CC BY
28УДК 579.864:615.282
DOI: 10.24412/1999-6780-2020-4-46-53
СКРИНИНГ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LAC TIS ДЛЯ СОЗДАНИЯ НЕТОКСИЧНЫХ АНТИМИКОТИКОВ
Стоянова J1.Г. (в.н.с.), Сорокина Е.В. (н.с.)*, Дбар С. Д. (аспирант)
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова (кафедра микробиологии), Москва, Россия
Из молока, молочных продуктов различных климатических регионов методом «реплик» были выделены штаммы Lactococcus 1actis subsp. 1actis с фунгицидной активностью, что является малоизвестным свойством для лактококов этого подвида. Сравнивали антимикоти-ческую активность природных штаммов, изолированных из молока и национального лечебно-профилактического напитка Курунга, с музейным низинобразующим штаммом МГУ и рекомбинантным штаммом, полученным слиянием протопластов. Определяли накопление молочной кислоты, способность к синтезу антимикробных метаболитов, обладающих фунгицидным действием. Установлено, что фунгщидная активность лактококков штам-моспецифична, степень ингибирования роста разных групп микромицетов не одинакова. Уровень активности 01{енивали по росту культур в жидкой ферментационной среде после обработки лактококков ацетон-уксусной смесью (в лизатах) и рассчитывали по подавлению роста 4-х тест-кулыпур микромицетов (грибы и дрожжи) с пересчетом на активность стандартных растворов препарата нистатина. Активность состоит из фунгицидно-го действия молочной кислоты и антимикробных метаболитов, локализованных в клетке. Методом бактериальной люминесценции на основе биотеста «Эколюм-06» установлена нетоксичность штаммов и их метаболитов.
Показана возможность создания антимикотиков на основе перспективных штаммов L. 1actis subsp. Iactis, эффективных против конкретных грибов, колонизирующих продукты питания, и Candida albicans на уровне биотопов в организме человека, что поможет в лечении ряда микозов.
Ключевые слова: Lactococcus 1actis subsp. ¡actis, молочная кислота, антимикотики, токсичность, нистатин
SCREENING FOR PROSPECTIVE STRAINS LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS FOR THE CREATION OF NON-TOXIC ANTIMITOTICS
* Контактное лицо: Сорокина Елена Владимировна, e-mail: evsorokina77@mail.ru
Stoyanova L.G. (leading scientific researcher), Sorokina E.V. (scientific researcher), Dbar S. D. (postgraduate student)
Lomonosov Moscow State University (Department of Microbiology), Moscow, Russia
Lactococcus lactis subsp. lactis strains with fungicidal activity were isolated from milk and daily products of various climatic regions by the method of "replicas", which is a little-known property for lactococci of this subspecies.
We compared the antimycotic activity of natural strains isolated from milk and the national therapeutic and prophylactic drink Kurunga, a museum low-forming strain of Moscow State University and a recombinant strain obtained by fusion of protoplasts. The accumulation of lactic acid and the ability to synthesize antimicrobial metabolites with a fungicidal effect were determined. Lt has been established that the fungicidal activity of lactococci is strain-specific, the degree of growth inhibition of different groups of micromycetes is not the same. The activity level was assessed by the growth of cultures in a liquid fermentation medium after treatment of lactococci with an acetone-vinegar mixture (in lysates) and calculated by suppressing the growth of 4 test cultures of micromycetes (fungi and yeast) based on the activity of standard solutions of nystatin. The activity consists of the fungicidal action of lactic acid and antimicrobial metabolites localized in the cell. The non-toxicity of strains and their metabolites was established by the method of bacterial luminescence based on the "Ecolum-06" biotest.
The possibility of creating antimycotics based on promising strains of L. lactis subsp. lactis, effective products against specific fungi that colonize food, and Candida albicans at the biotope level in the human body, which will help in the treatment of a number of mycoses.
Key words: Lactococcus lactis subsp. lactis, lactic acid, antimycotics, toxicity, nystatin
Порча продуктов питания микромицетами является основной причиной для беспокойства производителей продовольствия, поскольку представляет особую опасность для здоровья человека вследствие образования токсинов. Молочнокислое брожение стало известно людям на заре развития цивилизации как способ консервирования и создания продуктов лечебного назначения. Все виды кисломолочных продуктов являются в той или иной мере способом консервирования ценного пищевого сырья, такого как молоко, их издавна широко использовали не только как провиант, но и как лечебно-профилактические и лечебные средства при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, желудочно-кишечного тракта и т.д. [1]. Помимо этого, молочнокислые бактерии составляют основу симбионтной микробиоты желудочно-кишечного тракта и слизистых оболочек человека [2].
Применение молочнокислых бактерий (МКБ) в решении проблемы порчи продуктов питания и кор-
мов плесневыми грибами — перспективное направление исследований.
Молочнокислые бактерии L. 1actis subsp. 1actis -продуценты природного консерванта низина, известного под торговой маркой «Nisaplin» («Aplin & Barrett Ltd», Англия), а в последнее время - под торговой маркой «Krisin» («Christian Hancen», Дания), разрешенного для применения в продуктах как пищевая добавка Е-234 [3]. Препараты обеих компаний — это высушенные культуры, нормализованные солью и молочной сывороткой, содержащие 2,5% активного компонента (бактериоцина низина А) с активностью 1000 МЕ/мг (ME — международная единица). Однако низин, как и его продуцент, подавляют только грамположительные бактерии и неэффективны против грибов. По этой причине лактококки можно рассматривать как потенциальные продуценты различных антимикробных препаратов с более широким спектром действия, чем низин. В свете повышенной устойчивости патогенов к антибиотикам и химическим препаратам пробиотики могут служить как альтернативное антимикробное средство для предотвращения заражения патогенами [4]. В настоящее время особый интерес вызывают способы направленного синтеза антибиотических веществ лактококками с целью получения новых (с более ценными свойствами) для использования в качестве натуральных консервантов пищевых продуктов. В перспективе ряд мер, направленных на уменьшение применения консервантов химической природы и антибиотиков, и увеличение сроков годности приведут к появлению новых высококачественных пищевых продуктов с пониженным содержанием солей и консервантов, а также с пониженной кислотностью.
Основные трудности, связанные с созданием нетоксичных антимикотиков, вызваны в основном отсутствием методов скрининга, отдельных продуцентов, поскольку многие молочнокислые бактерии синтезируют несколько активных соединений, и, вероятно, между ними существует синергидный эффект.
Усовершенствование методологии выделения и идентификации противогрибковых соединений к настоящему моменту привели к увеличению количества публикаций, связанных с выделением новых штаммов, продуцирующих фунгицидные метаболиты. Однако эти работы большей частью проводят на Lactobacillus sp. [3], что свидетельствует о том, что обнаружение способности к синтезу фунгицидов у L. 1actis subsp. 1actis является редким и неизученным свойством.
Преимущество лактококков состоит в том, что этот подвид растет при 28 °С в стационарных условиях. Этот факультативный анаэроб с высокой скоростью роста является основной употребляемых
продуктов и адаптированной к желудочно-кишечному тракту бактерией.
Цель исследования — выделение и идентификация штамма Lactococcus lactis subsp. ¡actis, перспективного для создания нетоксичных антимикотиков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования — микробиота кисломолочных продуктов, изготовленных в Московском регионе и привезенных из Бурятии, экологически чистой зоны озера Байкал. В работе использовали сырое необработанное коровье молоко, полученное с молочных ферм Сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (ТСХА) Москвы и Бурятского района (Россия), а также бурятский национальный ле-чебно-профилактический молочнокислый продукт «Курунга». Пробирки с исследуемыми образцами продуктов вносили в стерильный обрат, оставляли для самоферментации при 28 °С в стационарных условиях на 17 часов. Затем бактерии из пробирок, в которых образовался плотный молочный сгусток, повторно пассировали в обрате и культивировали в течение 10-17 ч для дифференциации характерных гомоферментативных лактококков из микробиоты исследуемых продуктов. Учет количества лактоко-ков облегчается при добавлении в среду инкубирования 0,01%-ного раствора индикатора бромкрезо-лового пурпурного, поскольку при глубинном инкубировании кислотообразующие бактерии образуют зону обесцвечивания среды (из фиолетовой в желтую) вокруг колоний.
Морфологию колоний изучали по общепринятым методикам: с помощью микрокопирования и в световом микроскопе МБП (Россия) - 15 с фазово-контрастным конденсором КФ-4, а также в электронном сканирующем микроскопе («Сап Scan» фирмы «Greshman», UK). При микрокопировании в световом микроскопе МБП готовили фиксированные окрашенные препараты, в качестве красителя использовали спиртовой раствор метиленового синего.
Из сбреженного в обрате сгустка микробиологической петлей лактококки пересевали в агаровую среду, приготовленную на основе гидролизата молока с индикатором бромкрезоловым [5], переносили медом реплик на среду Сабуро, предварительно засеянную тест-культурами микромицетов.
В работе использовали штаммы лактококков разного происхождения, а именно: Lactococcus 1actis subsp. lactis штамм K-205 - мезофильный лактококк, выделенный из национального молочнокислого продукта «Курунга»; GenBank EF 114305; L. lactis subsp. lactis штамм 194, изолированный из коровьего молока (Бурятия); GenBank DQ 255954; L. lactis subsp. lactis штамм МГУ — низин-продуцирующий штамм, который по биологическим и физико-химическим свойствам идентичен продуценту коммерческого
препарата «Nisaplin» фирмы «Aplin & Barrett, Ltd» (Англия), содержащему в своем составе 2,5% чистого низина A; L. Iactis subsp. Iactis штамм 729 - природный штамм, выделенный из молока, произведенного в Московском регионе, низкоактивный по синтезу низина; GenBank EF 102814; L Iactis subsp. Iactis штамм F-116 — рекомбинантный штамм с высоким уровнем низин-синтезирующей активности, полученный путем слияния протопластов двух родственных низкоактивных штаммов 729 и его мутанта 1605, произведенного комбинированным воздействием УФ-лучей и нитрозоэтилмочевины; GenBank EF 100777 [6].
Вышеуказанные штаммы как наиболее перспективные по синтезу антимикробных метаболитов, идентифицированные по свойствам и гену 16S РНК как L. Iactis subsp. Lactis, были депонированы в GenBank.
Для получения обрата сырое молоко без консервантов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут, снимали жировой компонент и стерилизовали при 0,5 ати 15 мин. Далее проводили культивирование штаммов L. /actis subsp. /actis при 30 °С в термостате в течение 24 часов в стационарных условиях. Затем из образовавшегося плотного молочного сгустка отбирали стерильными пипетками его часть в пробирку с посевной средой, приготовленной на водопроводной воде с дрожжевым экстрактом (20 г/л) и глюкозой (10 г/л); pH среды доводили до 6,8-7,0 с помощью 20%-ного раствора NaOH и также проводили культивирование при 30 °С в термостате в течение 24 часов в стационарных условиях.
После этого инокулят (OD540 0,14-0,19) вносили в количестве 5 об. % в ферментационную (биосинтетическую) среду, содержащую (г/л): КН2Р04 - 20,0; глюкоза - 10,0; NaCl - 1,0; MgS04 - 0,2 и автолизат дрожжей - 10, pH - 6,8-7,0; инкубировали при 28 °С в течение 18-24 часов.
Физиологические и биохимические свойства штаммов, проявивших наиболее выраженную антимикробную активность, оценивали в соответствии с ферментацией углеводов, потребностью в факторах роста, уровнем антибиотической активности и диапазоном антимикробной активности. Культуральные свойства выделенных штаммов исследовали классическими микробиологическими и молекулярно-генетическими методами идентификации культуры [6].
Уровень фунгицидной активности устанавливали методом диффузии в агар с измерением зон подавления роста тест-культуры в мм. В качестве стандарта на микромицеты использовали растворы 100, 50, 40 ед/мл коммерческого препарата нистатин (Ni-statine фирмы Sigma) с активностью 4670 ед/мг.
Изучение динамики роста штаммов проводили в жидкой ферментационной среде в течение 24 ч с ин-
тервалом 3 ч. В каждой точке отбирали пробу, измеряли оптическую плотность на ФЭКе (Х=590, /=1,0 см) с последующим пересчетом на количество клеток в 1 мл, рН и уровень антимикотической активности. Индикаторными культурами служили три штамма микроскопических грибов: Aspergillus niger 369, Penicillium chrysogenum 32, Fusarium oxysporum 9 и штамм дрожжей - Candida albicans INA 00763. Тест-культуры получены из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Микромицеты выращивали на среде Сабуро в (г/л): глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар - 20,0; ле-вомицетин — 0,002. Экстракцию антимикотика из культуральной жидкости лактококов осуществляли смесью: «ацетон: уксусная кислота: вода СН3СОСН3: СН3СООН: Н20 в соотношении (4:1:5)» при 55 °С в течение 90 мин. Лизаты разводили фосфатным буфером (рН — 5,5) в соотношении 1:10 и вносили в лунки на агаровой среде с тест-организмом, затем культивировали в течение 24-48 часов. Экстракция позволяла учитывать экзо- и эндометаболиты. Количественное определение антибиотической активности выполняли по измерению зон подавления роста тест-культур с дальнейшим пересчетом по калибровочной кривой стандартных растворов антибиотиков. Величина зоны отсутствия роста указывала на степень активности данного антибиотика в отношении исследуемой тест-культуры и зависела от его концентрации и химической природы. Антимикоти-ческую активность измеряли как в культуральной жидкости лактококков, так и в лизатах после обработки клеточной стенки лактококков экстрагирующей смесью для извлечения всех метаболитов, образуемых в процессе молочнокислого брожения. Такой же обработке подвергали и стандартный препарат нистатин.
Определение количества молочной кислоты
выполняли в культуральной жидкости с параокси-дифенилом по Баркеру и Саммерсонух [7].
Принцип метода: из молочной кислоты в присутствии серной кислоты и солей меди образуется уксусный альдегид, который, реагируя с параокси-дифенилом, дает фиолетовую окраску.
Для этого определения лактококки выращивали в течение 17 ч в ферментационной среде вышеуказанного состава. Для расчета молочной кислоты в культуральной жидкости строили калибровочный график, использовали различные концентрации молочной кислоты: 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 мкг/мл. Определение проводили аналогично исследуемым пробам. На основании полученных данных строили калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию молочной кислоты, а на оси ординат — оптическую плотность. По нему устанавливали содержание молочной кислоты в исследуе-
мых образцах. Полученные экстракты колориметри-ровалн на ФЭКе при 31 670,1= 0,5 см против раствора сравнения, как описано ранее [8].
Токсичность штаммов и синтезируемых анти-микотиков выявляли методом бактериальной люминесценции. При оценке токсичности штаммов в каждую контрольную и опытную кюветы типа Эппен-дорфа объемом 1,5 мл наливали 0,1 мл суспензии биосенсора. В контрольную кювету добавляли 0,9 мл дистиллированной воды, в опытную кювету — 0,9 мл водного экстракта молочнокислых бактерий, используя в пробе биосенсор 7,6-107 клеток на мл генно-инженерный штамм Escherichia coli К12 TGI с созданным светящимся фенотипом, обеспеченным встроенным lux-опероном морских светящихся бактерий Photobacterium leiognathi 54D10. Полученный штамм хранится на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и известен как биосенсор тест-системы «Эколюм-06». Интенсивность свечения (имп/сек) биотеста контрольного и опытного образцов регистрировали одновременно через 5, 15 и 30 минут с помощью лю-минометра при температуре 25 °С. Индекс токсичности (Т) образцов устанавливали по программе лю-минометра по формуле: Т= 100• (Ik—I)/ 1к, где 1к — интенсивность свечения контроля, I — интенсивность свечения опыта. Оценку токсичности исследуемых образцов классифицировали по трем группам значений индекса токсичности: Т <20 — образец нетоксичен; Т> 20, но <50 - образец токсичен; Т> 50 - образец очень токсичен [9]. При наблюдении стимуляции свечения тест-организма, т.е. значение Т с отрицательным знаком, образец был нетоксичен. Анализировали не менее 3 проб одного образца, рассчитывая индекс токсичности.
Статистическую обработку всех результатов проводили с помощью программы Excel Microsoft Office, данные представляли, как среднее ± стандартная ошибка среднего; статистическую значимость различий определяли по общепринятой методике с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверность различий соответствовала р <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Один из первых и важных этапов в поиске и выборе перспективного для использования в пищевой промышленности и медицине штамма — определение его таксономической принадлежности, так как правильная идентификация на видовом уровне позволяет исследователю заранее иметь понятие о безопасности, происхождении, среде обитания и физиологических характеристиках выделенного микроорганизма.
Курунга представляет собой жидкий пенящийся продукт молочно-белого цвета с мелкими хлопьями казеина, с кисловатым запахом и вкусом. Его полу-
чают путем сбраживания коровьего молока культурами молочнокислых бактерий и молочных дрожжей. В результате жизнедеятельности микроорганизмов происходит превращение молочного сахара в молочную кислоту, спирт и углекислый газ, что свидетельствует о том, что курунга является продуктом двух брожений - молочнокислого и спиртового. Микробный состав курунги, как правило, состоит из двух видов местной расы молочнокислых бактерий — вида Lactobacillus casei, а также молочнокислых стрептококков и бифидобактерий. Курунга не является механической смесью различных элементов микробиоты, она представляет собой типичное явление симбиоза: дрожжи для своего развития нуждаются в продуктах жизнедеятельности молочнокислых бактерий и в образуемой ими молочной кислоте, а молочнокислые бактерии в присутствии дрожжей лучше развиваются и дольше сохраняют свою активность. Эти симбиотические отношения в курунге сохраняются в течение долгого времени, без подавления ни одного из составных элементов микробной композиции другими. Состав молочнокислых бактерий ее микробиоты отличается большим разнообразием. В поле зрения электронного микроскопа (Рис. 1.) видны лактококки, лактобациллы, бифидобакте-рии и молочные дрожжи.
Рис. 1. Микробный состав курунги в электронном сканирующем микроскопе «Сап Scan» фирмы «Greshman», UK: увеличение 1x2500.
Для выделения из молочных продуктов мезо-фильных лактококков, обладающих фунгицидной активностью, применяли метод «реплик». Данные представлены на рисунке 2, где видны зоны подавления роста микромицетов по месту укола репликатора. В качестве индикаторной культуры использовали дрожжи Candida albicans INA 00763. Отбирали клоны с максимальной зоной ингибирования роста микромицетов.
Рис. 2. Выделение колоний с фунгицидной активностью методом «реплик» (тест-культура С. albicans).
Из курунги был выделен штамм К-205 /.. ¡actis subsp. 1actis с высоким уровнем фунгицидной активности (Рис. 3.).
Щ
Рис. 3. Штамм К-205 Lactococcus lactis subsp. ¡actis на твердой ферментационной среде.
По форме клеток молочнокислые бактерии представляют собой кокки сферической или эллипсовидной формы. Бактерии рода Lactococcus - круглые или слегка овальные клетки, расположенные единично, парами или цепочками. Типичного представителя этого рода - L. ¡actis subsp. /actis некоторые считают палочковидной формой, поскольку его клетки больше в длину, чем в ширину, а в сбрежен-ном молочном сгустке преобладают сочетания в виде диплококков (Рис. 4.).
Рис. 4. Вид 1а&ососси5 /асйз БиЬвр. \actis в поле зрения светового микроскопа (1х 100). Окраска по метиленовому синему. Увеличение (Х100).
При компьютерной обработке результатов се-квенирования генов 16S рРНК и сравнительном анализе полученных нами последовательностей изучаемых штаммов с последовательностями тех же генов вышеуказанных типовых штаммов между ними обнаружили большое сходство. Все штаммы проявляли высокую степень гомологии ДНК (на уровне 98,9-100%) по отношению к референтным штаммам L. Jactis subsp. ¡actis. Высокий уровень гомологии выявлен между штаммами, изолированными в Бурят и и (99,6%), а сходство их со штаммами, выделенными из молока московского региона, было меньше (98,9%).
Рост и развитие L. Iactis subsp. ¡actis в базовой ферментационной среде с глюкозой представлены в таблице 1.
Таблица 1
Изучение динамики роста штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis базовой ферментационной среде (Р< 0,05)
Этот процесс развития сопровождается снижением рН, что коррелирует с накоплением молочной кислоты как основного метаболита и увеличением фунгицидной активности после экспоненциальной фазы роста (табл. 2).
Молочная кислота как основной продукт сбраживания углеводов при развитии гомоферментатив-ных лактов является причиной снижения рН среды и вызывает ингибирование роста многих микроорганизмов, включая плесневые грибы и дрожжи, вследствие взаимодействия с клеточной мембраной клет-ки-мишени, нейтрализуя её электрохимический протонный градиент [10].
Таблица 2
Динамика изменения рН при культивировании штаммов 1ас(ососси5 1асШ эиЬвр. /ас^5 в базовой ферментационной
среде и накопление молочной кислоты (Р< 0,05)
Штамм/ часы 0 3 6 9 12 15 17 21 24 Молоч лоч-ная к-та
Шт. МГУ 6,8 6,8 5,0 4,8 4,3 4,2 4,2 4,2 4,1 8,867
F-116 7,0 6,8 5,0 5,0 4,2 4,2 4,1 4,2 4,2 8,089
К-205 7,0 6,8 5,0 5,0 4,15 4,15 4,15 4,2 4,2 9,956
194 7,0 6,8 4,8 4,3 4,1 4,1 4,15 4,15 4,1 14,467
729 7,0 6,0 4,5 4,2 4,2 4,2 4,1 4,1 4,1 16,489
В результате эксперимента по определению молочной кислоты выявили, что наибольшее количество молочной кислоты выделял L. ¡actis subsp. lactis
Штаммы Время культивирования, ч
0 | 3 | 6 | 9 12 15 18 | 21 | 24
Оптическая плотность (ОП540), нм
Шт.МГУ 0,45' 0,967 1,32 1,56 1,57 1,54 1,53 1,55 1,52
F-116 0,53i 0,939 1,702 1,759 1,601 1,653 1,716 1,604 1,787
К-205 0,43! 1,145 1,529 1,659 1,630 1,643 1,666 1,518 1,730
194 0,55/ 0,968 0,883 1,091 1,299 1,421 1,531 1,498 1,400
729 0,41! 1,245 1,729 1,769 1,630 1,623 1,606 1,518 1,730
штамм 729, и это подтверждает его свойство как сильного кислотообразователя.
Установлено, что за 24 ч инкубирования в среде с глюкозой он синтезировал до 0,82% молочной кислоты, в то время как другие штаммы накапливали 0,45-0,62% лактата при тех же условиях. Количество образуемой молочной кислоты штаммом 729 превышало в 0,8-1,8 раза по сравнению с количеством, синтезируемым низинобразующим штаммом МГУ и рекомбинантным штаммом, но значение было близко к уровню накопления кислоты штаммом 194.
Исследуемые штаммы молочнокислых бактерий оценили на их биотоксичность с помощью биотеста «Эколюм-06». Методики измерений интегральной токсичности лекарственный препаратов и новых химических соединений с помощью тест-системы «Эколюм -06» имеют свидетельство о метрологической аттестации (4/7-93), зарегистрированы в Департаменте Госсанэпиднадзора РФ (№№ 11-1/131-09, 11-1/132-09, 11-1/133-09, 11-1/134-09) и Госкомэкологии — сертификат Госстандарта России № 01.19.231/2001. Они внедрены на территории РФ в органах санитарно-эпидемиологического надзора и ориентированы на использование реактивов и оборудования отечественного производства [11].
Результаты оценки токсичности исследуемых штаммов представлены в таблице 3.
Таблица 3
Оценка интенсивности свечения и индекса токсичности за 30 мин исследования с биотестом «Эколюм-06»
Происходила стимуляция свечения клеток биотеста «Эколюм-06» относительно контроля, и, следовательно, токсичность была с отрицательным знаком, указывая на безопасность исследуемых штаммов.
По характеру стимуляции свечения биотеста с возрастанием времени биотестирования (5, 15, 30 мин) индекс токсичности практически не менялся [9]; наблюдали стимуляцию свечения бактериального биосенсора (табл. 2).
Стимуляция интенсивности люминесценции у светящихся бактерий при действии многих веществ в низких концентрациях отмечена ранее многими авторами. При этом в рекомендациях к анализам при биотестировании на основе бактериальной люминесценции предлагают делать вывод об отсутствии токсичности исследуемых образцов [12]. Однако при действии веществ, приводящем к значительному
стимулированию интенсивности свечения бактериального биотеста, стимуляция функционирования их люминесцентной системы может быть связана с конкуренцией дыхательной системы клеток биотеста за восстановленный флавин. Вследствие этого происходит подавление транспорта электронов в дыхательной цепи соответственно, поток электронов в этой цепи снижается, эквивалентно возрастая в цепи люминесцентной системы. В результате интенсивность биолюминесценции повышается, а регистрируемый в этот момент Т приобретает отрицательное значение. Следует отметить известное понятие гор-мезиса, когда различные вещества в малой концентрации, действуя на некоторые функции организма, вызывают их стимуляцию [11].
Изучая спектр фунгицидной активности установили, что штамм МГУ как музейный низин-продуцирующий не имел фунгицидной активности, что подтверждает отсутствие ингибирующего действия низина на грибы.
Отобранные другие штаммы F-116, К-205, 729 и 194 обладали фунгицидной активностью на микро-мицеты при культивировании в базовой среде штаммов и были активны против всех четырех тест-культур. Однако наибольшую активность лактокок-ки проявляли против С. albicans, хотя отличались по степени воздействия (рассчитана по зоне ингибиро-вания роста индикаторной культуры в пересчете по калибровочной кривой по нистатину). Так, активность штамма 194 составила 36,21 ед/мл; штамма F-116 - 29,75 ед/мл; К-205 - 28,71 ед/мл и штамма 729 - 16,14 ед/мл (Рис. 5).
53.00
Тест-культуры:
Pénicillium chrysogenum ш Aspergillus niger я Candida albicans ■ Fusarium oxysporum
Рис. 5. Фунгицидная активность штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis к микромицетам.
Особый интерес представлял штамм 194, выделенный из свежего коровьего молока из Бурятии, который, как описано ранее [13], ингибировал рост грамположительных и грамотрицательных бактерий за счет образования антибиотического комплекса,
МО / штам- Интенсивность свечения Индекс токсичности
мы биотеста «Эколюм-06» к 30 мин
Контроль 1067 0
729 1377 -29
1605 1291 -21
F-116 1344 -26
194 1152 -8
К-205 1206 -13
состоящего из 2-х бактериоцииов (низина А и пептида, не содержащего лантионин, гидрофобной природы).
Наименее активным на P. chrysogenum был штамм К-205, выделенный из курунги, с активностью 171,20 ед/мл, однако штамм К-205 был активным на A. niger (518,01 ед/мл). На дрожжи Candida высокий уровень фунгицидной активности был выявлен у штамма 194.
По результатам исследования наибольшей фунгицидной активностью обладал штамм 194 при культивировании в жидкой ферментационной среде (Рис. 6.).
Рис. 6. Фунгицидная активность суспензии штаммов Lacto-coccus Iactis ssp. ¡actis в ферментационной среде после 20 часов культивирования. Тест-организм Candida albicans, контроль - нистатин.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Из молока, молочных продуктов и продуктов функционального питания различных климатических регионов методом «реплик» были выделены новые нетоксичные штаммы лактококков с малоизвестным
свойством к синтезу метаболитов с фунгицидной активностью. Показана возможность создания анти-микотиков на основе перспективных штаммов L. 1actis subsp. Iactis, эффективных против микромицетов, колонизирующих продукты питания, и кандидозов, обусловленных Candida albicans, на уровне биотопов в организме человека, что поможет в лечении ряда заболеваний, вызванных грибами. Порча пищевых продуктов под действием плесневых грибов является широко распространенным и глобальным явлением, и поиск эффективных способов ее предотвращения составляет проблему для многих исследовательских лабораторий. Потенциальное производство токсинов грибами представляет особую опасность для здоровья. Как упоминалось выше, Lactococcus spp., продуцирующие бактериоцины, обычно подавляют только грам-положительные бактерии и не эффективны против грибов. В данном исследовании показано, что некоторые штаммы лактококков обладают способностью продуцировать антимикотические вещества, которые были определены как альдегиды или кетоны [7, 14]. Таким образом, новые штаммы Lactococcus 1actis subsp. /actis со статусом GRAS, обладающие фунги-цидным действием, являются большим достижением в поиске новых эффективных и безопасных пищевых антимикотиков. Биотестирование на основе бактериальной люминесценции расширило возможности мониторинга объектов, позволило показать отсутствие токсичности изученных штаммов и их метаболитов. Следовательно, штаммы могут быть рекомендованы для применения в пищевой промышленности и в медицине, и тщательно продуманный выбор перспективных штаммов L. Iactis subsp. /actis поможет в дальнейшем в создании новых природных антимикотиков, безопасных для здоровья.
ЛИТЕРАТУРА
1. De Almada С., Martinez R. Characterization of the intestinal microbiota and its interaction with probiotics and health impacts. Appl Microbiol. Biotechnol. Published online: 21 April .2015. doi.org/10.1007/s00253-015-6582-5
2. Олескин A.B., Шендерое Б.А. Пробиотики, психобиотики и метабиотики: проблемы и перспективы. Физическая и реабилитационная медицина, медицинская реабилитация. 2020; 2: 18-28. [Oleskin A.V., Shenderov В.A. Probiotics, psychobiotics and metabiotics: problems and prospects. Physical and rehabilitation medicine, medical rehabilitation. 2020; 2: 18-28 (In Russ)]. DOI: 10.36425/rehab25811
3. Стоянова Л.Г., Устюгова E.A., Нетрусов А.И. Антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий: разнообразие и свойства (обзор). Прикл. Биохим. Микробиол. 2012; 48 (3): 259-275. [Stoyanova L.G., Ustyugova Е.А., Netrusov A.I. Antimicrobial metabolites of lactic acid bacteria: diversity and properties (review). Prikl. Biochem. Microbiol. 2012; 48 (3): 259-275 (In Russ)].
4. Svanstrom A., Boveri S., Bostrom E., et al. The lactic acid bacteria metabolite phenyllactic acid inhibits both radial growth and sporulation of filamentous fungi. BMC Research Notes, 2013; 6: 464-473. doi.org/10.1186/1756-0500-6-464
5. Quinto E.J., Jimenez P., Саго I., et al. Probiotic lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 2014; 5:1765-1775. doi.org/10.4236/fns.2014.518190
6. Стоянова JI.Г. Выделение и идентификация молочнокислых бактерий Lactococcus lactis subsp lactis с антимикробным действием. Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии 2017; 5: 41-617. [Stoyanova L.G. Isolation and identification of lactic acid bacteria Lactococcus lactis subsp lactis with antimicrobial action. Proceedings of the Timiryazev agricultural Academy 2017; 5: 41-617 (In Russ)].
7. Stoyanova L.G., Napalkova М. V., Netrusov A.I. The creating a new biopreservative based on fusant strain Lactococcus lactis ssp. Lactis F-l 16 for food quality and its safety. Journal of Hygienic Engineering and Design. 2016;16: 19-27.
8. Stoyanova L.G., Sul'timova T.D., Botina S.G., et al. Isolation and identification of new nisin-producing Lactococcus lactis subsp lactis from milk. Applied Biochemistry and Microbiology. 2006; 42: 492-499. doi.org/10.1134/S0003683806050085
9. Zarubina A.P., Gapochka M.G., Novoselova L.A., et al. Effect of low intensity electromagnetic radiation on the toxicity of domestic wastewater tested with the ecolum test system. Moscow University Biological Sciences Bulletin. 2013; 68: 49-52. doi: 10.3103/S0096392512030108
10. Patrick O. Lactic acid bacteria in health and disease. Rwanda J. of Health Sciens (review). 2012; 1: 39-50.
11. Сорокина E.B. Биотестирование с использованием бактериального люминесцентного теста: достоинства и усовершенствования метода. Успехи современной биологии, 2017; 137 (6): 613-620. [Sorokina E.V. Biotesting using bacterial luminescence test: advantages and improvements of the method. Advances in modern biology, 2017; 137 (6): 613-620 (In Russ)].
12. Zarubina A.P., Perfiliev Yu.D., Sorokina E. V., et. al. Evaluation of the properties of potassium ferrate used for water purification by luminescence bioassay. Moscow University biological sciences bulletin. Allerton Press (New York, N.Y. United States). 2016; 71 (4): 226-230. doi: 10.3103/S0096392516040131.
13. Gerez C. L., Torres M. J., Font de Valdez G., et al. Control of spoilage fungi by lactic acid bacteria. Biol Control. 2013; 64: 231-237. doi.org/10.1016/j.biocontrol.2012.10.009
14. Устюгова E.A., Федорова Г.Б., Стоянова Л.Г. и др. Изучение антибиотического комплекса, образуемого Lactococcus lactis ssp. lactis 194 - К. Микробиол. 2011; 80 (5): 644-650. [Ustyugova Е.А., Fedorova G.B., Stoyanova L.G., et al. Study of the antibiotic complex formed by Lactococcus lactis ssp. lactis 194-K. Microbiol. 2011; 80 (5): 644-650 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала 10.12.2020 Рецензент: Е.И. Ермоленко
