CC BY
17СКРИНИНГ АНТАГОНИСТИЧЕСКОМ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ПРОТИВ ERWINIA AMYLOVORA 1Саданов А.К., 2Кулдыбаев Н., 3Исмаилова Э., 4Шемшура О., 5Молжигитова А., 6Турлыбаева З., 7Елубаева А., 8Баймаханова Г.Б., 9Баймаханова Б.Б.
i,2,3,4,5,6,7,8,9jqq «нПЦ микробиологии и вирусологии», ул. Богембай батыра 105, 050010, г.
Алматы, Республика Казахстан. https://doi.org/10.5281/zenodo.8353509
Аннотация. В статье представлены результаты скрининга коллекции молочнокислых бактерий на базе ТОО «НПЦ микробиологии и вирусологии» против возбудителя бактериального ожога. Было установлено, что из 21 штаммов лактобацилл в отношении возбудителя Erwinia amylovora А22, большинство из штаммов обладали различной степенью ингибирования роста. Зоны подавления роста патогена находились в пределах от 25,0±2,51мм до 41,5±1,5 мм. Наибольшая ингибирующая активность была отмечена у бактерии Lacticaseibacillus paracasei М12 (41,5±1,5 мм), несколько ниже у штаммов L. paracasei 33-4 (39,6 ± 6,65 мм) и L. plantarum 17М (35,6±0,57мм). Штамм бактерии, обладающий максимальной ингибирующей активностью L. paracasei М12 может рассматриваться в качестве потенциального кандидата на разработку нового биопестицида против бактериального ожога.
Ключевые слова: бактериальный ожог, молочнокислые бактерии, антагонизм, Lacticaseibacillus paracasei М12
Abstract. The paper presents the results of screening the collection of lactic acid bacteria based on the Scientific and Production Center for Microbiology and Virology LLP against the causal agent of bacterial burn. It was found that out of 21 strains of lactobacilli concerning the pathogen Erwinia amylovora A22, most of the strains had varying degrees of growth inhibition. The zones of pathogen growth suppression ranged from 25.0±2.51 mm to 41.5±1.5 mm. The highest inhibitory activity was noted in the bacterium Lacticaseibacillus paracasei M12 (41.5 ± 1.5 mm), slightly lower in strains L. paracasei 33-4 (39.6 ± 6.65 mm) and L. plantarum 17M (35.6 ±0.57mm). The bacterial strain with the maximum inhibitory activity of L. paracasei M12 can be considered a potential candidate for the development of a new biopesticide against fire blight.
Keywords: fire blight, lactic acid bacteria, antagonism, Lacticaseibacillus paracasei М12
Введение
Бактериальный ожог, вызываемый грамотрицательными бактериями Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al., является одним из наиболее вредоносных бактериальных заболеваний яблоневых (Malus х domestica Borkh.) и других представителей семечковых культур. Применение на протяжении последних десятилетий различных химических и других антибиотик содержащих препаратов не привели к заметному сдерживанию этого заболевания [1].
Альтернативным подходом в снижении популяции патогена является применение биопрепаратов на основе микробов-антагонистов. Актуальность данного перспективного направления биотехнологии, подкреплена отсутствием резистентности у патогена и экологической безвредностью таких биопрепаратов, на фоне возрастающего интереса к органическому земледелию во всем мире [2]. Казахстан в данном случае не исключение, и научные исследования в этом направлении активно проводятся [3].
Одним из методов защиты плодовых культур является применение биопрепаратов на основе молочнокислых бактерий [4]. Согласно литературным источникам и проведенных ранее исследований установлено, что молочнокислые бактерии (МКБ) могут быть также использованы, как ингибиторы возбудителя бактериального ожога E. amylovora [5; 6]. Тем самым, молочнокислые бактерии (МКБ) являются потенциальными кандидатами в качестве основы для создания биопестицидов. Это отмечали Rosello и другие (2017) в своём исследовании, где штаммы бактерии L. plantarum TC92 и PM411 подтверждали активность против бактериального ожога [7].
Как известно, подавляющее большинство молочнокислых бактерий имеют GRAS статус, то есть признаны безопасными для человека и животных [8]. К настоящему времени в литературе описано множество штаммов молочнокислых бактерий, обладающих антагонистическими свойствами в отношении различных микроорганизмов, в том числе фитопатогенных [9, 10, 11]. Тем не менее, научные источники о разработке препаратов на основе молочнокислых бактерий против бактериального ожога плодовых ограничены, что инициирует проведение исследований в этом направлении.
Таким образом, целью наших исследований было провести скрининг и отобрать из коллекции» молочнокислых бактерий ТОО «НПЦ микробиологии и вирусологии», штамм с максимальной ингибирующей активностью против возбудителя бактериального ожога.
Материалы и Методы
Объектами исследований были различные штаммы молочнокислых бактерий: Lactobacillus paracasei (2 шт.), Lactobacillus fermentum (3 шт.), Lactobacillus plantarum (5 шт.), Lactobacillus salivaris (1 шт.), Lactobacillus parabuchneri (1 шт.), Lactobacillus bulgaricus (1 шт.), Lactobacillus delbruecrii (1 шт.), Lactobacillus cellobiosus (4 шт.), Lactobacillus brevis (1шт.), Lacticaseibacillusparacasei (1 шт.), Lactobacillus gallinarum (1шт). В качестве тест культуры выступили бактерии E. amylovora А22 выделенные из пораженных плодов яблони сорта Golden Delishes (Панфиловский район, Алматинская область) в 2022 году [12]. Штамм патогена хранился под 15% глицерином при температуре -10°С.
Бактерии рода Lactobacillus культивировали на жидкой среде MRS следующего состава: пептон - 10 г, мясной пептон -10 г, К2НРО4ЗН2О - 2 г, Na лимоннокислый - 2 г, глюкоза - 20 г., твин 80 - 1 мл, MgSO47H2O - 0,6 г; MnSO47H2O - 0,3г; вода дистиллированная - 1 л; pH 6.2 - 6.5, автоклавировать при 0.5 атм. в течение 20-30 мин. Засеянные затем в колбочки (объемом 100 мл) различные штаммы лактобацилл были поставлены на орбитальный шейкер, при температуре 37°С.
Антагонистическую активность различных штаммов рода Lactobacillus по отношению к E. amylovora А22 определяли методом диффузии в агар [13]. В качестве питательной среды для тест-культуры, использовали сахарозно-пептонный агар (СПА). Стерилизовали автоклавированием при температуре +121°C в течение 15 минут. Посев чистой культуры бактерий в объёме 0,1мм суспензии наносили после взбалтывания на центрифуге пипеткой на питательную среду и равномерно распределяли с помощью стеклянного шпателя. Для размещения культурального бульона штаммов молочнокислых бактерий, в застывшие среды с поверхностно нанесенной культурой, стерильным пробоотборником диаметром 10 мм изымались пробки. В сформированные лунки глубиной около 5 мм, вносили культуры молочнокислых бактерий, выращенные заранее на жидкой
среде MRS (DeMan-Rogosa-Sharpe), на 1 мм ниже уровня среды (по 200 мкл в лунку). Компоненты среды растворяли в воде, доводили pH 6.2-6.5, автоклавировали при 0.5 атм. в течение 20-30 мин. Культуры выращивали в колбах объемом 100 мл по 50 мл среды на качалке (200 об/мин) при 28-30°С в течение 48 ч. В качестве контроля служила просто питательная среда, засеянная тест культурой. Приготовленные чашки Петри с образцами и контрольные чашки Петри помещали в термостат (температура + 37°C). Образцы выдерживали в термостате 1 -5 суток, отмечая интенсивность роста бактерий на чашках, замеряя зоны угнетения их роста. Уровень антагонистической активности штаммов молочнокислых бактерий определяли по размерам зон задержки роста тест-культур фитопатогенных бактерий и антагониста на 2-3 сутки.
Результаты исследований
Для проведения скрининга на антагонистическую активность против возбудителя бактериального ожога нами были проанализированы 21 штамм молочнокислых бактерий из коллекции производственного центра, выделенные из различных источников: кисломолочных продуктов, кишечника здорового человека и филлосферы садовых ценозов (таблица 1). Тест культурой был возбудитель бактериального ожога E. amylovora А22
Рисунок 1 - Пораженные органы яблони, с которых была выделена тест культура -Е. ату1оуога Е22
Рисунок 2 - Колонии возбудителя - E. amylovora А22 на питательной среде СПА.
Из рисунка 2 видно, что колонии возбудителя - E. amylovora E22 на питательной среде СПА образует мелкие блестящие колонии светло-серого цвета. Результаты экспериментов по изучению способности молочнокислых бактерий подавлять рост возбудителя E. amylovora А22 приведены в таблице 1.
Таблица 1- Результаты оценки антагонистической активности различных штаммов молочнокислых бактерий против возбудителя бактериального ожога
№ Название культуры Источник выделения Дата поступлени я штамма в коллекцию Наличие зоны подавления , мм на 5 сутки
1 Lactobacillus paracasei 4m-2b Из кумыса 17.05 2019 25,0±2,51
2 Lactobacillus paracasei 33-4 Из кисломолочного напитка домашнего производства 14.10.2020 39,66±6,65
3 Lactobacillus fermentum 30 Из кисломолочного напитка домашнего производства 24.11.2014 31,0±1,0
4 Lactobacillus fermentum 29/7 Из популяции сублимационно высушенной культуры L. fermentum 29 26.07.2014 30,0±0
5 Lactobacillus fermentum A15 Из кумыса 08.04.2019 0
6 Lactobacillus salivaris 8d/AK-5 Из популяции сублимационно высушенной культуры 29.09.2014 33,66±1,15
7 Lactobacillus gallinarum 1 Из кисломолочного напитка домашнего производства 12.09.2017 31,0±1,0
8 Lactobacillus parabuchneri 3 Из кисломолочного напитка домашнего производства 28.012020 27,33±1,15
9 Lactobacillus delbruecrii 5 Из кисломолочного напитка домашнего производства 17.09.2018 35,66±0,57
10 Lactobacillus bulgaricus Из кисломолочного напитка домашнего производства 01,08.2015 26,66±1,15
11 Lactobacillus plantarum 2в/2 Из кишечника здорового человека 29.09.2014 33,33±0,57
12 Lactobacillus plantarum 14d/A-17 Из кишечника здорового человека 29.09.2014 34,66±4,16
13 Lactobacillus plantarum 48 После 3-х кратной адаптации штамма L. plantarum 48 в кислой среде и щелочи 26.11.2014 30,0±0
14 Lactobacillus plantarum 34 Из популяции сублимационно 26.11.2014 33,33±3,05
высушенной культуры L. Plantarum 34
15 Lactobacillus cellobiosus 34/16 Из популяции сублимационно высушенной культуры L. cellobiosus 34 27.07.2014 0
16 Lactobacillus cellobiosus 35/23 Из популяции сублимационно высушенной культуры L. cellobiosus 35/23 26.07.2014 29,66±0,57
17 Lactobacillus cellobiosus 35/1 Из популяции сублимационно высушенной культуры L. cellobiosus 35/1 26.11..2014 30,0±1,0
18 Lactobacillus cellobiosus 36 Из популяции сублимационно высушенной культуры L. Cellobiosus 36 26.11.2014 34,0±3,6
19 Lactobacillus brevis Б3/75 Из популяции сублимационно высушенной культуры L. brevis Б3 29.09.2014 32,33±0,57
20 Lactobacillus plantarum 17М Из филлосферы садового ценоза 06.05.2019 35,6±0,57
21 Lacticaseibacillus paracasei М12 Из филлосферы садового ценоза 05.11.2022 41,5 ±1,15
Из данных приведенных в таблице 1 видно, что почти все штаммы обладали различной степенью ингибирования развития патогена E. amylovora А22, за исключением Lactobacillus cellobiosus 34/16 и Lactobacillus fermentum A15. Зоны подавления роста патогена у проанализированных лактобацилл была в пределах от 25,0 ± 2,51мм до 41,5± 1,5 мм. Судя по размерам зон задержки роста тест-культур высокоактивными были 3 штамма. Это Lacticaseibacillus paracasei М12, Lactobacillus plantarum 17М и Lactobacillus paracasei 33-4. Наибольшая антагонистическая активность была у штамма L. paracasei М12 -41,5± 1,15 мм, который был выделен из филлосферы садового ценоза Алматинской области в 2023 году. Незначительно уступает активность у штамма L. paracasei 33-4 (39,6 ± 6,65), выделенный из кисломолочного напитка домашнего производства, находящийся в коллекции с 2020 года [14]. Несколько ниже ингибирующая активность отмечена у штамма L. plantarum 17М (35,6±0,57), выделенный с яблони в 2019 году (Карасайский район, Алматинская область). В тоже время, на контрольной чашке, на всей поверхности среды наблюдался активный рост культуры возбудителя заболевания, без признаков подавления. Это указывает на то, что экстракт штамма L. paracasei М12 обладает ингибирующим действием на возбудителя бактериального ожога плодовых культур (Рисунок 3).
а) L. paracasei М12 б) L. paracasei 33-4 в) L. plantarum 17 М г) контроль
Рисунок 3 - Штаммы молочнокислых бактерий, с максимальной ингибирующей активностью против возбудителя бактериального ожога
В ходе проведенных исследований, из 21 штаммов молочнокислых бактерий были отобраны следующие 3 штамма: L. paracasei М12, Lactobacillus plantarum 17М и Lactobacillus paracasei 33-4. Тем не менее, ведущим штаммом для наработки опытного образца биопрепарата нами был взят L. paracasei М12, т.к. он обладал наиболее ярко выраженной антагонистической активностью, и тем самым, представлял наибольший интерес для дальнейшей работы.
Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о возможности использования штамма молочнокислой бактерии L. paracasei М12 в качестве активного ингредиента микробных биопестицидов для борьбы с бактериальным ожогом. В дальнейшем, конечным результатом наших исследований будет создание нового отечественного биопрепарата, внедрение в сельское хозяйство которого усилит борьбу с бактериальным ожогом плодовых культур.
REFERENCES
1. Vanneste, Joel L. "What is fire blight? Who is Erwinia amylovora? How to control it?" Fire blight: the disease and its causative agent, Erwinia amylovora. Wallingford UK: CABI, 2000. 1-6. https://doi.org/10.1079/9780851992945.0001
2. Морджера Э., Буллон К., Грасия К., Дюран М. Органическое сельское хозяйство и право// ФАО Продовольственная и сельскохозяйственная организация объединенных наций, Рим, 2016. -224 с. ISBN 978-92-5-407220-9 © ФАО.
3. Shemshura, Olga, et al. "Antagonistic activity and mechanism of a novel Bacillus amyloliquefaciens MB40 strain against fire blight." Journal of Plant Pathology 102.3 (2020): 825-833. https://doi.org/10.1007/s42161 -020-00515-4
4. Rosello, G., et al. "Biological control of fire blight of apple and pear with antagonistic Lactobacillus plantarum." European Journal of Plant Pathology 137 (2013): 621-633. https://doi.org/10.1007/s10658-013-0275-7
5. Ismailova E., Sadanov А, Alimzhanova M., Shemshura O., Molzhigitova A., Kebekbaeva K., Zanarbekova А. Lactobacillus biocontrol strains active against fire blight in Kazakhstan. 2nd International Symposium on Fire Blight of Rosaceous Plants.- Michigan (USA), 2019.-P.70.
6. Саданов А.К., Исмаилова Э.Т., Искандарова К.А., Шемшура О.Н., Сейтбатталова А.И., Молжигитова А.Е. Оценка антагонистической активности коллекционных штаммов молочнокислых бактерий против возбудителя бактериального ожога плодовых культур // Микробиология жэне вирусология, 2018.-№3.-С.50-57. chrome-еxtension://efaidnbmnnnibpcajpc.glclefindmkaj/https://imv kaz.kz/f/mzhv 22 2018 3.pdf
7. Rosello, G., et al. "Control of fire blight of pear trees with mixed inocula of two Lactobacillus plantarum strains and lactic acid." Journal of Plant Pathology (2017): 111-120. DOI: 10.4454/jpp.v99i0.3920
8. Organic Farming: Organic Plant Protection icimod.org https://www.icimod.org > eff.
9. Sharifazizi, Mohamad, Behrouz Harighi, and Amin Sadeghi. "Evaluation of biological control of Erwinia amylovora, causal agent of fire blight disease of pear by antagonistic bacteria." Biological control 104 (2017): 28-34. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2016.10.007
10. Wright, Sandra AI, et al. "Pantoea agglomerans strain EH318 produces two antibiotics that inhibit Erwinia amylovora in vitro." Applied and environmental microbiology 67.1 (2001): 284-292. https://doi.org/10.1128/AEM.67.1.284-292.2001
11. Daranas, Nuria, et al. "Biological control of bacterial plant diseases with Lactobacillus plantarum strains selected for their broad-spectrum activity." Annals of Applied Biology 174.1 (2019): 92-105. https://doi.org/10.1111/aab.12476
12. Дзержинская И.С. Методы выделения, исследования и определения антибиотической активности микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами. -Астрахань: Изд-во АГТУ, 2005. - 76 с.
13. Иркитова, Алена Николаевна, Яков Рувимович Каган, и Галина Геннадьевна Соколова. "Сравнительный анализ методов определения антагонистической активности молочнокислых бактерий." Известия Алтайского государственного университета 3-1 (2012): 41-44. ISSN: 1561-9443 eISSN: 1561-9451.
14. Aitzhanova, Aida, et al. "Dairy associations for the targeted control of opportunistic Candida." World Journal of Microbiology and Biotechnology 37 (2021): 1-18. https://doi.org/10.1007/s11274-021-03096-1.
