другие подсластители, среди которых особое место заняли сладкие белки: неокулин, миракулин, браззеин, тауматин, мабинлин, монеллин и пентадин [20]. Уровень сладости перечисленных белков хоть и может немного отличаться в зависимости от качества воды, в которой их растворяют [21], но в среднем на 2-3 порядка слаще сахарозы, что делает их употребление в пищу особенно привлекательным для лиц, страдающих ожирением и сахарным диабетом 1 и 2 типа, поскольку было показано, что данные подсластители в экспериментах на мышах не оказывают влияния на уровень глюкозы и инсулина в крови, а также на возникновение воспаления в жировой ткани [22]. Браззеин является самым маленьким из сладких белков, однако его физико-химические свойства делают этот белок крайне перспективным для
T1R2
T1R3
Рис. 1. Схематическое изображение гетеродимера T1R2-T1R3 рецептора сладкого вкуса
Стрелки указывают места связывания лигандов-подсластителей: цикламата (TMD T1R3) и сукралозы (VFTM T1R2). CRD - домен, богатый цистеином; TMD - семиспиральный трансмембранный домен; T1R2 - вкусовой рецептор 1 типа 2 подтипа; T1R3 - вкусового рецептора 1 типа 3 подтипа; VFTM - внеклеточный лиганд-связывающий домен (домен «венериной мухоловкиVenus flytrap module).
Fig. 1. Schematic representation of the T1R2-T1R3 sweet receptor heterodimer
The arrows Indicate the binding sites of the sweetener Hgands: cyclamate (TMD T1R3) and sucralose (VFTM T1R2). CRD - cystelne-rlch domain; TMD - transmembrane domain; T1R2 - taste receptor type 1 subtype 2; T1R3 - taste receptor type 1 subtype 3; VFTM - the extracellular Venus fly trap module.
промышленного производства и употребления. Он был выделен из мякоти плодов растения Реп1аё'р!апёга Ьганеапа в 1994 г., а затем была определена его аминокислотная последовательность [23]. Оказалось, что выделенный из зрелых фруктов белок представляет собой совокупность из 2 форм, различающихся по наличию остатка пироглутамата на Ы-конце: ругЕ-Ьгагге1п (80% выделенного браззеина, основная форма) и Сев-ругЕ-Ьга22ет (20% выделенного браззеина, побочная форма, лишенная остатка пироглутамата). Браззеин состоит из 54 аминокислотных остатков, а его молекулярная масса составляет 6473 Да. Трехмерная структура, полученная методом рентгеноструктурного анализа, и аминокислотная последовательность браз-зеина приведены на рис. 2.
Кристаллическая структура браззеина содержит следующие элементы вторичной структуры: 2 а-спирали (аминокислотные остатки 13-17, 21-30) и 3 р-цепи (аминокислотные остатки 4-6; 34-39; 45-50), которые образуют антипараллельный р-лист [24]. Следует отметить, что структура молекулы браззеина в растворе, полученная методом ядерного магнитного резонанса,
отличается от кристаллической отсутствием первой а-спирали [24]. 8 цистеиновых остатков образуют 4 внутримолекулярных дисульфидных связи: Суэ4-Суэ52, Сув16-Сув37, Сув22-Сув47 и Сув26-Сув49; что обеспечивает стабилизацию вторичной структуры [25]. Браззеин хорошо растворим в воде (50 мг/см3, или >7 мМ), а также обладает высокими показателями термоустойчивости: было продемонстрировано сохранение им сладкого вкуса при нагревании до 80 0С в течение 4 ч в широком диапазоне значений рН -от 2 до 8 [23]. Официальных данных о возможности безопасного применения браззеина в питании человека в настоящее время нет. Однако в пользу использования браззеина в пищевой промышленности свидетельствуют результаты тестов на отсутствие аллергенности и генотоксичности, в которых было показано, что рекомбинантный браззеин является безопасным для употребления в составе рационов питания [26].
Браззеин примерно в 2000 раз слаще сахарозы на весовой основе и в 9500 раз слаще сахарозы на молярной основе [23, 27]. На настоящий момент в экспериментах по сайт-направленному мутагенезу показано,
что ключевую роль во взаимодеиствии с рецепторами сладкого вкуса на поверхности молекулы браззеина играют следующие 3 саИта полипептидной цепи:
1) петля, сформированная Arg43;
2) N- и C-концевые остатки, Glu36 и петля, сформированная Arg33;
3) петля 9-19.
Однако точный механизм активации браззеином рецептора до конца не установлен. Предполагается, что он взаимодействует с доменом VFTM T1R2 и CRD T1R3 [14, 28] (см. рис. 1), что приводит к изменению конформации рецептора, активации внутриклеточных G-белков и дальнейшей передаче сигнала через фосфо-липазный путь [19]. Поскольку аминокислотные остатки, необходимые для восприятия сладости браззеина, распределены по всей поверхности белка, что подтверждают мутантные варианты белка, приведенные ниже, была предложена модель, согласно которой водородные связи внутри молекулы браззеина определяют формирование на поверхности молекулы так называемых белковых секторов, взаимодействующих с рецептором сладкого вкуса [29, 30].
Наряду со связыванием с рецептором сладкого вкуса для браззеина недавно была показана возможность связывания с Toll-подобным рецептором 5 (TLR5), относящимся к паттерн-распознающим рецепторам (PRRs, pattern recognition receptors) [31].
Мутантные варианты браззеина
С момента выделения браззеина и определения его аминокислотной последовательности были получены различные аминокислотные замены в этом белке для повышения уровня сладости. Сведения о мутантных вариантах браззеина и влиянии внесенных мутаций на уровень сладости представлены в табл. 1. На основе этих данных можно отметить, что мутации, которые нарушают формирование дисульфидных связей, приводят к потере сладкого вкуса. Самые сладкие формы браззеина были получены благодаря мутациям, внесенным в 3 сайтах взаимодействия с рецептором сладкого вкуса, приведенных выше. Кроме того, существенную роль во взаимодействии браззеина с Т1Р2-Т1Я3, по-видимому, играет аминокислотный остаток Е53, который также существенным образом повлиял на сладость браззеина в одном из исследований. На настоящий момент самым сладким из всех полученных мутантных вариантов браззеина является вариант с 3 аминокислотными заменами H31R/E36D/E41A, уровень сладости которого на весовой основе превосходит уровень сладости сахарозы в 22 500 раз и в 18 раз превосходит уровень сладости браззеина дикого типа [32].
Гетерологичные системы экспрессии браззеина
Поскольку процесс выделения браззеина из природного источника имеет ряд существенных недостатков,
1 4 6 13 17 21
pyrEDKCKKVYENYPVSKCQLANQCNYDCKLDK
34 39 45 150 HARSGECFYDEKRNLQCICDYCEY _=__I
Рис. 2. Трехмерная визуализация вторичной структуры браззеина и соответствующая ему аминокислотная последовательность (PDB ID: 4HE7) [23]
Одной чертой подчеркнуты р-слои, двумя - а-спирали, участки взаимодействия с рецептором выделены курсивом, дисуль-фидные связи показаны изогнутыми линиями.
Fig. 2. Three-dimensional visualization of the secondary structure of brazzein and its corresponding amino acid sequence (PDB ID: 4HE7) [23]
в-Chains are underlined with one line, а-helices with two lines, the sites of interaction with the receptor are highlighted in italics, disulfide bonds are shown with curved lines.
одним из которых является низкий выход продукта (содержание белка в плодах Pentadiplandra brazzeana составляет примерно 0,2% [22]), с целью потенциальной дальнейшей коммерциализации и понижения затрат на производство были разработаны различные варианты получения браззеина с использованием гетерологичных экспрессионных систем (на основе растений, животных, бактерий и дрожжей), а также путем пептидного синтеза [40].
Первая бактериальная рекомбинантная система экспрессии браззеина (pyrEdel) была создана с использованием Escherichia coli в 2000 г. Сладость белка была сопоставима с побочной формой браз-зеина (pyrEdel), выделенной из природного источника, однако суммарный выход белка был довольно низким, поскольку значительная фракция браззеина была нерастворима и требовала нескольких стадий
Таблица 1. Сопоставление мутантных вариантов браззеина относительно характера изменений уровня сладости Table 1. Comparison of mutant variants of brazzein regarding the nature of changes in the level of sweetness
Изменение уровня сладости относительно браззеина дикого типа Change in sweetness level relative to wild-type brazzein Мутации Mutations Источник литературы Reference
Повышение уровня сладости Increased sweetness level H31R/E36D/E41A, H31R/E36D, H31R/E41A, E36D/E41A [32]
pyrEdel, A2ins, H31A [29]
pyrEdel, D29A, D29K, D29N, E41K [33]
E9K, E9G [34]
D40K [28]
H31R, E41K, E41R, E41A [35]
A19K [36]
E41A, Y54W, D2E, D40K, E41K/K42E, E41Q, D50N, D2insII, D2insGP [14]
D40A, D40K, E41A, D50Lys, Y54W, D29A/E41K, D29Asn/E41K, D29K/E41K [37]
E53R [38]
pyrEdel/H31 R/E36D/E41A [39]
Снижение уровня сладости Reduced sweetness level K6A, K15A, R33D, H31A, D50A [33]
D2N, C4A, K15A, A19Ins, R33A, R43A, R43A, D50A, Y54del, R55R56ins [29]
Q17N, К30А, R33K, R43K, R43E [35]
A19D [36]
Y39A, K42A, R43K, Y54H, R43E, R43N [14]
pE1M [35]
T39A, R43N, C16A/C37A [37]
E53A, E53D [38]
Потеря сладкого вкуса Loss of sweet taste K6D, R19I, R20ins, K30D, R33A, E36A, E36K, E36Q, R43A, Y54del [33]
T51A [29]
L18_A19insRI, C16A/C37A, C16Q17, A16C17, C16A/Q17C/L18A/19insRI [14]
Существенных изменений нет No significant changes A2ins, D2A, D2N, Q17A [33]
Y8A, Q17A [29]
K30R, H31A [35]
A19G [36]
K5R [14]
K42A [37]
E53K [38]
очистки [27]. В следующем исследовании экспрессия браззеина производилась в бактериях E. coli и Lactococ-cus lactis. В системе E. œli сладость выделенного белка была существенно ниже по сравнению с природным браззеином. В системе L. lactis уровень сладости белка был также снижен по сравнению с природным аналогом, а также в обеих экспрессионных системах выход белка был довольно низким, причем оптимизация кодонов последовательности синтетического гена браззеина для L. lactis привела к большему снижению выхода продукта [41]. В дальнейшем экспрессионная система на основе L. lactis была оптимизирована, что привело к увеличению выхода браззеина в 17 раз [42]. Оптимизация экспрессионной системы E. coli также привела к увеличению выхода белка, однако он не превышал 9 мг/л [43]. Также были созданы рекомбинантные системы экспрессии браззеина в таких растениях, как кукуруза, рис, салат и табак [44-47]. В семенах кукурузы был достигнут крайне высокий выход белка, составивший 400 мкг/г [44]. В ряде исследований одного коллектива браззеин экспрессировали в культуре клеток каллуса
трансгенной моркови в эрлифтном биореакторе-ферментере [48, 49]. Система экспрессии предусматривала введение гена браззеина путем агробактериальной трансформации и обработку культивируемых клеток абсцизовой кислотой. В ходе этого исследования удалось получить выход браззеина 0,67 мкг/г сырой массы. Помимо этого, были созданы трансгенные мыши, у которых экспрессия браззеина происходила в молочных железах [50]. Один из самых сладких мутантных вариантов браззеина pyrEdel/H31R/E36D/E41A также был экспрессирован в молочных железах мышей, в этом исследовании было продемонстрировано, что уровень сладости полученного белка превышал уровень сладости природного аналога в 10 000 раз [39].
Дрожжевые системы продукции браззеина были созданы с использованием таких видов дрожжей, как Komagataella phaffii (ранее Pichia pastoris), Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae. Первые попытки рекомбинантной экспрессии браззеина в дрожжах (S. cerevisiae) были предприняты в 1995 г. Браззеин, слитый с глутатион-в-трансферазой, экспрессировался
Таблица 2. Сопоставление биотехнологических способов получения браззеина Table 2. Comparison of biotechnological methods for obtaining brazzein
Организм Organism Характеристика экспрессируемого белка Characteristics of the expressed protein Выход белка Protein yield Уровень сладости Sweetness level Источник литературы Reference
E. coli des-pGlul-браззеин, слитый со стафилококковой нуклеазой (C-terminal staphylococcal nuclease fusion) 2 мг/л Сладость белка сопоставима со сладостью браззеина (pyrEdel), выделенного из природного источника [27]
E. coli Измененная N-концевая последовательность (MAQDK-), модификации с His-tag и без His-tag на C-конце Нет данных Вариант браззеина без His-tag был менее сладким, чем браззеин дикого типа. Вариант с His-tag не имел сладкого вкуса [41]
E. coli Кодон-оптимизированный браззеин, pyrEdel, N-концевой His-tag 8,4 мг/л Вариант браззеина без His-tag был сладким, вариант браззеина с His-tag не имел сладкого вкуса [43]
E. coli N-концевой His-tag + сумоилирова-ние (SUMO fusion) 50 мг/10 г сырой массы бактериальных клеток Сладость белка аналогична природному браззеину [57]
B. licheniformis des-pGlul-браззеин, слитый с TAT-сигнальным пептидом 5 мг/л Сладость ниже, чем у природного браззеина (в 266 раз слаще сахарозы) [58]
L. lactis Измененная N-концевая последовательность (MAQDK-) Детектировался только путем вестерн-блоттинга Сладость ниже, чем у природного браззеина [42]
Zea mays des-pGlul-браззеин 400 мкг/г в семенах В 1200 раз слаще сахарозы [44]
Daucus carota рЕ1М-браззеин 0,67 мкг/г сырой массы клеток Нет данных [48]
Mus musculus pyrEdel/D29K/E41K 4,37 мг/л Белок слаще сахарозы в 10 000 раз [50]
Mus musculus pyrEdel/H31R/E36D/E41A 332,59 мг/л Белок слаще сахарозы в 10 000 раз [39]
S. cerevisiae pyrEdel 10 мг/л Сладость белка аналогична природному браззеину [55]
K. phaffii pyrE, Q1pyrE, pyrEdel 90, 30, и 90 мг/л очищенного белка для форм pyrE, Q1 pyrE, pyrEdel соответственно Сладость 3 форм белка варьировала в диапазоне от 400 до 1500 раз слаще сахарозы [51]
K. lactis pyrEdel 104-170 мг/л Сладость белка аналогична природному браззеину [53, 59, 60]
внутриклеточно, идентичность экспрессируемого белка была подтверждена с помощью антител, однако выделенный рекомбинантный браззеин в дальнейшем не был охарактеризован [51]. В 2012 г. была разработана система экспрессии браззеина в метилотрофных дрожжах K. phaffii [52]. В этой системе рекомбинантный браззеин эффективно секретировался в минимальную среду за счет использования сигнальной последовательности гена а-фактора S. cerevisiae под контролем индуцируемого метанолом промотора алкогольок-сидазы. В данном исследовании экспрессировались 3 формы браззеина: pyrE и pyrEdel, а также Q1pyrE. За период секреции 6 дней клетки P. pastoris секре-тировали примерно 90, 30 и 90 мг/л браззеина pyrE, Q1pyrE, pyrEdel соответственно. Масс-спектрометрия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса показали, что рекомбинантные формы браззеина имеют идентичную природным белкам конформацию. Органолептические исследования подтвердили, что рекомбинантный браззеин обладает вкусовыми свойствами, сходными со свойствами 2 природных форм браззеина. Браззеин (pyrEdel) также экспрессировали с помощью дрожжей K. lactis [53]. Браззеин из дрожжевых
клеток в культуральную среду экспортировался также за счет сигнальной последовательности гена а-фактора S. cerevisiae. Через 96 ч количество очищенного рекомбинантного браззеина составляло примерно 104 мг/л культуры. Секвенирование N-концевых аминокислот секретируемого браззеина подтвердило идентичность очищенного белка и правильное расщепление сигнального пептида. Нативное конформационное состояние рекомбинантного браззеина было подтверждено при помощи метода спектроскопии кругового дихроизма. Органолептический анализ выявил, что сладость очищенного браззеина, продуцируемого дрожжами K. lactis, была идентична природному браззеину (в 2130 раз слаще сахарозы на весовой основе). В дальнейшем исследователям удалось вдвое повысить уровень экспрессии браззеина в системе K. lactis за счет индукции сверхэкспрессии протеиндисульфиди-зомеразы и белка Erolp, необходимых для правильного формирования дисульфидных связей в браззеине [54]. В 2020 г. были проведены новые исследования с использованием S. cerevisiae для гетерологичной экспрессии браззеина (pyrEdel) под контролем промотора GPD [55]. Выход очищенного белка был низким по сравнению
с другими дрожжевыми экспрессионными системами, примерно 10 мг/л, что свидетельствует о низкой эффективности систем внутриклеточной экспрессии. Интересным вариантом является удачный пример синтеза браззеина в бесклеточной системе [56], однако масштабируемость данного эксперимента вызывает сомнения. Сведения о гетерологичных системах экспрессии браззеина обобщены в табл. 2.
Обобщая содержание данного раздела, можно сказать, что каждая из гетерологичных систем экспрессии наряду со своими достоинствами обладает существенными недостатками. Так, экспрессия в бактериях обнаружила понижение сладости и низкий выход белка. Экспрессия в клетках молочной железы мышей - низкий выход белка. Экспрессия в семенах кукурузы - высокий выход белка, но сложный и многоэтапный процесс очистки. Дрожжевые системы на основе K. phaffii и K. lactis демонстрировали высокий выход белка, но требовали очень тщательной очистки. Дрожжевая система с продуцентом б. cerevisiae и внутриклеточной экспрессией также показала относительно низкий выход белка.
Заключение
Среди многих подсластителей, которые сводят к минимуму потребление сахара, многообещающей является группа сладких белков. Браззеин - самый маленький из сладких белков (54 аминокислотных остатка, 6473 Да), он привлекателен для лиц с ожирением и сахарным
диабетом, поскольку не влияет на уровень глюкозы и инсулина в крови. Браззеин обладает высокой термостабильностью в широком диапазоне рН и является безопасным для употребления в составе рациона питания, хотя официальные данные о безопасности данного вещества в настоящее время отсутствуют. Для повышения уровня сладости браззеина путем сайт-направленного мутагенеза были созданы мутантные варианты этого белка, самым сладким из них является тройной мутант H31R/E36D/E41A, который в 22 500 раз слаще сахарозы. Поскольку содержание браззеина в плодах природного источника (Pentadiplandra brazzeana) крайне низкое (0,2%), были разработаны различные способы получения браззеина с использованием гете-рологичных экспрессионных систем, в качестве продуцентов которых использовались: бактерии (Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus licheniformis), дрожжи (Komagataella phaffii, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae), растения (Zea mays, Oryza sativa, Lactuca sativa, Nicotiana tabacum, Daucus carota) и животные (Mus musculus). Несмотря на короткую пептидную последовательность, производство рекомбинантного белка столкнулось с рядом проблем, включая низкий выход белка (например, в молоке мышей его можно было обнаружить только с помощью вестерн-блоттинга) и потерю сладости. Таким образом, для широкого использования в пищевой промышленности необходима дальнейшая оптимизация процесса, включающая выбор адекватного продуцента и использование систем внеклеточной экспрессии для снижения конечной стоимости продукта.
Сведения об авторах
Маркова Екатерина Валерьевна (Ekaterina V. Markova) - лаборант-исследователь центра трансгенеза и редактирования генома ИТБМ СПбГУ (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: [email protected]
Леонова Елена Ивановна (Elena I. Leonova) - кандидат биологических наук, директор центра трансгенеза и редактирования генома ИТБМ СПбГУ (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0236-3302
Сопова Юлия Викторовна (Julia V. Sopova) - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник центра трансгенеза и редактирования генома ИТБМ СПбГУ, научный сотрудник СПбФ ИОГен РАН (Санкт-Петербург, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7825-273X
Литература
Beauchamp G.K. Why do we like sweet taste: a bitter tale? // Physiol. Behav. 2016. Vol. 164. P. 432-437. DOI: https://doi.org/10.1016/ J.PHYSBEH.2016.05.007
Beauchamp G.K., Mennella J.A. Flavor perception in human infants: development and functional significance // Digestion. 2011. Vol. 83, suppl. 1. P. 1-6. DOI: https://doi.org/10.1159/000323397 Kendig M.D. Cognitive and behavioural effects of sugar consumption in rodents. A review // Appetite. 2014. Vol. 80. P. 41-54. DOI: https://doi. org/10.1016/j.appet.2014.04.028
Han P., Bagenna B., Fu M. The sweet taste signalling pathways in the oral cavity and the gastrointestinal tract affect human appetite and food
intake: a review // Int. J. Food Sci. Nutr. 2019. Vol. 70, N 2. P. 125-135.
DOI: https://doi.org/10.1080/09637486.2018.1492522
Gutierrez R., Fonseca E., Simon S.A. The neuroscience of sugars
in taste, gut-reward, feeding circuits, and obesity // Cell. Mol. Life
Sci. 2020. Vol. 77, N 18. P. 3469-3502. DOI: https://doi.org/10.1007/
s00018-020-03458-2
Stanhope K.L. Sugar consumption, metabolic disease and obesity: the state of the controversy // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2016. Vol. 53, N 1. P. 52-67. DOI: https://doi.org/10.3109/10408363.2015.1084990 Kholmatova K., Krettek A., Leon D.A., Malyutina S., Cook S., Hopstock L.A. et al. Obesity prevalence and associated socio-demo-
2
6
4
7
graphic characteristics and health behaviors in Russia and Norway // 27. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2022. Vol. 19, N 15. P. 9428. DOI: https://doi.org/10.3390/yerph19159428
8. Jacques A., Chaaya N., Beecher K., Ali S.A., Belmer A., Bartlett S. The impact of sugar consumption on stress driven, emotional and addic- 28. tive behaviors // Neurosci. Biobehav. Rev. 2019. Vol. 103. P. 178-199. DOI: https://doi.org/10.1016/j.neubiorev. 2019.05.021
9. Yan R.R., Chan C.B., Louie J.C.Y. Current WHO recommendation
to reduce free sugar intake from all sources to below 10% of daily 29. energy intake for supporting overall health is not well supported by available evidence // Am. J. Clin. Nutr. 2022. Vol. 116, N 1. P. 15-39. DOI: https://doi.org/10.1093/ajcn/nqac084
10. Joveini H., Sharifi N., Meymary B.K., Mehri A., Shahrabadi R., 30. Rahmanian V. et al. The effect of empowerment program to reduce sugar consumption based on the multi-theory model on body mass index and abdominal obesity in Iranian women // BMC Womens Health. 2023. Vol. 23, N 1. P. 207. DOI: https://doi.org/10.1186/s12905- 31. 023-02361-9
11. Warshaw H., Edelman S.V. Practical strategies to help reduce added sugars consumption to support glycemic and weight management goals // Clin. Diabetes. 2021. Vol. 39, N 1. P. 45-56. DOI: https://doi. org/10.2337/cd20-0034 32.
12. Temussi P.A. Sweet, bitter and umami receptors: a complex relationship // Trends Biochem. Sci. 2009. Vol. 34, N 6. P. 296-302. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.tibs.2009.02.005
13. Jiang P., Cui M., Zhao B., Snyder L.A., Benard L.M., Osman R. 33. et al. Identification of the cyclamate interaction site within the transmembrane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3 //
J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, N 40. P. 34 296-34 305. DOI: https://doi. org/10.1074/jbc.M505255200
14. Assadi-Porter F.M., Maillet E.L., Radek J.T., Quijada J., Markley J.L., 34. Max M. Key amino acid residues involved in multi-point binding interactions between brazzein, a sweet protein, and the T1R2-T1R3 human sweet receptor // J. Mol. Biol. 2010. Vol. 398, N 4. P. 584-599. DOI: https://doi.org/10.1016/jjmb.2010.03.017 35.
15. Nango E., Akiyama S., Maki-Yonekura S., Ashikawa Y., Kusakabe Y., Krayukhina E. et al. Taste substance binding elicits conformational change of taste receptor T1r heterodimer extracellular domains // Sci. Rep. 2016. Vol. 6, N 1. Article ID 25745. DOI: https://doi.org/10.1038/ 36. srep25745
16. Ahmad R., Dalziel J.E. G protein-coupled receptors in taste physiology and pharmacology // Front. Pharmacol. 2020. Vol. 11. Article
ID 587664. DOI: https://doi.org/10.3389/fphar.2020.587664 37.
17. Dutta Banik D., Martin L.E., Freichel M., Torregrossa A.M., Med-ler K.F. TRPM4 and TRPM5 are both required for normal signaling in taste receptor cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2018. Vol. 115, N 4.
P. E772-E781. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1718802115 38.
18. Jeong J.-Y., Cha Y.K., Ahn S.R., Shin J., Choi Y., Park T.H. et al. Ultrasensitive bioelectronic tongue based on the Venus Flytrap Domain of a human sweet taste receptor // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2022. Vol. 14, N 2. P. 2478-2487. DOI: https://doi.org/10.1021/ 39. acsami.1c17349
19. Mahmood A.A.R., Al-Juboori S.B. A review: saccharin discovery, synthesis, and applications // Ibn AL-Haitham J. Pure Appl. Sci. 2020.
Vol. 33, N 2. P. 43-61. DOI: https://doi.org/10.30526/33.2.2442 40.
20. Yusuf E.H. An overview of biotransformation for the sustainability of sweet-tasting proteins as natural sugar replacers // Chem. Proc. 2022. Vol. 8, N 1. P. 85. DOI: https://doi.org/10.3390/ecsoc-25-11640
21. Delfi M., Emendato A., Temussi P.A., Picone D. Striking dependence 41. of protein sweetness on water quality: the role of the ionic strength // Front. Mol. Biosci. 2021. Vol. 8. Article ID 705102. DOI: https://doi. org/10.3389/fmolb.2021.705102
22. Kim H., Kang J., Hong S., Jo S., Noh H., Kang B.H. et al. 3M-brazzein
as a natural sugar substitute attenuates obesity, metabolic disorder, and 42. inflammation // J. Agric. Food Chem. 2020. Vol. 68, N 7. P. 2183-2192. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c00317
23. Bilal M., Ji L., Xu S., Zhang Y., Iqbal H.M.N., Cheng H. Bioprospecting and biotechnological insights into sweet-tasting proteins by microbial hosts - a review // Bioengineered. 2022. Vol. 13, N 4. P. 9815-9828. 43. DOI: https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2061147
24. Nagata K., Hongo N., Kameda Y., Yamamura A., Sasaki H., Lee W.C. et al. The structure of brazzein, a sweet-tasting protein from the wild African plant Pentadiplandra brazzeana // Acta Cryst. 2013. Vol. 69, 44. N 4. P. 642-647. DOI: https://doi.org/10.1107/S0907444913001005
25. Kohmura M., Ota M., Izawa H., Ming D., Hellekant G., Ariy-oshi Y. Assignment of the disulfide bonds in the sweet protein brazzein // Biopolymers. 1996. Vol. 38, N 4. P. 553-556. DOI: https:// doi.org/10.1002/(SICI)1097-0282(199604)38:4%3C553::AID- 45. BIP10%3E3.0.CO;2-B
26. Lynch B., Wang T., Vo T., Tafazoli S., Ryder J. Safety evaluation of oubli fruit sweet protein (brazzein) derived from Komagataella phaffii, intended for use as a sweetener in food and beverages // Toxicol. Res. Appl. 46. 2023. Vol. 7. P. 1-21. DOI: https://doi.org/10.1177/23978473231151258
Assadi-Porter F.M., Aceti D.J, Cheng H., Markley J.L. Efficient production of recombinant brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein of plant origin // Arch. Biochem. Biophys. 2000. Vol. 376, N 2. P. 252-258. DOI: https://doi.org/10.1006/abbi.2000.1725 Singarapu K.K. Tonelli M., Markley J.L., Assadi-Porter F.M. Structure-function relationships of brazzein variants with altered interactions with the human sweet taste receptor // Protein Sci. 2016. Vol. 25, N 3. P. 711-719. DOI: https://doi.org/10.1002/pro.2870 Assadi-Porter F.M., Aceti D.J., Markley J.L. Sweetness determinant sites of brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein // Arch. Biochem. Biophys. 2000. Vol. 376, N 2. P. 259-265. DOI: https://doi. org/10.1006/abbi.2000.1726
Zhao X., Wang C., Zheng Y., Liu B. New insight into the structure-activity relationship of sweet-tasting proteins: protein sector and its role for sweet properties // Front. Nutr. 2021. Vol. 8. Article ID 691368. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2021.691368
Poursalim M., Shasaltaneh M.D., Jafarian V., Salehabadi H. The novel anti-cancer feature of brazzein through activating of hTLR5 by integration of biological evaluation: molecular docking and molecular dynamics simulation // Sci. Rep. 2022. Vol. 12, N 1. Article ID 21979. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26487-2 Lee J.W., Cha J.E., Jo H.J., Kong K.H. Multiple mutations of the critical amino acid residues for the sweetness of the sweet-tasting protein, brazzein // Food Chem. 2013. Vol. 138, N 2-3. P. 1370-1373. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.10.140 Jin Z. Danilova V., Assadi-Porter F.M., Markley J.L., Hellekant G. Monkey electrophysiological and human psychophysical responses to mutants of the sweet protein brazzein: delineating brazzein sweetness // Chem. Senses. 2003. Vol. 28, N 6. P. 491-498. DOI: https://doi. org/10.1093/chemse/28.6.491
Jafari S.S., Jafarian V., Khalifeh K., Ghanavatian P., Shirdel S.A. The effect of charge alteration and flexibility on the function and structural stability of sweet-tasting brazzein // RSC Advances. 2016. Vol. 6, N 64. P. 59 834-59 841. DOI: https://doi.org/10.1039/c6ra12626j Yoon S.Y., Kong J.N., Jo D.H., Kong K.H. Residue mutations in the sweetness loops for the sweet-tasting protein brazzein // Food Chem. 2011. Vol. 129, N 4. P. 1327-1330. DOI: https://doi.org/10.1016/j.food-chem.2011.06.054
Ghanavatian P., Khalifeh K., Jafarian V. Structural features and activity of brazzein and its mutants upon substitution of a surfaced exposed alanine // Biochimie. 2016. Vol. 131. P. 20-28. DOI: https://doi. org/10.1016/j.biochi.2016.09.006
Walters D.E. Cragin T., Jin Z., Rumbley J.N., Hellekant G. Design and evaluation of new analogs of the sweet protein brazzein // Chem. Senses. 2009. Vol. 34, N 8. P. 679-683. DOI: https://doi.org/10.1093/chemse/ bjp048
Lim J.K. Jang J.C., Kong J.N., Kim M.C., Kong K.H. Importance of Glu53 in the C-terminal region of brazzein, a sweet-tasting protein // J. Sci. Food Agric. 2016. Vol. 96, N 9. P. 3202-3206. DOI: https://doi. org/10.1002/jsfa.7501
Lu R., Li X., Hu J., Zhang Y., Wang Y., Jin L. Expression of a triple mutational des-pGlu brazzein in transgenic mouse milk // FEBS Open Bio. 2022. Vol. 12, N 7. P. 1336-1343. DOI: https://doi. org/10.1002/2211-5463.13411
Ota M., Kohmura M., Ariyoshit Y. Synthesis and characterization of the sweet protein brazzein // Biopolymers. 1996. Vol. 39, N 1. P. 95-101. DOI: https://doi.org/10.1002/(sici) 1097-0282(199607)39:1<95::aid-bip10>3.0.co;2-b
Berlec A., Jevnikar Z., Majhenic A.C., Rogelj I., Strukelj B. Expression of the sweet-tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. Vol. 73, N 1. P. 158-165. DOI: https://doi. org/10.1007/s00253-006-0438-y
Berlec A., Tompa G., Slapar N., Fonovic U.P., Rogelj I., Strukelj B. Optimization of fermentation conditions for the expression of sweet-tasting protein brazzein in Lactococcus lactis // Lett. Appl. Microbiol. 2008. Vol. 46, N 2. P. 227-231. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2007.02297.x
Jafarian V., Bagheri K., Zarei J., Karami S., Ghanavatian P. Improved expression of recombinant sweet-tasting brazzein using codon optimization and host change as new strategies // Food Biotechnol. 2020. Vol. 34, N 1. P. 62-76. DOI: https://doi.org/10.1080/08905436.2019.1711113 Lamphear B.J., Barker D.K., Brooks C.A., Delaney D.E., Lane J.R., Beifuss K. et al. Expression of the sweet protein brazzein in maize for production of a new commercial sweetener // Plant Biotechnol. J. 2005. Vol. 3, N 1. P. 103-114. DOI: https://doi.org/10.1111/j. 1467-7652.2004.00105.x
Lee Y.R., Akter S., Lee I.H., Jung Y.J., Park S.Y., Cho Y.-G. et al. Stable expression of brazzein protein, a new type of alternative sweetener in transgenic rice // J. Plant Biotechnol. 2018. Vol. 45, N 1. P. 63-70. DOI: https://doi.org/10.5010/JPB.2018.45.L063
Jung Y.J., Kang K.K. Stable expression and characterization ofbrazzein, thaumatin and miraculin genes related to sweet protein in trans-
genic lettuce // J. Plant Biotechnol. 2018. Vol. 45, N 3. P. 257-265. DOI: https://doi.Org/10.5010/JPB.2018.45.3.257
47. Choi H.E., Lee J.I., Jo S.Y., Chae Y.C., Lee J.H., Sun H.J. et al. 54. Functional expression of the sweet-tasting protein brazzein in transgenic tobacco // Food Sci. Technol. 2022. Vol. 42. Article ID e40521. DOI: https://doi.org/10.1590/fst.40521
48. Han J.E., Lee H., Ho T.-T., Park S.-Y. Brazzein protein production 55. in transgenic carrot cells using air-lift bioreactor culture // Plant Biotechnol. Rep. 2022. Vol. 16, N 2. P. 161-171. DOI: https://doi. org/10.1007/s11816-022-00743-3
49. Han J.-E., Park Y.-J., Lee H., Jeong Y.-J., Park S.-Y. Increased brazzein 56. expression by abiotic stress and bioreactor culture system for the production of sweet protein, brazzein // Plant Biotechnol. Rep. 2020. Vol. 14,
N 4. P. 459-466. DOI: https://doi.org/10.1007/s11816-020-00625-6
50. Yan S., Song H., Pang D., Zou Q., Li L., Yan Q. et al. Expression of 57. plant sweet protein brazzein in the milk of transgenic mice // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 10. P. 1-8. DOI: https://doi.org/10.1371/journal. pone.0076769
51. Neiers F., Naumer C., Krohn M., Briand L. The recent development 58. of a sweet-tasting brazzein and its potential industrial applications // Sweeteners. Reference Series in Phytochemistry / eds J.M. Merillon,
K. Ramawat. Cham : Springer, 2016. P. 1-20. DOI: https://doi. org/10.1007/978-3-319-26478-3_2-1 ISBN978-3-319-26478-3. 59.
52. Poirier N., Roudnitzky N., Brockhoff A., Belloir C., Maison M., Thomas-Danguin T. et al. Efficient production and characterization of the sweet-tasting brazzein secreted by the yeast Pichia pastoris //
J. Agric. Food Chem. 2012. Vol. 60, N 39. P. 9807-9814. DOI: https:// 60. doi.org/10.1021/jf301600m
53. Jo H.J., Noh J.S., Kong K.H. Efficient secretory expression of the sweet-tasting protein brazzein in the yeast Kluyveromyces lactis // Protein
Expr. Purif. 2013. Vol. 90, N 2. P. 84-89. DOI: https://doi.org/10.1016/j. pep.2013.05.001
Yun C.R., Kong J.N., Chung J.H., Kim M.C., Kong K.H. Improved secretory production of the sweet-tasting protein, brazzein, in Kluyveromyces lactis // J. Agric. Food Chem. 2016. Vol. 64, N 32. P. 6312-6316. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b02446 Kazemi-Nasab A., Shahpiri A. Expression of brazzein, a small sweet-tasting protein in Saccharomyces cerevisiae: an introduction for production of sweet yeasts // Protein Pept. Lett. 2020. Vol. 27, N 10. P. 945-952. DOI: https://doi.org/10.2174/0929866527666200331134431 Казловский И.С., Бельская И.В., Зинченко А.И. Биосинтез браззеина в бактериальной системе бесклеточного синтеза белка // Доклады Национальной академии наук Беларуси. 2020. Т. 64, № 1. С. 71-77. DOI: https://doi.org/10.29235/1561-8323-2020-64-1-71-77 Assadi-Porter F.M., Patry S., Markley J.L. Efficient and rapid protein expression and purification of small high disulfide containing sweet protein brazzein in E. coli // Protein Expr. Purif. 2008. Vol. 58, N 2. P. 263-268. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pep.2007.11.009 Hung C.Y., Cheng L.H., Yeh C.M. Functional expression of recombinant sweet-tasting protein brazzein by Escherichia coli and Bacillus licheniformis // Food Biotechnol. 2019. Vol. 33, N 3. P. 251-271. DOI: https://doi.org/10.1080/08905436.2019.1618323 Park S.W., Kang B.H., Lee H.M., Lee S.J., Kim H.S., Choi H.W. et al. Efficient brazzein production in yeast (Kluyveromyces lactis) using a chemically defined medium // Bioprocess Biosyst. Eng. 2021. Vol. 44, N 4. P. 913-925. DOI: https://doi.org/10.1007/s00449-020-02499-y Lee H.M., Park S.W., Lee S.J., Kong K.H. Optimized production and quantification of the tryptophan-deficient sweet-tasting protein brazzein in Kluyveromyces lactis // Prep. Biochem. Biotechnol. 2019. Vol. 49, N 8. P. 790-799. DOI: https://doi.org/10.1080/10826068.2019.1621892
References
1. Beauchamp G.K. Why do we like sweet taste: a bitter tale? Physiol. Behav. 2016; 164: 432-7. DOI: https://doi.org/10.1016/ J.PHYSBEH.2016.05.007
2. Beauchamp G.K., Mennella J.A. Flavor perception in human infants: development and functional significance. Digestion. 2011; 83 (suppl 1): 1-6. DOI: https://doi.org/10.1159/000323397
3. Kendig M.D. Cognitive and behavioural effects of sugar consumption in rodents. A review. Appetite. 2014; 80: 41-54. DOI: https://doi. org/10.1016/j.appet.2014.04.028
4. Han P., Bagenna B., Fu M. The sweet taste signalling pathways in the oral cavity and the gastrointestinal tract affect human appetite and food intake: a review. Int J Food Sci Nutr. 2019; 70 (2): 125-35. DOI: https:// doi.org/10.1080/09637486.2018.1492522
5. Gutierrez R., Fonseca E., Simon S.A. The neuroscience of sugars in taste, gut-reward, feeding circuits, and obesity. Cell Mol Life Sci. 2020; 77 (18): 3469-502. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-020-03458-2
6. Stanhope K.L. Sugar consumption, metabolic disease and obesity: the state of the controversy. Crit Rev Clin Lab Sci. 2016; 53 (1): 52-67. DOI: https://doi.org/10.3109/10408363.2015.1084990
7. Kholmatova K., Krettek A., Leon D.A., Malyutina S., Cook S., Hopstock L.A., et al. Obesity prevalence and associated socio-demo-graphic characteristics and health behaviors in Russia and Norway. Int J Environ Res Public Health. 2022; 19 (15): 9428. DOI: https://doi. org/10.3390/ijerph19159428
8. Jacques A., Chaaya N., Beecher K., Ali S.A., Belmer A., Bartlett S. The impact of sugar consumption on stress driven, emotional and addictive behaviors. Neurosci Biobehav Rev. 2019; 103: 178-99. DOI: https://doi. org/10.1016/j.neubiorev.2019.05.021
9. Yan R.R., Chan C.B., Louie J.C.Y. Current WHO recommendation to reduce free sugar intake from all sources to below 10% of daily energy intake for supporting overall health is not well supported by available evidence. Am J Clin Nutr. 2022; 116 (1): 15-39. DOI: https://doi. org/10.1093/ajcn/nqac084
10. Joveini H., Sharifi N., Meymary B.K., Mehri A., Shahrabadi R., Rahmanian V., et al. The effect of empowerment program to reduce sugar consumption based on the multi-theory model on body mass index and abdominal obesity in Iranian women. BMC Womens Health. 2023; 23 (1): 207. DOI: https://doi.org/10.1186/s12905-023-02361-9
11. Warshaw H., Edelman S.V. Practical strategies to help reduce added sugars consumption to support glycemic and weight management goals. Clin Diabetes. 2021; 39 (1): 45-56. DOI: https://doi.org/10.2337/cd20-0034
12. Temussi P.A. Sweet, bitter and umami receptors: a complex relationship. Trends Biochem Sci. 2009; 34 (6): 296-302. DOI: https://doi. org/10.1016/j.tibs.2009.02.005
13. Jiang P., Cui M., Zhao B., Snyder L.A., Benard L.M., Osman R., et al. Identification of the cyclamate interaction site within the transmem-
brane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3. J Biol Chem. 2005; 280 (40): 34 296-305. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc. M505255200
14. Assadi-Porter F.M., Maillet E.L., Radek J.T., Qujjada J., Markley J.L., Max M. Key amino acid residues involved in multi-point binding interactions between brazzein, a sweet protein, and the T1R2-T1R3 human sweet receptor. J Mol Biol. 2010; 398 (4): 584-99. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jmb.2010.03.017
15. Nango E., Akiyama S., Maki-Yonekura S., Ashikawa Y., Kusakabe Y., Krayukhina E., et al. Taste substance binding elicits conformational change of taste receptor T1r heterodimer extracellular domains. Sci Rep. 2016; 6 (1): 25745. DOI: https://doi.org/10.1038/srep25745
16. Ahmad R., Dalziel J.E. G protein-coupled receptors in taste physiology and pharmacology. Front Pharmacol. 2020; 11: 587664. DOI: https:// doi.org/10.3389/fphar.2020.587664
17. Dutta Banik D., Martin L.E., Freichel M., Torregrossa A.M., Medler K.F. TRPM4 and TRPM5 are both required for normal signaling in taste receptor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2018; 115 (4): E772-81. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1718802115
18. Jeong J.-Y., Cha Y.K., Ahn S.R., Shin J., Choi Y., Park T.H., et al. Ultrasensitive bioelectronic tongue based on the Venus Flytrap Domain of a human sweet taste receptor. ACS Appl Mater Interfaces. 2022; 14 (2): 2478-87. DOI: https://doi.org/10.1021/acsami.1c17349
19. Mahmood A.A.R., Al-Juboori S.B. A review: saccharin discovery, synthesis, and applications. Ibn AL-Haitham J Pure Appl Sci. 2020; 33 (2): 43-61. DOI: https://doi.org/10.30526/33.2.2442
20. Yusuf E.H. An overview of biotransformation for the sustainability of sweet-tasting proteins as natural sugar replacers. Chem Proc. 2022; 8 (1): 85. DOI: https://doi.org/10.3390/ecsoc-25-11640
21. Delfi M., Emendato A., Temussi P.A., Picone D. Striking dependence of protein sweetness on water quality: the role of the ionic strength. Front Mol Biosci. 2021; 8: 705102. DOI: https://doi.org/10.3389/ fmolb.2021.705102
22. Kim H., Kang J., Hong S., Jo S., Noh H., Kang B.H., et al. 3M-brazzein as a natural sugar substitute attenuates obesity, metabolic disorder, and inflammation. J Agric Food Chem. 2020; 68 (7): 2183-2192. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c00317
23. Bilal M., Ji L., Xu S., Zhang Y., Iqbal H.M.N., Cheng H. Bioprospecting and biotechnological insights into sweet-tasting proteins by microbial hosts - a review. Bioengineered. 2022; 13 (4): 9815-28. DOI: https:// doi.org/10.1080/21655979.2022.2061147
24. Nagata K., Hongo N., Kameda Y., Yamamura A., Sasaki H., Lee W.C., et al. The structure of brazzein, a sweet-tasting protein from the wild African plant Pentadiplandra brazzeana. Acta Cryst. 2013; 69 (4): 642-7. DOI: https://doi.org/10.1107/S0907444913001005
25. Kohmura M., Ota M., Izawa H., Ming D., Hellekant G., Ariyoshi Y. Assignment of the disulfide bonds in the sweet protein brazzein.
Biopolymers. 1996; 38 (4): 553-6. DOI: https://doi.org/10.1002/ (SICI)1097-0282(199604)38:4%3C553::AID-BIP10%3E3.0.CO;2-B
26. Lynch B., Wang T., Vo T., Tafazoli S., Ryder J. Safety evaluation of 44. oubli fruit sweet protein (brazzein) derived from Komagataella phaffii, intended for use as a sweetener in food and beverages. Toxicol Res Appl. 2023; 7: 1-21. DOI: https://doi.org/10.1177/23978473231151258
27. Assadi-Porter F.M., Aceti D.J, Cheng H., Markley J.L. Efficient 45. production of recombinant brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein of plant origin. Arch Biochem Biophys. 2000; 376 (2): 252-8. DOI: https://doi.org/10.1006/abbi.2000.1725
28. Singarapu K.K. Tonelli M., Markley J.L., Assadi-Porter F.M. Struc- 46. ture-function relationships of brazzein variants with altered interactions with the human sweet taste receptor. Protein Sci. 2016; 25 (3): 711-9. DOI: https://doi.org/10.1002/pro.2870
29. Assadi-Porter F.M., Aceti D.J., Markley J.L. Sweetness determinant 47. sites of brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein. Arch Biochem Biophys. 2000; 376 (2): 259-65. DOI: https://doi.org/10.1006/ abbi.2000.1726
30. Zhao X., Wang C., Zheng Y., Liu B. New insight into the structure- 48. activity relationship of sweet-tasting proteins: protein sector and its
role for sweet properties. Front Nutr. 2021; 8: 691368. DOI: https://doi. org/10.3389/fnut.2021.691368
31. Poursalim M., Shasaltaneh M.D., Jafarian V., Salehabadi H. The 49. novel anti-cancer feature of brazzein through activating of hTLR5 by integration of biological evaluation: molecular docking and molecular dynamics simulation. Sci Rep. 2022; 12 (1): 21979. DOI: https://doi. org/10.1038/s41598-022-26487-2 50.
32. Lee J.W., Cha J.E., Jo H.J., Kong K.H. Multiple mutations of the critical amino acid residues for the sweetness of the sweet-tasting protein, brazzein. Food Chem. 2013; 138 (2-3): 1370-3. DOI: https://doi. 51. org/10.1016/j.foodchem.2012.10.140
33. Jin Z. Danilova V., Assadi-Porter F.M., Markley J.L., Hellekant G. Monkey electrophysiological and human psychophysical responses to mutants of the sweet protein brazzein: delineating brazzein sweetness. Chem Senses. 2003; 28 (6): 491-8. DOI: https://doi.org/10.1093/ 52. chemse/28.6.491
34. Jafari S.S., Jafarian V., Khalifeh K., Ghanavatian P., Shirdel S.A. The effect of charge alteration and flexibility on the function and structural stability of sweet-tasting brazzein. RSC Advances. 2016; 6 (64): 5983441. DOI: https://doi.org/10.1039/c6ra12626j 53.
35. Yoon S.Y., Kong J.N., Jo D.H., Kong K.H. Residue mutations in the sweetness loops for the sweet-tasting protein brazzein. Food Chem. 2011; 129 (4): 1327-30. DOI: https://doi.org/10.1016/j.food-chem.2011.06.054 54.
36. Ghanavatian P., Khalifeh K., Jafarian V. Structural features and activity of brazzein and its mutants upon substitution of a surfaced exposed alanine. Biochimie. 2016; 131: 20-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j. biochi.2016.09.006 55.
37. Walters D.E. Cragin T., Jin Z., Rumbley J.N., Hellekant G. Design and evaluation of new analogs of the sweet protein brazzein. Chem Senses. 2009; 34 (8): 679-83. DOI: https://doi.org/10.1093/chemse/bjp048
38. Lim J.K. Jang J.C., Kong J.N., Kim M.C., Kong K.H. Importance of 56. Glu53 in the C-terminal region of brazzein, a sweet-tasting protein. J Sci Food Agric. 2016; 96 (9): 3202-6. DOI: https://doi.org/10.1002/jsfa.7501
39. Lu R., Li X., Hu J., Zhang Y., Wang Y., Jin L. Expression of a triple mutational des-pGlu brazzein in transgenic mouse milk. FEBS Open Bio. 2022; 12 (7): 1336-43. DOI: https://doi.org/10.1002/2211-5463.13411 57.
40. Ota M., Kohmura M., Ariyoshit Y. Synthesis and characterization of the sweet protein brazzein. Biopolymers. 1996; 39 (1): 95-101. DOI: https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0282(199607)39:1<95::aid-bip10> 3.0.co;2-b 58.
41. Berlec A., Jevnikar Z., Majhenic A.C., Rogelj I., Strukelj B. Expression of the sweet-tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 2006; 73 (1): 158-65. DOI: https://doi. 59. org/10.1007/s00253-006-0438-y
42. Berlec A., Tompa G., Slapar N., Fonovic U.P., Rogelj I., Strukelj B. Optimization of fermentation conditions for the expression of sweet-tasting protein brazzein in Lactococcus lactis. Lett Appl Microbiol. 2008; 60. 46 (2): 227-31. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2007.02297.x
43. Jafarian V., Bagheri K., Zarei J., Karami S., Ghanavatian P. Improved expression of recombinant sweet-tasting brazzein using codon optimi-
zation and host change as new strategies. Food Biotechnol. 2020; 34 (1): 62-76. DOI: https://doi.org/10.1080/08905436.2019.1711113 Lamphear B.J., Barker D.K., Brooks C.A., Delaney D.E., Lane J.R., Beifuss K., et al. Expression of the sweet protein brazzein in maize for production of a new commercial sweetener. Plant Biotechnol J. 2005; 3 (1): 103-14. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2004.00105.x Lee Y.R., Akter S., Lee I.H., Jung Y.J., Park S.Y., Cho Y.-G., et al. Stable expression of brazzein protein, a new type of alternative sweetener in transgenic rice. J Plant Biotechnol. 2018; 45 (1): 63-70. DOI: https://doi.org/10.5010/JPB.2018.45.1.063
Jung Y.J., Kang K.K. Stable expression and characterization of brazzein, thaumatin and miraculin genes related to sweet protein in transgenic lettuce. J Plant Biotechnol. 2018; 45 (3): 257-65. DOI: https://doi. org/10.5010/JPB.2018.45.3.257
Choi H.E., Lee J.I., Jo S.Y., Chae Y.C., Lee J.H., Sun H.J., et al. Functional expression of the sweet-tasting protein brazzein in trans-genic tobacco. Food Sci Technol. 2022; 42: e40521. DOI: https://doi. org/10.1590/fst.40521
Han J.E., Lee H., Ho T.-T., Park S.-Y. Brazzein protein production in transgenic carrot cells using air-lift bioreactor culture. Plant Biotechnol Rep. 2022; 16 (2): 161-71. DOI: https://doi.org/10.1007/s11816-022-00743-3
Han J.-E., Park Y.-J., Lee H., Jeong Y.-J., Park S.-Y. Increased brazzein expression by abiotic stress and bioreactor culture system for the production of sweet protein, brazzein. Plant Biotechnol Rep. 2020; 14 (4): 459-66. DOI: https://doi.org/10.1007/s11816-020-00625-6 Yan S., Song H., Pang D., Zou Q., Li L., Yan Q., et al. Expression of plant sweet protein brazzein in the milk of transgenic mice. PLoS One. 2013; 8 (10): 1-8. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076769 Neiers F., Naumer C., Krohn M., Briand L. The recent development of a sweet-tasting brazzein and its potential industrial applications. In: J.M. Merillon, K. Ramawat (eds). Sweeteners. Reference Series in Phytochemistry. Cham: Springer, 2016: 1-20. DOI: https://doi. org/10.1007/978-3-319-26478-3_2-1 ISBN978-3-319-26478-3. Poirier N., Roudnitzky N., Brockhoff A., Belloir C., Maison M., Thomas-Danguin T., et al. Efficient production and characterization of the sweet-tasting brazzein secreted by the yeast Pichia pastoris. J Agric Food Chem. 2012; 60 (39): 9807-14. DOI: https://doi.org/10.1021/ jf301600m
Jo H.J., Noh J.S., Kong K.H. Efficient secretory expression of the sweet-tasting protein brazzein in the yeast Kluyveromyces lactis. Protein Expr Purif. 2013; 90 (2): 84-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j. pep.2013.05.001
Yun C.R., Kong J.N., Chung J.H., Kim M.C., Kong K.H. Improved secretory production of the sweet-tasting protein, brazzein, in Kluyveromyces lactis. J Agric Food Chem. 2016; 64 (32): 6312-6. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b02446
Kazemi-Nasab A., Shahpiri A. Expression of brazzein, a small sweet-tasting protein in Saccharomyces cerevisiae: an introduction for production of sweet yeasts. Protein Pept Lett. 2020; 27 (10): 945-52. DOI: https://doi.org/10.2174/0929866527666200331134431 Kazlovsky I.S., Bel'skaya I.V., Zinchenko A.I. Biosynthesis of brazzein using the bacterial cell-free protein synthesis system. Doklady natsional'noy akademii nauk Belarusi [Reports of the National Academy of Sciences of Belarus]. 2020; 64 (1): 71-7. DOI: https://doi. org/10.29235/1561-8323-2020-64-1-71-77 (in Russian) Assadi-Porter F.M., Patry S., Markley J.L. Efficient and rapid protein expression and purification of small high disulfide containing sweet protein brazzein in E. coli. Protein Expr Purif. 2008; 58 (2): 263-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pep.2007.11.009
Hung C.Y., Cheng L.H., Yeh C.M. Functional expression of recombinant sweet-tasting protein brazzein by Escherichia coli and Bacillus licheniformis. Food Biotechnol. 2019; 33 (3): 251-71. DOI: https://doi. org/10.1080/08905436.2019.1618323
Park S.W., Kang B.H., Lee H.M., Lee S.J., Kim H.S., Choi H.W., et al. Efficient brazzein production in yeast (Kluyveromyces lactis) using a chemically defined medium. Bioprocess Biosyst Eng. 2021; 44 (4): 913-25. DOI: https://doi.org/10.1007/s00449-020-02499-y Lee H.M., Park S.W., Lee S.J., Kong K.H. Optimized production and quantification of the tryptophan-deficient sweet-tasting protein brazzein in Kluyveromyces lactis. Prep Biochem Biotechnol. 2019; 49 (8): 790-9. DOI: https://doi.org/10.1080/10826068.2019.1621892
